專利名稱：惡性瘧原蟲的肝期和血液期抗原lsa－5、包括該抗原的免疫原性復合物和抗瘧疾疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗瘧疾。更具體地，本發(fā)明基于對新的惡性瘧原蟲抗原(下文中稱為LSA-5)的表征，該抗原在子孢子期、肝期和血液期(sporozoite-，liver-and blood-stage)表達。該抗原具有高度的抗原性，并且生活在疫區(qū)的個體體內的抗體發(fā)生率是極高的(大約90％)。下文所述的結果顯示a)LSA-5可以使得大量的被免疫的靈長類動物獲得完全的消除性(sterilizing)的保護，所述保護可抵抗大劑量的源自這種對人類具有致死性寄生蟲的致病性子孢子期寄生蟲的攻擊性感染；和b)暴露于自然感染所誘導的抗體與抗瘧疾有著非常強的相關性。因此，本發(fā)明涉及新的多肽分子，并涉及它們作為抗瘧疾疫苗的有效成分以及在疾病的診斷方法中的用途。本發(fā)明也涉及識別LSA-5的抗體以及它們在抗瘧疾的治療或診斷中的用途。
引起人類瘧疾的寄生蟲在人類宿主中表現(xiàn)出了不同的形態(tài)學，并根據(jù)其在體內的定位而表達不同的抗原。根據(jù)這些寄生蟲在人體體內的不同生活周期中的形態(tài)學及抗原性的差異可以確定這些寄生蟲在肝臟以及在血液中的不同的發(fā)育期子孢子是載體蚊子注射到體內的感染形式，其在宿主肝細胞內快速地轉化成了裂殖體，并在此之后感染紅細胞。惡性瘧原蟲在肝內的定位本身顯示出其表達了一組特異于該發(fā)育期的抗原，它在暴露于疾病的自然條件下具有高度免疫原性。
通過以經照射子孢子進行免疫接種可以在試驗宿主以及在人類中都獲得抗瘧疾紅細胞前期(pre-erythrocytic stages)的完全的消除性保護作用。這說明長期以來被認為是“抗子孢子免疫”的免疫事實上涉及肝期滋養(yǎng)體的發(fā)育，其應當被稱作“肝期依賴性免疫”(Druilhe et al，1998)。
本發(fā)明者已經開發(fā)出了一種鑒定惡性瘧原蟲肝期抗原的方法，其基于用人類的期限制性血清(源自暴露于子孢子接種25年以上，但是因為持續(xù)的氯喹預防而沒有發(fā)育成血液形式的個體)篩選基因組表達文庫(克隆T9-96的文庫)。這些克隆被指定為29個基因，所有的基因都具有編碼能夠被暴露的個體所識別的抗原這一特征(Druilhe et al，1998，(Charlotte Gruner，Snounou et al.2003)。對該克隆家族的最初篩選包括a)在各種物種的生活周期的不同期中的表達模式；和b)對基因在子孢子期的惡性瘧原蟲野生分離株中的保守性的研究。因此，用每種克隆的產物制備出親和純化的抗體，并將其用于研究與a)子孢子期的、b)肝期的、和c)血液期的惡性瘧原蟲、約氏瘧原蟲、伯格式瘧原蟲的反應性，有時是與間日瘧原蟲的反應性。通過用相同的抗體研究一系列子孢子期的野生Thai分離株表面上的抗原的表達來評價其保守性的程度。還研究了所選克隆的抗原性、免疫原性和保護功效。這已經導致鑒定出了在WO92/13884中所述的LSA-1(肝期抗原)、在EP A-0,407,230中所述的SALSA(子孢子肝期抗原)多肽、STARP(Fidock，Bottius et al.1994)、以及在WO96/41877中所述的LSA-3。
如在下面試驗的實施例中所述的，LSA-5在各種分離株中是最具有抗原性和免疫原性的，并具有很好的保守性，并且與LSA-3一起突出地作為非常少的能誘導抗惡性瘧原蟲攻擊的保護作用的分子之一。此外，保護的替代品(surrogate)顯然與LSA-5、LSA-3以及經照射的子孢子所誘導的免疫相似，這說明所有的三種分子都可以誘導相似的防御機制。
因此，本發(fā)明的第一個目的是一種抗原性肽或多肽，其包括至少一種選自由下面表1中所述的SEQ ID No1到14組成的組的基序(序列)，其中所述肽或多肽被抗LSA-5特異性抗體所識別。包括至少一種基序SEQ ID No1到14之一的變體的抗原性肽或多肽也屬于本發(fā)明的內容，條件是它們仍被抗LSA-5特異性抗體所識別，并且所述變體與原始基序不同之處在于它的一或數(shù)個氨基酸殘基被其他基序的相應的一或數(shù)個氨基酸殘基取代。
但是考慮到WO 86/00620，由稱作SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的序列組成的肽不屬于本發(fā)明的范圍。但根據(jù)本發(fā)明，這些肽可以包含在混合物或混合表位中并進行應用。
表1DG571克隆的氨基酸序列(SEQ ID NO16)的比對，顯示LSA-5具有富含E、I、V的基序。
包括本發(fā)明的肽(基序)SEQ ID NO1到14及其變體的具體一組序列因此包括肽序列SEQ ID NO1、肽序列SEQ ID NO6、以及下面的不同于SEQ ID NO1和6的肽序列與SEQ ID NO1具有以下不同之處的變體-第2位上的氨基酸是K、Q或V；和/或
-第3位上的氨基酸是I、L、V、F或E；和/或-第4位上的氨基酸是V或R；和/或-第5位上的氨基酸是K；和/或-第6位上的氨基酸是Q或K；和/或-第7位上的氨基酸是I；和/或-第8位上的氨基酸是P、V或A；和/或-第9位上的氨基酸是Q、A或L；與SEQ ID NO6具有以下不同之處的變體-第1位上的氨基酸是K；和/或-第2位上的氨基酸是Q或K；和/或-第3位上的氨基酸是I；和/或-第4位上的氨基酸是P、V或A；和/或-第5位上的氨基酸是Q、Y、A或L。
在至少2種、特別是至少4種選自上面表1中的肽的肽混合物中可以含有這具體一組的序列。
本發(fā)明的一個具體的實施方式是包括至少一種如上所定義的基序SEQ ID NO1的變體的抗原性肽或多肽，其被抗LSA-5特異性抗體識別，它特別地被用于制備上面所定義的肽混合物。
本發(fā)明的肽、多肽或脂肽優(yōu)選地包括9到150個氨基酸，特別是包括12到30個或40個氨基酸，特別是18到36個氨基酸。
本發(fā)明也涉及肽混合物，所述混合物是由2種或2種以上、特別是3種以上具有由選自包括表1所述的SEQ ID NO1到14的組的序列組成的氨基酸序列的肽混合形成。
在一個具體的實施方式中，所述肽混合物包括至少4種和最多14種不同的選自所述組的肽或由至少4種和最多14種不同的選自所述組的肽組成。
在所述肽混合物的另一個實施方式中，選自上面所述組的肽與下文中所述的共有(consensus)LSA-5肽相關聯(lián)。
在一個優(yōu)選的實施方式中，制備肽混合物，使得當混合物被施用給患者時，它具有免疫原性。因此，為了在大規(guī)模患者中的應用，所述混合物優(yōu)選地是在寄生蟲的LSA-5抗原之間所觀察到的趨異性的代表。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，用2種或2種以上、特別是3或4種以上肽(例如3到14種不同的選自由表1所述的SEQ ID No1到14組成的組的肽)的組合所生成的重組多肽組成肽混合物，還可以往其中加入具有不同序列的肽或多肽，例如下文所述的共有LSA-5肽。
本發(fā)明的肽或多肽可以通過化學合成獲得，或者可以是重組表達的產物。
本發(fā)明也涉及具有下面序列的共有LSA-5肽EEVVEELIEEVIPEELVL(SEQ ID NO15)，它可以與脂質分子結合形成脂肽。這種共有脂肽的實例是(EEVVEELIEEVIPEELVL(Plm)-CONH2)，其中Plm是C末端的palmitoylysylamide殘基。
本發(fā)明的另一個方面是SEQ ID No16(序列DG571)的LSA-5抗原本身，和任一如下所述的抗原性肽或多肽，所述肽或多肽包括LSA-5或它的通過添加、缺失、或保守取代一或數(shù)個氨基酸而源自LSA-5的變體，條件是所述肽或多肽被抗LSA-5特異性抗體識別。
這種變體例如是具有與對應于SEQ ID No16的LSA-5抗原的序列有著60％以上、特別是62％以上或65％以上或甚至70％以上相同性或相似性(即保守取代)的多肽，當用最佳的總體序列比對方法比對，并用已知的方法例如用BLSAT的可用版本(例如NCBI提供的可用版本)比較所述序列時，可以確定出所述相同性或相似性。
通過利用表達載體的細胞內的生物合成方法，或者通過化學合成方法例如遵循R.B Merrifield在1963年所述的固相肽合成(SPPS)方法(J.Am.Chem.Soc.85，2149)、或它的后來的衍生方法例如Fmoc或t-Boc之一的方法，都可以獲得本發(fā)明的肽或多肽。例如通過利用Deprez等所述的技術(Deprez，Gras-Masse et al.1995)可以進行脂質分子與本發(fā)明的任一肽或多肽的任意添加。
下面是確定肽或多肽是否是本發(fā)明意義內的“被抗LSA-5特異性抗體識別”的測試如在下面的材料和方法中所述的獲得人抗LSA-5特異性抗體，然后通過測試所述肽或多肽與所獲得的人抗LSA-5特異性抗體結合的能力進行所述肽或多肽和SEQ ID No16的LSA-5抗原之間的競爭性測試。或者，在存在測試肽或多肽時，在用SEQ ID No16的LSA-5抗原免疫接種的動物體內誘導出的或通過進行直接ELISA或Western印跡、或包含來自經LSA-5抗原免疫接種的動物的淋巴細胞的細胞測試所免疫純化的抗LSA5抗體可以進行結合測試。在下面實施例9中描述了更詳細的測試肽或多肽是否是“被抗LSA-5特異性抗體識別”的方案。
本發(fā)明的其他目的是融合蛋白，其包括一個抗原性部分，其是如上所述的抗LSA-5特異性抗體識別的肽或多肽，以及第二部分，其是與LSA-5抗原異源的部分?！芭cLSA-5異源”在此的意思是該第二部分的序列并非源自LSA-5。具體地，任一與序列SEQ ID No16具有40％以下或30％以下相同性的序列都被認為是與LSA-5異源。下面描述了這些融合蛋白的實例，例如βgal-DG571、谷胱甘肽-S-轉移酶-LSA5、以及與6-組氨酸尾的融合蛋白，其中LSA-5位于N末端。當然，任何其他的包括LSA-5部分的融合蛋白也都屬于本發(fā)明的內容，要明白“LSA-5部分”指的是LSA-5抗原本身以及上述的任一源自LSA-5的抗原性肽或多肽，條件是它被抗LSA-5特異性抗體識別。
本發(fā)明也涉及LSA-5混合表位?！盎旌媳砦弧笔怯锚毺睾铣煞椒ǐ@得的肽的匯聚(convergent)組合文庫，該合成方法是通過同時往已經獲得的肽片段內添加數(shù)個不同的氨基酸而不是一個氨基酸，據(jù)此造成了所獲得肽的可控多樣性(Gras-Masse，Ameisen et al.1992)。具體地，本發(fā)明的LSA-5混合表位包括多種具有如下序列的合成肽X1-E-X2-X2-P-E-E-L-X3-E-X4-V-I-X5-E-X6-X7-X2(SEQ ID No17)，
其中X1＝E、K、或無；X2＝V或I；X3＝I、V或R；X4＝E或K；X5＝P或A；X6＝E、V或K；X7＝L或I。
本發(fā)明的混合表位優(yōu)選地是至少50個、至少100個、或至少500個具有對應于SEQ ID No17的不同序列的肽的混合物。當實現(xiàn)所有可能的組合時，混合表位最多包括1152種不同的肽。
通過制備表1中的序列1到14的混合表位可以獲得相似的肽的組合文庫或混合表位，其中用混合表位技術復制了每種可能組合，包括那些表1所沒有羅列的，但是根據(jù)表1所示的氨基酸取代是可能的組合。
本發(fā)明也涉及脂混合表位，它是如上所定義的混合表位，其中至少一部分合成肽與脂質分子連接。該脂質分子例如可以是棕櫚酸、或任一具有11到25個碳原子的脂鏈。
在本發(fā)明的一個具體的方面，抗原性肽、脂肽、多肽、脂多肽、肽混合物、混合表位或脂混合表位結合于支持物。本發(fā)明因此也涉及通過本發(fā)明的肽與生理學可接受的及無毒的(天然的或合成的)載體分子共價結合所獲得的綴合物，具體地，這使得能通過載體分子和肽分別攜帶的互補反應基團增加免疫原性。天然蛋白例如破傷風毒素、卵清蛋白、血清白蛋白、血藍蛋白、結核菌素PPD(純化蛋白衍生物)等等和病毒顆粒例如B型肝炎病毒顆粒都可以用作參與組成本發(fā)明的綴合物的大分子載體分子或支持物的可能實例。
這些綴合物的優(yōu)選形式是生成直徑為1納米到500納米的不可溶性微粒形式，因為抗原呈遞細胞(特別是樹突狀細胞)優(yōu)選地攝取這些不可溶性微粒，并將抗原引入到(channel)淋巴細胞的抗原呈遞途徑中。實施例5描述了通過LSA-5抗原與硝酸纖維素顆粒或聚苯乙烯顆粒連接所獲得的顆粒劑型的實用價值。
生物可降解聚合物例如脂磷酸聚糖(LPG)或聚L-乳酸可以被優(yōu)選地用作本發(fā)明的綴合物中的支持物。
也可以使用合成的大分子聚合物，例如聚賴氨酸或聚(DL-丙氨酸)-聚(-賴氨酸)。
碳氫化合物或脂質支持物(例如飽和或非飽和脂肪酸，以及優(yōu)選地是油酸型或棕櫚酸型的C16或C18的酸)也可以與本發(fā)明的抗原性肽或多肽結合。由源自LSA-5的多肽經賴氨酸橋與飽和或非飽和脂質殘基共價連接而組成的綴合物因此也屬于本發(fā)明的內容，更特異地當脂質殘基是棕櫚?；?palmitoyl)或棕櫚基(palmityl)或油脂?；?。
最后，在不受限的情況下，本發(fā)明的抗原或肽可以結合于傳統(tǒng)支持物或吸附到這些支持物之上，所述支持物具體地是硝酸纖維素、橡膠或聚苯乙烯微球或珠，或整合于Tyl顆粒。
為了合成本發(fā)明的綴合物，方法可以是本領域已知的方法，例如Frantz和Robertson在Infect.And Immunity，33，193-198(1981)中所述的方法，或P.E.Kauffman在Applied and Environmental Microbiology(October1981)，vol.42，No.4，611-614中所述的方法，它們都使用肽和合適載體分子。
本發(fā)明也涉及免疫原性組合物，包括作為免疫原的肽、肽混合物、多肽(特別是重組多肽)、脂肽、脂多肽、混合表位、脂混合表位或如上所定義的綴合物。為了語言的簡單化，用語“肽或多肽”也表示并應用于下文中的脂肽、脂多肽、肽混合物、多肽(包括重組多肽)、混合表位和脂混合表位，可以是與支持物結合的或非結合的。
如實施例5和6所示，LSA-5的免疫接種可以誘導抗約氏瘧原蟲攻擊(在實施例5的小鼠中)以及抗惡性瘧原蟲攻擊(在實施例6的Aotus猴中)的保護。這證實了LSA-5是極好的用于制備抗紅細胞前期瘧原蟲的亞單位疫苗的候選物。本發(fā)明因此也涉及上述定義的免疫原性肽或多肽用于制備抗瘧疾的疫苗組合物的用途。包括作為免疫原的如上定義的肽或多肽的抗瘧疾疫苗也屬于本發(fā)明的內容。
如實施例8所述，LSA-5與另一種抗原(特別是LSA-3)的聯(lián)合導致了LSA-5的免疫原性的增加。因此，本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗還可以包括如Daubersies等(2000)所述的LSA-3抗原、或其LSA-3特異性抗體所識別的變體?？梢耘cLSA-5聯(lián)合使用的LSA-3變體的定義對應于在WO96/41877的權利要求1中所定義的多肽分子。在這些LSA-3/LSA-5聯(lián)合中，兩種抗原可以共價連接(例如在融合蛋白中)、或無共價連接，如實施例8所述。
本發(fā)明也預期其他的包括LSA-5的抗原聯(lián)合情況。具體地，除了LSA-5之外，本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗還可以包括一種或多種選自包括LSA-1、LSA-3、SALSA、STARP、TRAP、PfEXP1、CS、MSP-3、P126-CERP-SERA和GLURP的抗原組的其他抗原。
在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，皮下、皮內或肌肉內注射免疫原性組合物或疫苗制劑。當皮下注射制劑時，本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗優(yōu)選地每個注射劑量包括1到100μg的抗原性肽，更優(yōu)選地每個劑量包括2到50μg的抗原性肽。
當然，可以往本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗中加入有用的佐劑例如明礬和/或Montanide。在EP1 201 250 A1中描述了可以用于本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗的其他的可能佐劑，例如SB62、SB26、和SBAS2(AsO2)，后者是特別優(yōu)選的。
如實施例11所示，疫苗的優(yōu)選形式，特別是包括佐劑組合的疫苗形式是誘導出能與血液單核細胞協(xié)同實現(xiàn)殺死血液期寄生蟲的抗體的疫苗形式，并且所述抗體具體地是屬于嗜細胞類型的抗體(主要是IgG1和IgG3)，它們的Fc片段可以與血液白細胞上的Fcγ受體結合。這些抗體可以是單核細胞依賴性抗體，并且可以通過設計用于評價抗體在存在單核細胞時抑制惡性瘧原蟲的體外生長能力的抗體依賴性細胞抑制(ADCI)機制檢測抗體發(fā)揮作用的能力。在Bouharoun-Tayoun H.et al，1995；Bouharoun-Tayoun H.et al 1990；和Theisen M.et al，2000中具體地闡述了ADCI步驟。相信這些抗體也能介導惡性瘧原蟲的體內生長抑制，例如在受惡性瘧原蟲感染的小鼠中可以檢測到這一點。
如下面的實施例4所述，抗LSA-5抗體的被動轉移至少可以抑制寄生蟲侵入到肝細胞內。本發(fā)明的另一個重要方面因此是識別SEQ ID No16的LSA-5抗原的純化的多克隆血清或單克隆抗體，以及它們在藥物組合物中的用途，所述藥物組合物通過被動免疫治療保護具有或可能具有疾病癥狀的個體。
如在下面的材料和方法中所述的，通過對感染患者血清的親和純化或通過任一本領域技術人員已知的其他方法，例如通過用天然的或重組的LSA-5或用本發(fā)明的肽、肽混合物、脂肽、多肽、混合表位或脂混合表位單獨或結合載體分子(可存在佐劑)免疫哺乳動物都可以生產多克隆抗體。在普通教科書例如“Handbook of Experimental Immunology”，5thedition，D.M.Weir，L.A.Herzenberg，C.C.Blackwell and L.A.Herzenberg，eds.Blackwell Scientific Publications，Ltd.，Edimburgh，1997中描述了用于獲得這些多克隆血清的方案。
根據(jù)標準步驟，用雜交瘤技術可以生產單克隆抗體，步驟包括-將骨髓瘤細胞與先前經本發(fā)明的其中一種抗原免疫的動物的脾細胞融合；-培養(yǎng)通過前述細胞的融合所形成的雜交瘤，和-選擇那些能形成識別用于免疫接種動物的抗原的單克隆抗體的雜交瘤。
選定用于免疫接種的動物可以是例如小鼠。
在這些單克隆抗體中，將優(yōu)先選擇嗜細胞性的單克隆抗體，即那些Fc片段能與人類單核細胞上的Fcγ受體結合的抗體。這些抗體具體地是IgG1或IgG3型抗體。
用于抗體生產的另一種方法能夠在體外形成人單克隆抗體。為此，可以使用經例如Epstein Barr病毒永生化的B淋巴細胞。這些淋巴細胞可以取自受惡性瘧原蟲感染的患者。在這種情況中，這使得不依賴于新抗原的體外刺激來生產抗數(shù)個抗原的單克隆抗體成為可能。
另一種可能性包括融合上述永生化B淋巴細胞和預先用本發(fā)明的抗原體外刺激的人B細胞，在容許刺激淋巴細胞的培養(yǎng)條件下，形成了抗本發(fā)明抗原的單克隆抗體。
將優(yōu)選地引用Desgranges C等(1987，J.of Virological Methods，vol.16，p281-292)所述的用于制備本發(fā)明的人單克隆抗體的技術。
利用WO 03/016354(Nielsen Leif Kofoed等)所述的方法也可以獲得人重組抗體。
預期通過遺傳重組生產人單克隆抗體也在本發(fā)明的范圍之內，所述遺傳重組是通過將編碼抗體的可變部分的基因在體外轉染到載體內，并在容許人免疫球蛋白表達的條件下感染細菌。
最后，本發(fā)明涉及任一類型的單克隆抗體，如嵌合體的或雜合體的單克隆抗體，或甚至是多克隆或單克隆抗體的Fab或Fab’2型的任一片段，或甚至是抗體的可變鏈的更小片段，它們都表現(xiàn)出相同的針對SEQ ID No16的LSA-5抗原性多肽的表位的親和特征。
本發(fā)明優(yōu)選的單克隆抗體是人IgG1或IgG3型抗體、或者是在動物中獲得的并在人體內具有嗜細胞特性的、針對一種或多種具有上述序列的抗原的抗體。
用于瘧疾的被動免疫治療或預防的包括上述抗體的藥物也屬于本發(fā)明的內容。事實上，LSA-5存在于子孢子的表面，因此抗LSA-5抗體可以抑制子孢子穿透到肝細胞內。
本藥物還可以包括針對(即識別)至少一種選自LSA-1、LSA-3、LSA-5、SALSA、STARP、TRAP、PfEXP1、CS、MSP-3、P126-CERP-SERA和GLURP中的其他抗原的抗體。根據(jù)與上面所述的用于生產抗LSA-5抗體的方法相同的方法可以生成這些抗體。
本發(fā)明者也已經顯示抗LSA-5抗體可以用于制備用于預防或治療血液期瘧原蟲(特別是惡性瘧原蟲感染)的藥物。
此外，本發(fā)明者已經顯示抗LSA-5可以用于制備用于治療腦型瘧疾患者的藥物。
在這種情況中，可以聯(lián)合或者更普遍地在治療中與小分子抗瘧藥例如奎寧、青篙素和/或甲氟喹一起使用抗LSA-5抗體。
也提供了一種用于減輕瘧疾患者體內的寄生蟲血癥、或用于預防或治療表現(xiàn)出瘧疾癥狀或可能被瘧疾感染的個體體內的惡性瘧原蟲的方法。該方法包括給所述個體施用如上所述的包括抗LSA-5抗體的藥物。
本發(fā)明也涉及一種對可能被惡性瘧原蟲感染的個體進行體外瘧疾診斷的方法，其包括將取自所述個體的生物學樣品與本發(fā)明的抗原性肽、肽混合物、或多肽或混合表位接觸，所述接觸在能夠形成所述抗原性肽或多肽與可能存在于生物學樣品中的抗體之間的抗原/抗體復合物的條件下進行，以及在體外檢測可能形成的抗原/抗體復合物?？梢杂糜谶M行這種方法的生物學樣品的實例是紅細胞、白細胞、血清或尿液。所述的能夠形成抗原/抗體復合物的條件對于本領域技術人員是已知的，例如在“Handbook of Experimental Immunology”(見上)中可以找到所述條件。
在上面的方法中，通過ELISA檢測法可以進行體外診斷，例如使用在“Handbook of Experimental Immunology”(見上)中所述的條件。
本發(fā)明也涉及一種用于監(jiān)測患者的抗惡性瘧原蟲感染的疫苗接種的方法，從生物學樣品例如血液開始，特點是它包括-將可能含有抗惡性瘧原蟲的保護性抗體的生物學樣品與本發(fā)明的至少一種抗原接觸；-檢測抗原-抗體反應。
為了實施這些體外檢測方法，優(yōu)選地用放射性標記物、酶或熒光標記或甚至物理類型的標記物標記本發(fā)明的抗原。
在上面所述的診斷和監(jiān)測方法中，生物學樣品還可以與一種或數(shù)種源自其他前紅細胞抗原和/或子孢子期抗原的抗原性肽接觸，例如與源自選自LSA-1、LSA-3、LSA-5、SALSA、STARP、TRAP、PfEXP1、CS、MSP-3、P126-CERP-SERA和GLURP中的抗原的肽接觸。
本發(fā)明也涉及對是否存在針對本發(fā)明抗原的抗體進行體外檢測的試劑盒(例如用于體外診斷瘧疾、或用于監(jiān)測抗瘧疾的疫苗接種)，特征是它們含有至少一種本發(fā)明的肽、特別是它們的混合物、或多肽，需要時，所述肽結合于支持物。該試劑盒優(yōu)選地包括-包括至少一種本發(fā)明的抗原的抗原組合物，以及任選地-實施上面提及的抗原和可能存在于生物學樣品中的抗體之間的免疫學反應所需的試劑；和/或-使得對免疫學反應所生成的抗原-抗體復合物的檢測成為可能的試劑。這些試劑例如是被標記試劑標記的或是能被標記試劑識別的試劑。當用熒光團標記抗原或抗體時，這些試劑可以是例如底物和/或發(fā)色團。
在“Handbook of Experimental Immunology”(見上)中描述了本發(fā)明的試劑盒可以包含的試劑的實例。
下面是本發(fā)明的試劑盒的特殊實例-用于檢測抗LSA-5抗體的ELISA試劑盒，包括經本發(fā)明的LSA-5衍生抗原預先包被的板(或任一固相支持物)。對于該試劑盒，通過與ELISA板上的抗原的接觸、之后的洗滌以及用針對其中所述抗體所來源的動物物種的第二抗體(例如抗人IgG的第二抗體)顯像來檢測在不同體液(例如血液或血清)中所具有的抗體，所述第二抗體被酶例如過氧化物酶或堿性磷酸酶、或熒光分子例如熒光素、藻紅蛋白等標記，它們通過有色的、酶的或熒光的方法，或通過任一其他方法使得顯像對第一抗體的固定。
-一種用于檢測LSA-5抗原的ELISA試劑盒，包括經特異于所述抗原的抗體預先包被的板(或任一固相支持物)。在捕獲試驗中，該試劑盒能夠從生物液體例如血液、血清、尿液等中分離出LSA-5抗原，并通過特異于LSA-5并用上面段落中所述的任一方法所標記的第二抗體顯像該捕獲。
-一種免疫捕獲ELISA試劑盒，其使得能檢測特異于LSA-5抗原的抗體，其中用特異于來自其中進行抗LSA-5抗體檢測的動物物種中的免疫球蛋白的抗體預先包被板(或任一其他的固相支持物)。利用該試劑盒，在板上孵育來自所述動物物種的血清，然后根據(jù)上面所述的內容，用標記的LSA-5衍生肽進行對已經被保留于板上的抗體的顯像。
-預期免疫染色試劑盒或試紙也屬于本發(fā)明的內容。這種“快速試劑盒”包括一種或數(shù)種能與抗原結合的單克隆抗體，或能與抗LSA-5抗體結合的抗原。
-一種包括用于FACS(熒光激活細胞分選)分析的塑料珠的試劑盒，其中根據(jù)所需檢測的元件，用LSA-5抗原或用抗LSA-5抗體預先包被所述珠。
-抗體或抗原微陣列，即經處理的用于在與上述的關于ELISA試劑盒的條件相似的條件下固定極少量抗體或抗原的塑料或玻璃表面。
本發(fā)明的試劑盒也優(yōu)選地包括關于其特殊用途的指導。
本發(fā)明的另一種對可能感染惡性瘧原蟲的個體進行體外瘧疾診斷的方法，包括將取自所述個體的生物學樣品與上面所述的抗LSA-5抗體接觸，所述接觸是在能夠形成所述抗體與可能存在于生物學樣品中的特異于惡性瘧原蟲的抗原之間的抗原/抗體復合物的條件下進行，并在體外檢測可能形成的抗原/抗體復合物?？梢杂糜谠摲椒ǖ纳飳W樣品例如包括血液、紅細胞、白細胞、血清、和尿液。
一種用于體外瘧疾診斷的包括抗LSA-5抗體的試劑盒也屬于本發(fā)明的內容。該試劑盒還可以包括能使得所述抗體和可能存在于生物學樣品中的LSA-5抗原之間形成抗原/抗體復合物的試劑、和能夠對可能形成的抗原/抗體復合物進行體外檢測的試劑。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，通過皮內注射包括如上所述的抗原性肽或多肽的免疫原性組合物也可以在體內進行瘧疾的診斷。包括適量的本發(fā)明的免疫原性組合物的即用型注射器或設備也屬于本發(fā)明的內容。
本發(fā)明另一個方面是編碼如上所述的抗原性肽或多肽的分離的核苷酸序列，以及包括啟動子序列和編碼所述抗原性肽或多肽的序列的重組核苷酸序列。
本發(fā)明的一個特殊序列包括編碼多肽SEQ ID No19(即LSA-5抗原的變體)的序列SEQ ID No18。
包括如上所述的核苷酸序列的重組克隆載體和/或表達載體也屬于本發(fā)明的內容。在該在宿主細胞內表達的載體中，核苷酸序列優(yōu)選地是在啟動子以及相對于宿主細胞為同源的或異源的調節(jié)序列的調控之下。
本發(fā)明的載體可以用于制備抗惡性瘧原蟲的基因免疫的藥物。因此，本發(fā)明也涉及包括如上所述的核苷酸序列的DNA疫苗。例如，可以用例如在(Kang，Calvo et al.1998)以及在(Valenzuela，Belkaid et al.2001)中所提及的VR 1020載體(VICAL)獲得進行直接DNA免疫的構建體。
經本發(fā)明的載體所轉化的重組宿主細胞也屬于本發(fā)明的內容。該細胞可以是例如細菌、酵母、昆蟲細胞、或哺乳動物細胞。
本發(fā)明也涉及通過施用如上所述的免疫原性組合物、肽疫苗、或表達載體或DNA疫苗來免疫可能被惡性瘧原蟲感染的個體的方法。本領域技術人員能根據(jù)所用組合物的類型來決定最佳的施用方式。例如，可以經皮下注射施用肽疫苗，以及可以用基因槍施用DNA疫苗。例如，可以與合適佐劑一起經皮下或肌肉內注射施用肽疫苗，以及可以經皮內、皮下或肌肉內注射、用針頭、用基因槍或用粉末噴射施用有或沒有增強序列(例如CPG)的DNA疫苗。
在下面的實施例中，通過附圖和對本發(fā)明分子的特殊性質的闡述，本發(fā)明的其他特點將變得顯而易見。


圖1DG571(SEQ ID No16)及衍生肽的肽序列。
圖2對紅細胞前期惡性瘧原蟲和約氏瘧原蟲的間接免疫熒光。用人親和純化的單特異性抗LSA5.71抗體對(A)未固定的NF54子孢子的免疫熒光和(B)惡性瘧原蟲的肝裂殖體的免疫熒光。(C、D)經相同抗體標記的對約氏瘧原蟲的17XNL子孢子和肝裂殖體的IFAT。
圖3惡性瘧原蟲NF54子孢子的免疫電鏡。利用金標記的第二抗體(15nm)，經人親和純化的抗LSA-5.71抗體(λgt11的β半乳糖苷酶重組體)標記的惡性瘧原蟲子孢子的免疫電鏡照片。
圖4金標記的抗人抗體(10nm顆粒)所顯示的經人親和純化的抗LSA5.71抗體(β-gal重組體)標記的成熟惡性瘧原蟲肝裂殖體(第6天)的免疫電極照片。在新出現(xiàn)的具有清晰可見的棒狀體(R)和核(N)的紅細胞外接合體周圍的絮片狀(flocular)物質中可見LSA-5。從β-gal純化得到的對照抗體的結果為陰性。
圖5不同疫區(qū)的抗LSA5抗體的發(fā)生率。
圖6抗LSA-5抗體對約氏瘧原蟲和伯格氏瘧原蟲子孢子的體外侵襲的作用。在重組LSA-5-C-端或重組LSA-5-N-端上親和純化來自人超免疫血清的人抗體，并測試其對約氏瘧原蟲或伯格氏瘧原蟲對小鼠肝細胞的原代培養(yǎng)物的體外侵襲的作用。相似地，測試分別作為約氏瘧原蟲的陽性或陰性對照的LSA-3或SALSA蛋白的純化抗體。伯格氏瘧原蟲的單克隆抗體CSP被用作為伯格氏瘧原蟲的陽性對照。從在無抗體的檢測中所獲得的肝裂殖體的數(shù)目中推導出抑制百分數(shù)。
圖7在子孢子攻擊之后，與LSA3比較，LSA5在小鼠中所誘導出的保護。用2到50μg吸附于微粒上的重組LSA-5或LSA-3(DG729)或SALSA免疫小鼠3次。靜脈注射1000個約氏瘧原蟲子孢子(17XNL)攻擊小鼠。在攻擊后4到14天，隨診血液期寄生蟲血癥。
圖8受1百萬個約氏瘧原蟲子孢子攻擊的LSA-5免疫小鼠體內的肝期負荷的減少。在42h之后，從感染小鼠中取出肝臟，將活檢標本固定在Carnoy，并用石蠟包埋。從經蘇木精染色的5μg肝臟切片中確定出肝裂殖體的數(shù)目。在每個活檢標本的100個切片中計數(shù)肝臟形式。
圖9肝臟中的原位細胞事件。通過靜脈內接種100萬個約氏瘧原蟲子孢子來攻擊LSA-5免疫小鼠。(A)在對照小鼠中觀察到了健康的裂殖體；(B、C)在經吸附于硝酸纖維素顆粒上的β-gal-LSA-5.71接種的C57BL6的肝臟中，有2個受單核細胞浸潤的肝裂殖體。(D)在相同動物中可以看到細胞肉芽腫，其中沒有殘余的裂殖體。
圖10在用106個惡性瘧原蟲子孢子攻擊之后，經PfLSA-5免疫的Aotus的保護性。
圖11IFN-γAotus/替代品(surnageant)。
圖12ELISPOT Aotus。
圖13LSA3和LSA5在經相同混合物中的每種蛋白或兩種蛋白免疫的小鼠中的免疫原性。用3×50μg或2×1μg重組體LSA-3DG729或LSA-5.71或LSA-3-DG729+LSA-5.71的混合物聯(lián)合佐劑ASO2免疫C3H小鼠。在末次免疫接種3周之后，用ELISA測定針對每種重組體的抗體應答。結果表示為每組5只小鼠的抗體比值(+/-SD)的平均值比上未免疫的C3H小鼠的血清。
圖14編碼LSA-5蛋白(SEQ ID No18)的核苷酸序列。
圖15經微粒上的LSA-5免疫的BALB/c小鼠脾細胞的ELISPOT/IFN-γ。
圖16經微粒上的LSA-5免疫的C3H/Hej小鼠脾細胞的ELISPOT/IFN-γ。
實施例利用下文中所述的材料和方法進行下面的實施例材料和方法子孢子和肝期形式在來自如Ponnodurai(Ponnudurai，Lensen et al.1989)所述的NF54培養(yǎng)物的配子母細胞或在來自32例泰國患者(即來自野生亞洲分離株)的配子母細胞(Galey，Druilhe et al.1990)上進行蚊子的薄膜喂養(yǎng)之后，從受感染的岡比亞按蚊或大劣按蚊中獲得惡性瘧原蟲的子孢子。
分別在給蚊子喂養(yǎng)感染小鼠的血液14天和18天之后，從受感染的斯氏按蚊中提取出約氏瘧原蟲(17XNL株，17XNL克隆1.1和265BY)和伯格氏瘧原蟲(Anka株)的子孢子。
無菌制備子孢子，如所述的(Druilhe，Pradier et al.1986)用0.01％戊二醛快速固定子孢子，并將其儲存在4℃直到進行IFAT。
從經106個非洲患者分離株730XI(Druilhe，Puebla et al.1984)子孢子感染5天后的卷尾猴(懸猴)或從經NF54株(Meis，Ponudurai et al.1990)子孢子感染6天后的猩猩(Pantroglytes)的肝臟活檢標本中獲得惡性瘧原蟲的肝裂殖體。
從在經1×106個17XNL克隆1.1子孢子感染42h后的C3H/HeJ小鼠的肝臟活檢組織中獲得約氏瘧原蟲肝裂殖體。
人抗LSA-5特異性抗體通過對來自7份已經去除了與β半乳糖苷酶反應的Abs的人超免疫血清的抗體的連續(xù)吸附，在重組蛋白gal-DG 571(LSA5)、gal-DG 662(PfEMP3)(Gruner，Brahimi et al.2001)和gal-DG 438(Marchand andDruilhe 1990)上親和純化人抗LSA-5特異性抗體。簡單地，用每種超免疫血清連續(xù)地孵育并充分地洗滌所誘導的并吸附在經異丙基硫代半糖苷浸泡的硝酸纖維素膜(BA 85，Schleicher & Schuell，Dassel，Germany)上的重組蛋白。用0.2M甘氨酸(pH值2.5)覆蓋特異性結合抗體，并加入2M Tris(pH 11)將其快速中和。首先用PBS(pH 7.4)對親和純化的抗體進行透析，然后用RPMI進行透析，兩次透析都是在4℃下進行24個小時。用Centricon30膜(Amicon，Millipore，USA)將樣品濃縮到對應于原始血清的1/20稀釋液的體積。也從GST和His6重組體LSA5中制備得到相似的制劑。
已經從經gal-DG571免疫的小鼠中獲得了小鼠抗LSA5血清。在第3次免疫接種后15天，收集到本研究所用的血清，并將其在-80℃下冷凍儲存?zhèn)溆谩?br> 間接熒光抗體檢測(IFAT)通過將抗體在37℃下與i)經戊二醛固定的子孢子；ii)LS感染的肝臟組織的5μM切片孵育30分鐘，評價了人和動物抗體與子孢子和受感染肝細胞的反應性。然后，用PBS洗滌玻片3次，將其與異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗人IgG、A、M(Bio-Rad，F(xiàn)rance)或抗小鼠IgG、A、M(appel，Organon Teknika，Belgium)再孵育30分鐘，用加有1/2000伊文思藍的PBS將所標記抗體稀釋到1/200倍。用相差顯微鏡以及之后進行的切片Giemsa染色確定出肝裂殖體上的IFAT陽性結果(Druilhe，Puebla et al.1984)。
免疫流行病學研究研究區(qū)域和對象本發(fā)明者依賴于三個先前研究過的疫區(qū)，并因此容許進行抗原之間的比較(Fidock，Gras-Masse et al.1994；Trape，Rogier etal.1994；Bottius，BenMohamed et al.1996)。個體覆蓋了所有的年齡組，從1歲到75歲。Podor村位于塞內加爾的北部地區(qū)，這是Sahel的一個極為干燥的地區(qū)。蚊子對瘧疾的傳播具有季節(jié)性，估計傳播率為平均每年每人1次感染性叮咬(范圍為1到5次感染性叮咬/年)。Donse是布基納法索的熱帶草原地區(qū)，位于瓦加杜古以北50km。瘧疾傳播率高達每年每個體100次感染性叮咬(Druilhe，Pradier et al.1986)，該傳播率是高的，盡管這是非洲標準的平均水平。Dielmo村位于塞內加爾的Sine-Saloum地區(qū)。瘧疾的傳播率非常高，并且持續(xù)多年，具有明顯的年份和季節(jié)的波動。感染性蚊子叮咬的平均數(shù)為約每年每人250次。
重組蛋白的免疫印跡將重組蛋白βgal-571(LSA5)和βgal-64(PfEMP3)在7.5％丙稀酰胺上進行十二烷基鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將其電印跡到硝酸纖維素膜上。為了研究抗LSA5和PfEMP3重組蛋白的抗體的發(fā)生率，測試了43份1/100稀釋的Podor村患者的血清，并用過氧化物酶標記的第二抗體將其顯示。作為對照，平行地測試了9份健康個體的血清。
ELISA檢測通過用10μg/ml LSA5-71共有肽(EEVVEELIEEVIPEELVL(Plm)-CONH2)的PBS溶液包被微量滴定板進行ELISAs(圖1)。用含0.01％Tween20的PBS洗滌板兩次，并在加入50μl經PBS(含0.05％Tween20(PBST)和1.25％脫脂奶粉)稀釋1/100的人血清之前，用加有2.5％脫脂奶粉(Regilait)的PBS封閉板1個小時。然后將板在室溫下孵育1個小時。在洗滌之后，用經含1.25％脫脂奶粉的PBST1/4000稀釋的過氧化物酶綴合的山羊抗人IgG(H+L)(Byosis，Compiegne，france)檢測所結合的IgG。在室溫下孵育1個小時及末次洗滌之后，加入作為過氧化物酶(0.03％，1mg/ml鄰苯二胺，0.1M檸檬酸，pH值5.5)底物的H2O2和鄰苯二胺(OPD，Sigma，St Louis)。在30分鐘之后，在Titertek Multiskan MCC/340(Flow Laboratories，F(xiàn)rance)上讀取出450nm處的吸光度。結果表示為測試血清的平均O.D.值與在相同板中進行平行研究的10個健康個體的＜O.D.+3SD的平均值的比值。取比值＞1的結果作為陽性結果。
肝期發(fā)育抑制檢測法(ILSDA)如先前所述的(Mellouk，Berbiguier et al.1990)，測試了從重組蛋白LSA5-71(DG571)和DG88(11.1)中親和純化出的人抗體對惡性瘧原蟲和約氏瘧原蟲侵入到人或小鼠肝細胞的原代培養(yǎng)物內的抑制作用。用人抗DG671(SALSA)抗體作為對照(Bottius，BenMohamed et al.1996)。簡單地，按每孔105個細胞的比例，將懸浮在完全培養(yǎng)基中的肝細胞種植到8孔Lab-Tek塑料玻片(NuncInc.，Napper Ville，IL)中。在37℃、5％CO2大氣中孵育24個小時之后，去除培養(yǎng)基，并往肝細胞培養(yǎng)物中一起加入抗DG571、抗DG88或抗SALSA抗體以及6×104個懸浮在培養(yǎng)基中的惡性瘧原蟲、約氏瘧原蟲或伯格氏瘧原蟲的子孢子(分別是NF54株、17XNL克隆1.1或ANKA株)。在37℃下孵育3個小時之后，倒掉含有抗體及未侵入子孢子的培養(yǎng)基，并用新鮮培養(yǎng)基取而代之。將培養(yǎng)96個小時之后的人肝細胞和培養(yǎng)44個小時之后的小鼠肝細胞在冷甲醛中固定10分鐘。如在(Charoenvit，Mellouk et al.1995)中所述的，利用奧林巴斯紫外顯微鏡，通過表面熒光分別用抗LSA1(DG536)抗體或單克隆抗體(MAb)NYLS3的IFAT鑒定出發(fā)育中的惡性瘧原蟲或約氏瘧原蟲的肝期。
用伯格氏瘧原蟲進行平行試驗，以評價種間抑制作用。將針對伯格氏瘧原蟲CS的MAb作為抑制伯格氏瘧原蟲子孢子侵入的對照，并用其通過如在(Charoenvit，Mellouk et al.1995)中所述的IFAT染色檢測伯格氏瘧原蟲肝裂殖體。計數(shù)每個培養(yǎng)孔內的活裂殖體的數(shù)目，并用其計算出兩個培養(yǎng)復孔內的肝裂殖體數(shù)目的平均數(shù)。結果表示為抑制百分比，計算式為(對照中的肝裂殖體數(shù)目-測試中的肝裂殖體數(shù)目/對照中的肝裂殖體數(shù)目)×100。
抗體對子孢子誘導的感染的體內被動保護如先前所述的(Brahimi，Badell et al.2001)評價了人親和純化的抗體抗LSA-5在體內對約氏瘧原蟲發(fā)育的作用。往150個約氏瘧原蟲子孢子中加入0.2ml的100μg/ml抗LSA-5-71、抗DG-729(LSA3)、和對照的人抗DG671(SALSA)特異性抗體溶液、或RPMI。因此，每只小鼠的抗體的最終劑量是20μg。在接種到BALB/c小鼠尾部靜脈之前即刻，將兩種組分混合于1ml注射器內。從第4天到第21天，通過通過顯微鏡檢查Giema染色的尾部血液的薄涂片來監(jiān)測寄生蟲血癥。
免疫原利用最初鑒定出的克隆LSA-5-71進行大多數(shù)的免疫原性研究，該克隆已經在多種用于不同類型的抗原轉運的載體系統(tǒng)中進行表達，稱為在載體KGT11中表達的β-半乳糖苷酶融合蛋白；在載體PGEX中表達的谷胱甘肽-S-轉移酶融合蛋白；在載體pTCRHis-6中表達的具有6-組氨酸尾的蛋白；以及利用兩種不同類型載體進行基因免疫的免疫原，其中一種在本發(fā)明者的試驗中被稱為pNAK以及Vical申請專利的載體VR1020。也用在kGT11或在His尾部載體中表達的11.1抗原克隆DG88進行部分工作。
最后，也用脂混合表位肽或保守表位進行免疫接種，其對應于合成肽的重組文庫，所述合成肽對應于每種與脂質組分(即棕櫚酸)相連接的序列中的觀察到的及潛在的取代。對于免疫檢測法，也使用共有肽，它們代表在重復中最常見的序列，以及代表與源自11.1基因序列(圖1)的P9B肽的比較。
小鼠的免疫接種和攻擊第1組在第0天，用10μg吸附在硝酸纖維素微粒上的βgal-DG571免疫C57BL/6、BALB/c和F1代(C57BL/6xBALB/c)小鼠，小鼠在第30、100和第174天接受隨后的3次5μg重組蛋白的注射。
用如上的βgal-DG671(SALSA)免疫對照組。
第2組在第0天，用更高劑量的50μg吸附在5.6×104個聚苯乙烯珠(直徑0.5μm)上的GST-DG571免疫C3H/Hej、BALB/c小鼠，小鼠在第15天和第36天接受隨后的2次25μg吸附在相同數(shù)目的聚苯乙烯珠上的重組蛋白的注射。用如上的GST-DG671(SALSA)免疫C3H/Hej對照小鼠。
約氏瘧原蟲子孢子攻擊低劑量在末次免疫接種后1個月，用經眶后血竇注射的10000個活的約氏瘧原蟲子孢子(17XNL株)攻擊C57BL/6、BALB/c和F1代(C57BL/6xBALB/c)小鼠，以及用更低劑量(500個17XNL克隆1.1的子孢子)攻擊C3H/Hej小鼠，該部位的注射遠比尾部靜脈可靠。在經Giema染色的每只第5天到第14天的小鼠的血涂片中確定出寄生蟲血癥。保護性定義為缺少血液期，或者它們的出現(xiàn)比對照明顯延遲，如在(Sauzet，Perlaza et al.2001)中所述的，現(xiàn)在也被A.Hill等應用于臨床試驗。
高劑量在這個組中，用1百萬活的約氏瘧原蟲子孢子靜脈內攻擊小鼠。在攻擊后42到44個小時，取出肝臟。將每個肝臟組織切成4到6塊，并馬上固定于Carnoy。將樣品包埋在石蠟中，切成5μm厚的切片，用蘇木精-伊紅染色。
在觀察＞100張切片之后，從不同的在每只動物中獲得的感染肝臟組織的樣品中確定出肝裂殖體的數(shù)目。每10個切片中只有1個切片用于研究，以避免計數(shù)相同的裂殖體兩次。
對Aotus猴的免疫接種和攻擊免疫接種方案使用了來自哥倫比亞的Valle-Cali大學免疫研究所的靈長類中心(FUCEP)的Aotus lemurinus griseimembra。在本試驗中只使用不超過800g的未曾用作實驗的 成年猴。為了避免在解釋關于免疫原性和保護作用的結果上的問題，排除了妊娠的母猴或先前有過瘧疾感染的動物。
用2μg吸附于聚苯乙烯珠上的無佐劑的GST DG571-重組蛋白皮下免疫總共5只未曾用作實驗的Aotus猴。根據(jù)用LSA3和LSA5在小鼠中獲得的比較數(shù)據(jù)以及用相同劑量的LSA在Aotus中所得到的結果(Perlaza，Zapata et al.2003)，選擇了這個低的抗原劑量。在21天的間隔內，每只動物都接受了3個劑量的免疫原。單獨用GST注射三只Aotus，并將其用作抗原對照。另外兩只未曾用作實驗的猴作為感染對照。
子孢子攻擊從在含有經惡性瘧原蟲Santa Lucia株配子母細胞感染的猴的受瘧原蟲感染血液的人工喂養(yǎng)器中喂養(yǎng)的白魔按蚊中獲得了惡性瘧原蟲子孢子。如在其他地方所描述的那樣(Hurtado，Salas et al.1997)，在喂養(yǎng)蚊子14天之后，將子孢子收集在含有正常猴血清的RPMI培養(yǎng)基中。在切割下蚊子的唾液腺之后，將子孢子注射到猴的股靜脈內進行攻擊，對照組接受惡性瘧原蟲Santa Lucia子孢子(Hurtado，Salas et al.1997)的感染。每只Aotus都接受靜脈內注射中位劑量的105個子孢子。兩只未免疫的Aotus(M29和V97)接受了相同劑量的子孢子，作為成批感染性(batch infectivity)的對照。在攻擊后的40天內，用厚血涂片、PCR和寄生蟲LDH(pLDH)測定來隨診寄生蟲血癥。如在其他地方所述的那樣(Zapata，Perlaza et al.2002)，計算出用寄生蟲/μl表示的寄生蟲密度。在寄生蟲血癥隨診結束時，用磺胺多辛-乙胺嘧啶組合物治療動物(Kinnamonand Rothe 1975；Landgraf，Kollaritsch et al.1994)。
IFN-γ測定在免疫接種之前以及在末次注射15天之后，用FicollPaque(Pharmacia Biotech)密度梯度離心分離出每只猴的PBMC，將其用于IFN-γ產量的測定。在用抗原(10μg/ml)體外刺激之后，用Elispot和細胞培養(yǎng)懸浮液測定PBMC的IFN-γ產量。用經Ficoll paque(PharmaciaBiotech)從這些小靈長類動物(小于1Kg)的最大倫理可接受的血液量中所分離到的Aotus PBMC進行T細胞檢測，最大倫理可接受的量為在第0天(免疫接種前)和第3次免疫接種后15天經股動脈穿刺所取得的3ml血液。用人IFN-γ Elispot的商品化試劑盒(MABTECH，Stockholm，Sweden)評價產IFN-γ的PBMC的數(shù)目。在4℃下用5μg/ml抗人IFN-γmAb(1-D1K MABTECH AB，Sweden)包被微量滴定板孔(Millipore，MAHA S45，Bedford，MA，USA)過夜。在用加有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培養(yǎng)基在室溫下封閉2個小時之后，將5×105個PBMC/孔的懸浮液與20μg/ml重組蛋白或合成肽混合。將板在37℃、5％CO2-95％大氣壓下孵育40個小時。在用PBS-0.05％Tween-20(PBS-T)洗滌之后，加入0.3μg/ml生物素化的抗IFN-γmAb(7-B6-1，MABTECH AB，Sweden)，并在4℃下孵育過夜。加入經1/1000稀釋的抗生物素鏈菌素-堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim)，發(fā)現(xiàn)其與底物BCIP/NBT(5-溴-2-氯-3-吲哚磷酸酶/四唑氮藍)(Sigma，St Louis，MO，U.S.A.)的反應導致了深藍色點的出現(xiàn)。兩個獨立的讀數(shù)者用立體顯微鏡(x40)確定出點的數(shù)目。結果表示為每106個PBMC的IFN-γ點形成細胞(SFC)的平均數(shù)目。因為定量的原因，不能用這個技術研究其中一只免疫Aotus的細胞。
如在其他地方所述的那樣(Benmohamed，Thomas et al.2000)，用雙位捕獲ELISA確定出在第5天所收集到的PBMC懸浮液中的IFN-γ濃度，使用了另一種被鑒定為能與Aotus IFN-γ反應的抗人IFN-γmAb的組合物。
在每個檢測中都包含有陰性和陽性對照(未刺激細胞和經PHA刺激的細胞)。從標準曲線中計算出IFN-γ濃度(IU/ml)，每個板都有標準曲線，并來自于已知量的重組人IFN-γ(Pharmingen International，19751G)。通過比較測試和對照懸浮液中的濃度確定出特異性。
LSA5和LSA3的聯(lián)合免疫接種用a)50μg重組體LSA3-DG729或重組體LSA5.71、或LSA-DG729+LSA5.71的混合物按1個月間隔3次；或b)用1μg相同的單一或組合重組體按1個月間隔僅僅2次皮下免疫接種5只C3H小鼠的組。所有的抗原都與ASO2佐劑一起經皮下轉運。在末次免疫接種后3周，用抗每種重組體的ELISA測定抗體應答。結果表示為每組5只小鼠與未接種的C3H小鼠血清相比較的Ab比率(+/-SD)的平均值。
實施例1LSA-5抗原的部分表征發(fā)現(xiàn)最初鑒定出的克隆DG571是通過用暴露于子孢子攻擊26年并同時進行持續(xù)的每日的氯喹預防治療的牧師的血清進行篩選所鑒定出的最初119個紅細胞前期片段中的一組或一族12個克隆的一部分。不僅通過利用親和純化抗體對12個克隆的每個克隆的產物的免疫交叉反應性，還通過這些插入物之間的交叉雜交都說明了這些克隆之間的同源性。對片段的測序說明7個片段與編碼Pf11.1的基因的不同區(qū)域有著明顯的同源性(＞60％)，而有一個片段屬于GLURP，剩下的4個片段仍包含有惡性瘧原蟲的基因組的重復序列特征。發(fā)現(xiàn)對應于399個堿基對插入物的克隆DG571的序列是由近15個9個氨基酸長的、富含谷氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的重復組成(圖1)。因此，它與其他的富含谷氨酸的惡性瘧原蟲抗原都有著不同程度的同源性，例如GLURP的R2區(qū)、LSA-3的重復區(qū)、11.1抗原、Pf332抗原和RESA。
對所公布的基因組數(shù)據(jù)的分析還沒有得出清晰的結論，即DG571是否屬于巨基因(megagene)Pf11.1。事實上，雖然一些克隆與所公布的11.1的序列有著100％同源性，但是DG571在蛋白水平上的同源性程度只有55％(其中它在核酸水平上的同源性為87％)，也就是說它是所有克隆中具有最大趨異性的克隆(見表2)。此外，并沒有完全完成位于染色體10上的Pf11.1基因座的序列，在僅僅由重復組成的很大區(qū)域上進行評注是困難的。最后，DG571重復表現(xiàn)出具有獨特的免疫學性能，因為用DG571誘導保護性是可能的(見下文)，而用11.1型重復的免疫接種并不能誘導出保護性。因此，盡管它屬于11.1，但它仍是一種至今尚未被描述的相當獨特的序列。

表2子孢子和肝期的抗體反應性用人抗βGal-DG571(LSA-5)免疫純化的小鼠對來自11株Thai分離株和NF54株的惡性瘧原蟲子孢子進行IFAT；i)在子孢子感染后，從Cebus paella(5天)以及從猩猩(6天)中獲得肝期惡性瘧原蟲；ii)從斯氏按蚊的唾液腺中分離得到約氏瘧原蟲(17XNL)和伯格氏瘧原蟲(ANKA)子孢子？將人抗βGal-DG662(PfMP3)和抗βGal-DG438免疫純化的抗體用作對照。
對于小鼠血清，反應性＞＝100被認作為陽性。因此使用未稀釋的親和純化的抗體時，結果表示為陰性或陽性。
實施例2LSA-5始終表達于來自32例患者分離株的子孢子的表面上以及在肝期中用IFAT(免疫熒光抗體測試)發(fā)現(xiàn)在LSA5-71上親和純化到的人抗體與NF54的子孢子表面有著強反應性，顯示出了在整個子孢子表面上均勻分布的標記。在12/12thai分離株上也檢測了這種反應性(表2)。對于每個株的所有子孢子和分離株而言，熒光模式和強度都一樣，并且與用所測試的人抗DG705(對應于CS基因的克隆)在相同的樣品上所獲得的反應性相當(圖2-A)。為了進一步評價LSA5在不同惡性瘧原蟲分離株中的抗原保守性，用來自另外20株thai分離株的子孢子進行IFA，在每個分離株的子孢子中都生成了相同一致的反應性模式(沒有顯示)。
用來自兩種嚙齒類瘧疾物種約氏瘧原蟲和伯格氏瘧原蟲的子孢子上的IFAT(間接熒光抗體測試)進一步測試了人特異性的抗LSA5抗體。兩種物種都獲得了相似模式，其具有子孢子整個表面上的均勻分布，盡管約氏瘧原蟲中的反應性更強(圖2-C)。利用在對照重組蛋白DG 438上親和純化到的人抗體，或利用伯格氏瘧原蟲的DG662(PfEMP3)，都沒有獲得對約氏瘧原蟲或伯格氏瘧原蟲的IFAT標記。在經LSA5免疫的小鼠中所誘導出的抗體也與來自所有研究株(NF54和7株Thai分離株)的惡性瘧原蟲子孢子發(fā)生強反應。用小鼠的抗LSA-5抗體通過對所有測試的約氏瘧原蟲株(265Bγ株、17XNL株和17XNL克隆1.1)的IFAT也檢測到了用人抗LSA5抗體在約氏瘧原蟲子孢子(17XNL)上所獲得的交叉反應性。對約氏瘧原蟲和惡性瘧原蟲子孢子提取物的western印跡生成了數(shù)個條帶，范圍從195到81kDa(沒有顯示)，最可能反映了分子的高的富含Glu物的含量。
在惡性瘧原蟲和約氏瘧原蟲的肝期中，利用人以及小鼠的抗體也都可以檢測到LSA5的表達(圖2-B和D)。經IFA，LSA5表現(xiàn)出定位于不成熟肝裂殖體(第5天)的寄生泡內，并分布在假裂殖子胚之間，這與LSA1(Fidock，Bottius et al.1994)、SALSA(Bottius，BenMohamed et al.1996)和LSA3(Daubersies，Thomas et al.2000)相似。在所有被檢查的起源于從猩猩中獲得的NF54株、起源于來源于NF54株的3D7克隆、以及來源于用于感染Cebus appella的非洲分離株的肝裂殖體中都看到了表達。
在惡性瘧原蟲的無性血液期中，用LSA-5的人抗體和小鼠抗體也已經觀察了與用P.f.11.1所發(fā)現(xiàn)的交叉反應性相似的交叉反應性，因為兩種蛋白中都有高含量的富含Glu區(qū)域。相反地，用不同步的材料(即含有所有發(fā)育期)發(fā)現(xiàn)相同的人和小鼠抗體與約氏瘧原蟲的無性血液期無反應性。
通過對a)子孢子的免疫金標記發(fā)現(xiàn)了LSA-5的超微結構定位(圖3-A和B)，其中它不僅與膜相連，在胞漿內的量也是豐富的；對b)完全成熟的肝臟形式的免疫金標記發(fā)現(xiàn)蛋白與存在于寄生泡內的疏松的或絮狀的物質相連，寄生泡圍繞在新出現(xiàn)的紅細胞外裂殖體的周圍(圖4-A、B和C)。值得注意的是，在PVM(寄生泡膜)內一直都能看到LSA-5的標記，但在肝細胞的胞漿以及在肝細胞表面上都沒有看到標記。IFAT和EM的染色強度都說明LSA5是在肝裂殖體期間被活性合成的。
上面的實施例說明了LSA-5的期特異性表達。通過LSA5-71與來自3個經照射的子孢子免疫過的志愿者的血清(保護了對志愿者的攻擊，通過主要針對于紅細胞前期抗原的抗體)和2個其他牧師的血清(除了PèreMauvais，還有Soeur Neveu、和Père Gouel)的反應性，以及通過進行乙胺嘧啶治療的受約氏瘧原蟲攻擊的小鼠(其中生成了只針對子孢子和肝期的抗體(沒有顯示))的血清都證實了這一點。
實施例3LSA-5在暴露于不同水平的瘧疾傳播率的個體中都是高度抗原性的在顯示出小鼠中的保護性和保守性之后，引起高發(fā)生率的人體免疫應答是選定LSA-5的更多標準之一。
在利用43份生活在Podor(塞內加爾)的年齡2到75歲的個體的血清對重組蛋白βgal-571(LSA5)的western印跡首次評價了發(fā)生率，Podor是具有非常低流行性的區(qū)域(1-5感染性叮咬/年)。在91％所測試個體中都檢測到了抗LSA5的抗體應答(沒有顯示)，因此顯示了它的抗原性與同一個體中的PfEMP3的78％和SALSA的80％(Bottius，BenMohamed etal.1996)相當。
用使用328例生活在兩個高傳播率地區(qū)(Dilemo(塞內加爾)和Donse(布基納法索))和低傳播率地區(qū)(Podor(塞內加爾北部))的所有年齡組的個體的血清的ELISA研究完成了這個最初的參數(shù)(indication)。圖5概括了結果。在所測試的所有組中都檢測到了抗共有肽571的抗體應答，抗體應答者發(fā)生率的增加是年齡和地區(qū)的函數(shù)，即它依賴于對寄生蟲的暴露以及寄生蟲傳播的水平(Podor為51.5％，Donse為66％，以及Dielmo為75.5％)。在每個地區(qū)中，在年輕個體中，特別地檢測到了抗體的發(fā)生率和滴度年齡依賴性地增加。0-5歲組比5-10歲組更高的發(fā)生率似乎與第二組中的較少的人數(shù)有關(8對12)。從一個地區(qū)到另一個地區(qū)，都存在著特異性IgG的發(fā)生率或平均水平和子孢子接種的平均數(shù)目之間的相關性。如圖2所示，IgG抗體應答隨著對感染性蚊子叮咬的暴露而增加，在Podor有17.5％的高應答者，Donse為33.5％以及Dielmo為52％。
在Podor這個最低傳播率地區(qū)所獲得的結果再次顯示了未曾用作實驗的LSA5的高抗原性，因為在非常少的瘧疾感染性蚊子叮咬后就可以引發(fā)特異的抗體應答。
所記錄到的LSA5的發(fā)生率因此明顯比先前在相同地區(qū)的相同個體中所記錄到的LSA1(Fidock，Gras-Masse et al.1994)、Salsa(Bottius，BenMohamed et al.1996)、Starp(Fidock，Bottius et al.1994)、CS(Bottius，BenMohamed et al.1996)、PfEMP3和EBA175的發(fā)生率更高。
實施例4抗LSA-5抗體在體外和體內條件下都強烈抑制惡性瘧原蟲和約氏瘧原蟲侵入到肝細胞內4.1體外結果已經證實存在著LSA5和兩種嚙齒類動物寄生蟲約氏瘧原蟲和伯格氏瘧原蟲之間所共享的B細胞表位，檢查了抗LSA5抗體在體外對約氏瘧原蟲和伯格氏瘧原蟲子孢子侵入到小鼠肝細胞內的作用。平行地實施使用兩種嚙齒類動物物種的試驗，即利用單一肝細胞制劑進行的試驗(圖6)。LSA5-71免疫純化的人抗體分別顯示出對約氏瘧原蟲子孢子侵入的99％抑制以及對伯格氏瘧原蟲子孢子侵入的60％抑制。當抗體是用屬于11.1抗原的重組蛋白DG88免疫純化的蛋白時，抑制是50％。非交叉反應性抗原SALSA免疫純化的抗體沒有明顯的抑制作用(＜10％抑制作用)。
用抗LSA-5抗體所獲得的近乎完全的抑制與抗LSA-3所獲得的相似(Bottius，BenMohamed et al.1996)，并在曾獲得過的抑制中是最高的。事實上，利用抗環(huán)子孢子蛋白單克隆抗體以及抗STRAP、SALSA、LSA-3的人抗體先前都已經獲得了對子孢子侵入的抑制。但是，抗CS、STRAP和SALSA的抑制有時是強的，但從不是完全的。仍一直都有一定比例的子孢子能轉化成為肝期。這可能與靶抗原相關，因為無論所測試的抗體濃度高達1g/L抗CS Mab時，都出現(xiàn)了這種現(xiàn)象，而LSA-3和LSA-5的結果是用親和純化的抗體所收集到的，即用相當弱的抗體濃度，其滴定1∶2到1∶100個子孢子表面(其中0.5g/l抗CS Mab具有滴度1×107)。
抑制惡性瘧原蟲子孢子侵入到人肝細胞內往人肝細胞原代培養(yǎng)物中與惡性瘧原蟲子孢子一起加入經調整的IFAT終點滴度為1/50的人親和純化的抗LSA-5-71和小鼠中生成的抗體。在重復進行的預試驗中，用人抗體獲得了對95％的侵入抑制。通過加入濃度為10μg/ml的LSA-5-71抗原，通過逆轉抑制作用確認了抗體作用的特異性。在對照孔中，抗原本身沒有抑制作用，當將其加入到抗LSA-5-71人抗體中時，它完全逆轉了所觀察到的侵入抑制，因此清楚地說明了抑制作用是因為互補位、即抗體的抗原結合位點，即不是因為與抗體制劑相關的任何類型的毒性作用。此外，在具有抗LSA-5-71的孔中，剩下的子孢子是聚集的，可能是因為抗體造成的，而抗原逆轉了這一點。在小鼠中生成的抗體具有比人親和純化的抗體(45％)更弱的作用。采用抗環(huán)子孢子蛋白2A10 Mab作為陽性對照，采用針對在子孢子上無表達的DG536(LSA-1)的抗體作為陰性對照。因為最近已經獲得了那些結果，并在另一個試驗中進行了重復，結果都沒有顯示。
4.2體內結果被動轉移試驗。用體內研究確認了體外的侵入抑制。在被動轉移試驗中測試了人親和純化的抗DG571抗體。將先前已經顯示出具有抗約氏瘧原蟲子孢子感染的保護作用的人抗DG729(LSA3 N端)抗體平行地用作陽性對照。測試了每組兩只小鼠。在每一組中，給小鼠注射與特異抗體混合在一起的子孢子。一組陰性對照包括用子孢子和抗SLASA抗體一起注射過的小鼠，該抗體不與約氏子孢子反應，而最后一組小鼠單獨接受子孢子以檢查寄生蟲的感染力。從接種后第4天到第21天，在已經接受過抗LSA5抗體的小鼠中沒有檢測到寄生蟲，說明了人抗LSA5抗體完全保護小鼠避免了約氏瘧原蟲子孢子感染。相反地，從第5天開始，已經接受過用抗SALSA抗體預接種的子孢子，或未處理的子孢子的小鼠就有著明顯的寄生蟲血癥，感染遵循著正常的過程(表3)。應當要明白的是，與利用抗TRAP或抗約氏瘧原蟲CSP的單克隆抗體所進行的被動試驗相反，它們都必須要轉移大量的抗體，分別是500μg(Gantt，Persson et al.2000)和1mg(Charoenvit，Mellouk et al.1991)，而更低量(20μg)的抗LSA-5抗體是有保護性的。

表3抗LSA-5抗體在被動轉移試驗中的體內保護作用。往150個約氏瘧原蟲子孢子中加入100μg/ml人抗LSA5、抗βgal-DG729(LSA3)或抗βgal-DG671(SALSA)抗體，終濃度為200μl/小鼠，并將其注射到Balb/C小鼠的尾部靜脈。從攻擊后第4到第21天記錄寄生蟲血癥。
實施例5LSA-5的免疫接種在一些小鼠株中誘導了抗約氏瘧原蟲子孢子攻擊的保護性小劑量子孢子攻擊在第一個試驗中，3株小鼠(C57BL/6、BALB/c和F1(C57BL/6xBALB/c))接受了4次βgal-DG571(LSA5)或βgal-DG671(SALSA)的免疫接種，并經靜脈內接種10,000個約氏瘧原蟲子孢子(17XNL株)攻擊小鼠。
4/5(80％)的C57BL/6親代小鼠、4/5(80％)的BALB/c和14/16(87％)的雜交小鼠F1(C57BL/6XBALB/c)都顯示出了顯著程度的保護性(圖7)。
5只C57BL/6中的2只(40％)具有消除性保護性，而在其他2只小鼠中，寄生蟲血癥比對照組的小鼠延遲了3天(對應于肝內寄生蟲負荷平均降低了99.2％)。5只LSA5免疫的BALB/c小鼠中的4只是被部分保護的，表現(xiàn)為寄生蟲血癥的出現(xiàn)延遲了48個小時。5只雜交小鼠中的5只都顯示出部分保護，2只小鼠延遲了3天，以及3只小鼠延遲了1天。在第二個試驗中，在11只雜交小鼠中的9只小鼠(81％)中進一步確認了部分保護，5只小鼠延遲了3天，以及4只延遲了2天。相反地，在所有31只經抗βgal-DG671(SALSA)免疫的小鼠以及20只對照的未免疫的小鼠中，都在攻擊后第5天開始出現(xiàn)了血液寄生蟲血癥，即沒有出現(xiàn)延遲。
在第三個試驗中，用50μg吸附在聚苯乙烯珠上的LSA5重組體GST-DG 571免疫5只C3H/HeJ和5只BALB/c小鼠，隨后用5個GST對照以及500個活約氏瘧原蟲子孢子(17XNL克隆1.1)攻擊小鼠，約氏瘧原蟲子孢子具有持續(xù)的感染力，其感染率為每只動物100個子孢子。所有的5只C3H和5只BALB/c小鼠都顯示出受到了保護，兩只小鼠受完全保護，而剩下的免疫小鼠受部分保護。嘗試了基因免疫，但只提供了較弱的保護，與9只對照相比，8只免疫動物中的每只動物的潛伏期都只延遲了24個小時。
計數(shù)肝裂殖體(LS)的大劑量攻擊隨后用大劑量子孢子接種以及之后的對感染肝臟的原位研究探討了保護率。如在圖8中所示的，與對照比較，在所有4株經LSA5免疫的小鼠中都觀察到了所形成的肝裂殖體數(shù)目的明顯減少，范圍是在82到98.2％抑制之間。
在BALB/c中看到了肝裂殖體的數(shù)目減少了98.2％，C57BL/6小鼠減少了95％，以及F1(C57BL/6xBALB/c)小鼠減少了82％。另外，在2/2經LSA5-71和CFA免疫的CD1小鼠中獲得了完全保護。這些保護水平與先前在LSA3免疫的小鼠中所獲得的保護水平一樣高(Sauzet，Perlaza et al.2001)。
原位觀察LSA5免疫接種不僅造成了大劑量攻擊后的肝臟形式總數(shù)的顯著減少，它也與肝臟內的寄生蟲周圍的強烈的原位細胞防御有關(圖9)。在接受1百萬子孢子的對照F1(C57BL/6xBALB/c)小鼠的肝臟內觀察到了健康的肝臟形式(圖9-A)。相反地，在經LSA5免疫接種的動物中，肝臟內有淋巴單個核細胞的浸潤，并且存在較少的細胞肉芽腫，其主要是由淋巴細胞和巨噬細胞組成，在肝臟內沒有看到完整的肝臟形式，但是可以檢測到寄生蟲抗原(經抗LSA3特異性抗體檢測所發(fā)現(xiàn)的)(圖9-D)。在一些例子中，肝臟形式仍是形態(tài)學上可見的，但是已經被白細胞所變更和浸潤(圖9-B、C)。
約氏瘧原蟲低劑量攻擊試驗只能通過對比所述試驗和同時被攻擊的對照抗原或對照佐劑接種小鼠的血液中新出現(xiàn)寄生蟲(即LS成熟的時間)的可重復性來解釋說明。先前描述了在大于100只對照小鼠中沒有觀察到延遲(Sauzet，Perlaza et al.2001)，以及最近計算出在超過300只的對照小鼠中，在不到3％的小鼠中觀察到24小時的最大延遲。常常得到僅僅部分的保護可能并不奇怪用惡性瘧原蟲分子免疫接種的小鼠，卻用約氏瘧原蟲攻擊，約氏瘧原蟲含有同源的交叉反應分子。兩個物種之間的共享表位的數(shù)目較少，因此，完全的、消除性保護更難以實現(xiàn)，因為靶抗原并不相同的，它們可能只含有限的表位相似性。在其中使用了各種數(shù)目的用于攻擊的子孢子的試驗中，寄生蟲血癥延遲1、2、3天分別對應著寄生蟲負荷減少了80、96、和99.2％(Sauzet，Perlaza et al.2001)。在大劑量攻擊之后，原位評價了保護程度，其中精確地計算出了每只動物的肝臟形式總數(shù)的實際減少，這些結果實際上與這些圖相一致。
最近結果確認了LSA-5的非常高的免疫原性，特別是無佐劑的微粒劑型。在稱作C3H和Balb/C的兩種小鼠中，通過皮下接種無佐劑的經LSA-5-DG571蛋白包被的聚苯乙烯微粒進行免疫接種。在兩種小鼠的所有動物和所有劑量中都獲得了高水平的增生應答、抗體應答和IFNγ分泌。圖15和16具體地顯示了用Elispot檢測法所測定的γ干擾素的分泌，這與保護狀態(tài)極好地吻合。結果顯示與C3H比較，Balb/C中的結果有著更高的劑量依賴性。在最高劑量上，應答細胞的數(shù)目是非常高的，從每100萬個PBMC 100個斑到250個斑，作為對571-組氨酸重組蛋白和/或對共有的571LSA-5肽、混合表位LSA-5的應答，而對源自11.1的公開序列的P9A和P9B或對對照抗原例如LSA-1的應答遠比上述的應答小。
最后，肝臟的原位研究顯示了在LSA5抗原周圍非常強的T淋巴細胞的募集，說明了特異淋巴細胞可以遷移并入巢到這個位置?？偠灾?，這些結果顯示了非常低到中等劑量的無佐劑的經微粒形式轉運的抗原可以誘導非常強的免疫應答，具體地是那些先前發(fā)現(xiàn)與小鼠、非人類的靈長類或人類中的保護狀態(tài)相關的免疫應答。
實施例6用無佐劑的LSA-5對Aotus猴的免疫接種說明了LSA-5可以誘導抗惡性瘧原蟲攻擊的保護性4只經吸附于微粒上的DG571重組蛋白免疫的Aotus中的3只完全地耐受了Santa Lucia株的子孢子的攻擊(圖10-C)。相反地，從第0天到第10天，3只經對照抗原免疫的Aotus(圖10-A)和2只未免疫的動物(圖10B)都出現(xiàn)了明顯的可檢測到的惡性瘧原蟲寄生蟲血癥。所有Aotus在第60天都接受藥物治療。
在LSA-5免疫組中，3只猴(M217、M219和V86)在隨診40天內的任一時間點上都沒有出現(xiàn)過寄生蟲血癥，而剩下的1只(M221)僅在1天(第13天)出現(xiàn)了明顯的寄生蟲血癥。對照組和2只經免疫的未受保護的Aotus中的寄生蟲血癥是輕度的，從每μl 71個到500個寄生蟲。所有Aotus在第60天都接受藥物治療。
盡管結果仍是初步的，但是這代表了該第二種瘧疾前紅細胞亞單位疫苗候選物能誘導Aotus猴抗惡性瘧原蟲子孢子攻擊和異源株攻擊的保護性的報道。結果說明了LSA-5在被免疫猴中的保護作用。
先前用其他前紅細胞抗原例如CS或Spf 66在Aotus中所進行的試驗至今都不能誘導抗惡性瘧原蟲子孢子攻擊的保護性，LSA3除外(Perlaza，Zapata et al.，2003)。重要的是，對于其他瘧疾疫苗候選物所報告的高多態(tài)性，源自T9-96克隆的LSA-5蛋白所提供的保護性可擴展到Santa Lucia株的攻擊。這與LSA-5序列在上面所報道的寄生蟲分離株中的高度保守性相一致。
實施例7LSA5誘導的保護性與IFNγ應答的提高相關在此考慮到IFNγ有兩個原因首先，因為它被認為是抗瘧疾肝期的主要介質，其次因為它是比增殖檢測更為可靠的T細胞活化的指數(shù)，增殖檢測對于Aotus淋巴細胞是特別困難的(Perlaza，Zapata et al.2003)。
懸浮液中的IFNγ重組蛋白DG-571特異地誘導來自所有經LSA-5免疫的猴的細胞生成IFNγ(圖11)。水平與那些在LSA-3免疫動物體內的特異生成的水平相當(Perlaza，Zapata et al.2003)。重要的是，應答于惡性瘧原蟲子孢子提取物，也誘導PBMC分泌IFNγ，說明疫苗刺激細胞很好地處理并識別了LSA-5中的天然表位。從3只平行測試的對照猴中以及從在免疫接種前獲得的細胞中獲得的陰性結果證實了IFNγ生成的特異性(沒有顯示)。
ELISPOT用這個技術只能研究來自3只免疫Aotus的細胞(因為定量的原因)。應答于重組蛋白，產IFNγ細胞的頻率從62到190/1×106PBMC(圖12)。值得注意的是，只有未受保護的Aotus M221顯示出對LSA-5的最小應答，更重要的是它對在相同檢測中所用的LSA-5衍生的合成肽根本沒有應答。相反地，其他兩只研究動物對肽都有著明顯的應答。最后，在3只GST免疫的對照Aotus的任一只動物中都沒有檢測到產LSA-5特異性IFNγ細胞。
所有3只經LSA-5免疫的受保護的Aotus都能發(fā)生針對LSA-5的IFNγ特異的T細胞應答。對于未受保護的動物，在懸浮液內有著明顯的信號，而在Elispot中卻沒有。但是，應當注意到該動物僅有一天的寄生蟲血癥，即可以被部分保護，其次，IFNγ滴度是在攻擊前兩個月測定的。
相反地，特異性抗體是難以檢測到的。用ELISA發(fā)現(xiàn)所有動物體內都不存在特異性抗體，除1只動物外(M217，見表4)，并且用IFAT發(fā)現(xiàn)它們的水平較高(陽性率閾值為1/100)，但是其滴度是低到中等滴度(1/200到1/800，表4)。這種由高IFNγ應答和低抗體組成的免疫應答特征譜是典型的與保護性相關的表征。先前利用以相同方式轉運的LSA3在小鼠和Aotus中(Perlaza，Zapata et al.2003)，以及在小鼠(Sauzet，Perlazaet al.2001)和猩猩中的遺傳免疫接種之后都已經觀察到這一點，這也與用無佐劑的脂肽所獲得的結果相當接近，其中強的T細胞應答占優(yōu)(BenMohamed，Gras-Masse et al.1997；Perlaza，Arevalo-Herrera et al.1998)。

表4抗體應答a在第三次免疫接種后140天時所取的樣品中確定出Elisa滴度。滴度對應于測試血清的稀釋度，其在450nm處的光密度是10個對照Aotus血清的平均值加上2SD。
bIFA，間接免疫熒光檢測。數(shù)據(jù)表示為相應的終點稀釋度。
c第3次免疫接種后40天的血清的IFA滴度。
d1∶100稀釋度時為陰性；實施例8LSA-3和LSA-5的共免疫接種說明當兩種分子一起存在時都具有免疫原性因為LSA5是能誘導抗子孢子攻擊的非常罕見的抗原之一，所以進行了LSA3+LSA5的組合免疫接種，作為與同一批次小鼠中的單次免疫接種的比較。在經每種重組蛋白單獨免疫的小鼠中，在最高劑量都誘導出了強的特異抗體應答。在低到1μg的劑量時，兩種蛋白仍都是高免疫原性的(圖13)。雖然抗LSA-3抗體滴度與最高劑量比較沒有顯著差別，但是抗LSA-5滴度卻降低了2到3倍。當組合了兩種抗原時，即用同一注射器一起注射，甚至在低劑量時也保留了兩種抗原的免疫原性，并且每種蛋白在小鼠中的抗體滴度不依賴于劑量。特別有趣的事實是經低劑量LSA-3+LSA-5免疫的小鼠表現(xiàn)出比經LSA-5單獨免疫的小鼠高出3個數(shù)量級的抗LSA-5抗體，滴度的水平與高劑量LSA-5單獨免疫的小鼠中的滴度水平相似。這些結果可以說明兩種抗原在免疫學水平上是有益的，至少是在抗體應答上，因為抗LSA-5抗體應答可以從抗LSA-3特異應答中獲得一些益處，甚至在沒有共價連接時。
本發(fā)明者先前已經觀察到當組合抗原時，每種抗原的免疫原性常常降低。例如，當LSA1與環(huán)子孢子蛋白聯(lián)合時，LSA1的免疫原性明顯降低(Londono，Gras-Masse et al.1990)。當RTS’S與TRAP聯(lián)合時，出現(xiàn)了相同的情況，丟失了用單獨RTSS所看到的保護作用。在猩猩中，LSA3與Starp、Salsa或LSA1的聯(lián)合都造成了LSA3的IFN滴度的顯著降低以及LSA3單獨誘導的保護性的丟失(未公開的材料)。因此，LSA3和LSA5之間相互干擾的缺乏以及所記錄到的免疫原性的增加都是非常積極的以及相當罕見的發(fā)現(xiàn)。
討論通過IFAT和EM、以及通過體外和體內的侵入抑制試驗，用人、小鼠和Aotus抗體與子孢子表面和肝期的反應性證實了LSA5的期特異性。對LSA5的鑒定延伸到了惡性瘧原蟲子孢子表面上的能被抗體所導向的分子的范圍。此外，體液和細胞防御機制都可以導向于在子孢子和肝期上所表達的LSA5。
與其他的前紅細胞疫苗候選物(例如CSP和TRAP)不同的是，LSA-5在在32株從患者的配子母細胞中生成的子孢子期分離株中所檢測到的優(yōu)勢表位中都是非常保守的。這顯然是一個關鍵的表征，因為已經反復強調了抗原多態(tài)性是疫苗開發(fā)的一個主要局限(Facer and Tanner1997)。重要的是要強調利用Aotus的異源寄生蟲(Santa Lucia株)進行的攻擊，其中疫苗劑型是依據(jù)于從T9-96克隆中獲得的基因序列。這與其他的瘧疾疫苗候選物形成了強烈對比，其中已知存在多態(tài)性并限制了保護，因此攻擊必須依賴于同源株(Kwiatkowski and Marsh 1997)。
發(fā)現(xiàn)分子的抗原性是非常令人滿意的。在3個疫區(qū)中，檢測到了高發(fā)生率的特異抗體。發(fā)生率比其他紅細胞前期候選物例如LSA1、SALSA、STRAP和CS的發(fā)生率(Fidock，Bottius et al.1994；Fidock，Gras-Masse etal.1994；Bottius，BenMohamed et al.1996)(以及許多無性的血液期抗原的抗體發(fā)生率)一樣高或更高。這在所研究的最低瘧疾傳播率地區(qū)是特別明顯的。對于Podor的平均每人1到5次感染性蚊子叮咬以及每次叮咬平均轉運10個子孢子，已經因此接受總數(shù)平均為50到250個及100到500個寄生蟲的0到5歲和5到10歲組的應答兒童的比例是不可思議的高。對所研究的3個不同地區(qū)的數(shù)據(jù)以及應答的年齡模式的比較說明了免疫應答是對感染性蚊子叮咬的暴露的函數(shù)。
通過對約氏瘧原蟲和惡性瘧原蟲的體外研究、通過抗體的體內被動轉移、通過約氏瘧原蟲子孢子對免疫小鼠的攻擊、以及通過惡性瘧原蟲對免疫的Aotus靈長類動物的攻擊獲得了關于保護性的參數(shù)。
對于體外抑制，通過過量的抗原對抗體作用的逆轉確認了抗體的抗原特異性。除了使用人體肝細胞外，肝細胞是唯一能產生可靠結果的宿主細胞(Mellouk，Berbiguier et al.1990)，這個逆轉方法不能被用于其他研究組用血液或肝臟形式所進行的其他侵入抑制檢測。但是，它可能是顯示其抗原特異性的最可靠方法。
對于約氏瘧原蟲的體內模型，重要的是要強調該模型的高嚴格性，原因如下i)小鼠對子孢子感染高度易感，因為注射100個子孢子就可以誘導血液感染。ii)用于免疫接種的重組蛋白源自人瘧疾的惡性瘧原蟲寄生蟲，其中用于攻擊的寄生蟲是嚙齒類動物的約氏瘧原蟲物種。因此所觀察到的保護依賴于這兩種物種之間的有限數(shù)目的共享表位。在高劑量攻擊之后所測定到的保護百分比與根據(jù)寄生蟲血癥出現(xiàn)延遲所估計到的減少完全一致。另外，原位研究也突出顯示了淋巴細胞募集是造成保護的主要防御機制。最近描述了一種技術(Hebert，Sauzet et al.2003)，它被設計用于分析肝臟內的表位特異性的細胞募集，其中給重組體免疫的小鼠門靜脈內注射了肽包被的聚苯乙烯珠。這個利用LSA3衍生肽進行驗證的技術(Hebert，Sauzet et al.2003)還被用于比較能或不能(用不同的佐劑)誘導保護的免疫接種方案所誘導的細胞募集。它也被用于接受經LSA5共有肽包被的肝內顆粒的LSA5.71免疫的小鼠。它在測試珠周圍誘導出了強的肽特異的細胞募集，而在對照珠周圍卻沒有(沒有顯示)，這與在所報道的攻擊寄生蟲周圍所見的基本相似(圖9-D)，細胞募集主要是由CD3、CD4、CD8、NK細胞和巨噬細胞組成。盡管發(fā)現(xiàn)抗體起到了明確的作用，這些原位研究強烈提示細胞機制(特別是T細胞)能分泌高水平的IFNγ，并能遷移到肝內裂殖體處，這起到了最為重要的作用。
在Aotus猴中獲得的結果說明LSA-5是非常罕見的能實現(xiàn)抗惡性瘧原蟲子孢子攻擊的保護作用的候選物之一。事實上，有著一些已經誘導出小鼠體內的抗嚙齒類瘧原蟲攻擊的免疫力的分子，CS、TRAP和兩者的組合物是最常被研究的分子(Schneider，Gilbert et al.1998)。相反地，極少的分子能顯示出了抗靈長類或人體體內的惡性瘧原蟲攻擊的保護作用。至今只有LSA-3和LSA-5實現(xiàn)了抗同源株和異源株攻擊，而RTSS(CS的一種特殊劑型)實現(xiàn)了更為有限程度的和更短時間的保護作用(Stoute，Slaoui et al.1997)。這些結果與那些先前用其他所述的分子在人體和更高等靈長類中獲得的結果相反，已經證實這些分子不能實現(xiàn)相同程度的保護，如LSA-1、TRAP、SALSA、STARP、PfEXP1、SpF66。
值得注意的是，通過不需要應用任何強的或有毒的佐劑的轉運系統(tǒng)，用非常低劑量的抗原就能獲得保護。這些結果是意料之中的，因為發(fā)現(xiàn)這種免疫接種的模式優(yōu)選地誘導了與先前的小鼠試驗中的保護作用相關的T細胞應答，并且發(fā)現(xiàn)低免疫劑量的抗原比高劑量更為有效(Sauzet etal，準備中)。盡管可以入組的靈長類動物的數(shù)目不能容許我們達到統(tǒng)計學顯著性，因為它們是罕見的、珍貴的和昂貴的動物，但是先前已經在超過11次的感染中建立了Santa Lucia株子孢子對Aotus攻擊的可重復性(Zapata，Perlaza et al.2002)，在此所采用的5只對照以及在先前研究(Perlaza，Zapata et al.2003)中所采用的4只動物中獲得的結果都確認了這一點。值得注意的是，在此所成功采用的小鼠和靈長類的免疫接種的模式與先前用LSA-3在小鼠和Aotus中成功應用的模式相同，并且在兩種物種中都生成了相似的應答類型和保護性(Perlaza，Zapata et al.2003)。
IFNγ是最強的抗LS發(fā)育的活性細胞因子(Ferreira，Schofield et al.1986；Mellouk，Maheshwari et al.1987；Schofield，F(xiàn)erreira et al.1987)。在本研究中，至少用Elispot得到的結果確認了PBMC的特異性IFNγ分泌是抗惡性瘧原蟲紅細胞前期的防御的重要成分。應答于子孢子天然蛋白所獲得的特異性IFNγ分泌說明對用于呈遞給T細胞的天然和“人造”表位的正確處理，即免疫原的正確構象。這些結果與先前用另一種疫苗候選物LSA-3在猩猩和Aotus中獲得的數(shù)據(jù)一致。事實上，在小鼠和靈長類動物中與LSA-5誘導的保護相關的高IFNγ和低抗體應答是與先前在LSA-3試驗中所記錄下的結果基本上相似的代用品(BenMohamed，Gras-Masse et al.1997；Benmohamed，Thomas et al.2000；Daubersies，Thomas et al.2000)。它們也與在經照射子孢子的方式免疫的小鼠和猩猩中所記錄到的結果相似(Druilhe et al，1998；Doolan et al JI，和未公開材料)。因此在3種情況中的保護的可獲得標記物有著一個交匯，它可以被作為一種間接提示，即在這3種情況中，保護可能是由相同的效應物機制所介導的。
因為用于人類瘧疾子孢子攻擊的可獲得模型的局限性，LSA-3和LSA-5現(xiàn)在顯示出是2種非常有希望的候選物，它們是最有抗原性的和免疫原性的、無毒的以及具有證實功效的候選物，盡管并非是在所有免疫的動物內。對組合疫苗的研制可能意味著組合具有在臨床前水平上證實有療效的候選物，在這種情況中，候選物是LSA-3和LSA-5。此外，在此顯示了LSA-3和LSA-5的組合免疫接種特別地提高了LSA5應答。因此研究通過組合對2種不同抗原靶點的攻擊是否能實現(xiàn)提高保護性可能是有價值的。
實施例9測試肽或多肽是否是被抗LSA5特異性抗體識別的試驗方案常用的試驗方案是ELISA檢測法，例如在上面的材料和方法中所述的ELISA檢測法，其中用測試肽取代在該ELISA方法中所述的LSA-571共有肽，針對共有肽或在表1中所述的任一其他序列的抗體都被用于測試其與測試肽的反應性(用共有肽的人親和純化抗體或經共有肽與一種合適佐劑例如Montanide ISA720或弗氏完全佐劑一起免疫的動物的血清)。
評價肽或多肽是否被LSA-5特異性抗體識別的另一種方法是使用結合圖13的闡述所描述的方法，此時用共有肽包被，以及其中測試肽被用于競爭性檢測法，它以不同的濃度(從每ml 10微克到1mg)與測試抗體混合，以便確定出它是否能抑制抗體與共有肽的結合。
如果在免疫印跡試驗中，肽與硝酸纖維素表面相連接，就可以采用相同類型的方法，或者最后，如果測試肽被用于IFAT抑制檢測法，該檢測法與上面所述的ELISA的方法相似，其中測試肽與抗共有肽抗體混合，并且測試肽在IFAT檢測法中被用于抑制所述抗體與寄生蟲的結合。
實施例10關于抗紅細胞前期的附加數(shù)據(jù)1.1用經照射子孢子免疫的人類志愿者血清識別LSA-3和LSA-5。
為了達到下面的兩個目的，進行了這些試驗a)通過顯示不具有紅內期惡性瘧原蟲的個體體內的免疫應答間接地確認了這兩種分子在紅細胞前期(叫作子孢子和肝期)內的表達；和b)與其他分子比較，評價分子的免疫原性。事實上，在屬于紅細胞前期分子的120種基因片段(對應于總計39個基因)中，只有非常少的片段可以被經照射子孢子免疫的個體所發(fā)生的免疫應答所識別，盡管事實是這些個體都受到了保護。這是最初真正用于鑒定LSA-3的方法，在120種基因片段中，LSA-3顯示出最強的和最顯著的與經照射惡性瘧原蟲子孢子免疫的個體的血清反應的陽性率。例如，其他在天然的暴露條件下具有強免疫原性的分子并不能被來自經照射子孢子保護的志愿者的血清所識別，例如LSA-1、SALSA、STRAP、PfEXP1、TRAP。在用來自4位經照射子孢子免疫和保護的個體中的細胞所進行的Elispot檢測法中，這在T細胞水平也是真實的。
用8例未曾用作實驗的志愿者血清進行ELISA檢測法，用其確定出陽性率的閾值。它對應于8個陰性對照給出的平均OD值+3標準差。測試血清包括2份來自已經在連續(xù)的每日氯喹的預防治療下分別生活了26年和21年的牧師(Père Mauvais和Soeur Neveu))的血清，他們發(fā)展出了很強的針對子孢子表面抗原和肝期抗原的反應，即使有也只有很少量的血液期分子，以及4份海軍醫(yī)學研究所交流的志愿者的血清，志愿者在1年內進行12到14次數(shù)百個受照射蚊子的免疫接種和半次免疫接種，并在攻擊之前受到了保護(血清V1-4)。在攻擊之前，在免疫接種后收集血清。
主要結果用任意單位表示，或者用測試血清的OD值對對照的平均值+3SD的比值表示，下面的表中概括了主要結果。
它們(表1)顯示了與兩種分子LSA-3和LSA-5的特異的抗體反應性，這說明與子孢子和/或肝臟形式的接觸誘導了特異于這兩種分子的抗體，此外，如上所提及的，說明了在免疫接種的條件下，這些分子具有免疫原性，這使得它們不同于大多數(shù)至今所研制出的其他紅細胞前期疫苗候選物包括環(huán)子孢子蛋白。
2.抗LSA-5IgG應當與原野條件下抗感染性蚊子叮咬之間的關系在這個研究中，我們采用了塞內加爾Dielmo的機構，其中通過醫(yī)生每日訪問每位居民、日夜地持續(xù)開放醫(yī)療隊、詳細地計數(shù)寄生蟲密度以及確定出年齡依賴性致熱閾以便將任一次發(fā)熱、頭痛或其他與瘧疾明確相關的癥狀的發(fā)作精確地診斷為瘧疾發(fā)作獲得了極為精確的臨床瘧疾發(fā)作的記錄。
通過利用作為包被抗原的共有LSA-5肽的ELISA檢測法確定出抗LSA-5總IgG抗體應答，所用的LSA-5肽的濃度為10microG/ml。
通過對在根治治愈及對感染性蚊子叮咬的天然暴露之后的血液復燃延遲的統(tǒng)計分析來分析抗體數(shù)據(jù)。95位來自Dielmo村的所有年齡組的個體都接受了每日奎寧25mg/kg共8天的根治性治療，用每日血涂片隨診血液期寄生蟲在持續(xù)的天然子孢子攻擊下的再現(xiàn)延遲。該參數(shù)在下文中被稱作復燃延遲。
考慮到重要的混淆因素例如年齡、鐮刀狀細胞所提供的保護、葡萄糖-6-磷酸缺乏癥等....，我們采用了多因素逐步回歸分析模型，其中用JMP軟件同時測試了數(shù)個變量的影響。對檢驗假設的檢驗是依據(jù)于方差比(用F表示)，F(xiàn)值＞1表示偏離檢驗假設。
當在多因素逐步回歸分析中一起分析抗LSA-5抗體和數(shù)個變量(如復燃延遲、年齡、血紅蛋白類型(AA或AS)、G6PD缺乏癥、脾大小、抗血液期IgG應答)時，僅僅顯著相關的如下復染延遲隨著年齡而增加(F比＝4.22；P＝0.042)，隨著脾大小而降低(F比＝4.22；P＝0.042)；隨著抗LSA-5IgG應答而增加(F比＝4.16；P＝0.044)。
換句話說，抗LSA-5抗體對子孢子向肝形式的轉化以及血液形式的出現(xiàn)有著作用，作用與年齡的作用一樣強。
實施例11支持抗血液期保護的證據(jù)1.然后我們一起分析抗LSA-5抗體數(shù)據(jù)和瘧疾發(fā)作的出現(xiàn)，這取決于寄生蟲的紅細胞內期(在血液取樣后1年內觀察到的)、年齡、血紅蛋白(AA或AS)、G6PD缺乏癥、脾指數(shù)、對血液期提取的抗體應答。通過多因素逐步回歸分析用95例個體中的相同的抗體數(shù)據(jù)分析抗LSA-5抗體和保護避免在因確定抗LSA-5抗體而取血樣后1年內的臨床瘧疾發(fā)作之間的相關性。
發(fā)現(xiàn)瘧疾發(fā)作的減少是年齡的函數(shù)(F比＝20.72；P＜0.0001)，瘧疾發(fā)作在具有AS血紅蛋白的個體中是更少的(F比＝8.85；P＝0.0037)，以及瘧疾發(fā)作的減少是抗LSA-5IgG應答的函數(shù)(F比＝13.68；P＝0.0004)。
因此，抗LSA-5抗體的保護作用比鐮刀型細胞形狀所賦予的保護作用更強，鐮刀型細胞形狀已經被確定為耐受瘧疾發(fā)作的主要遺傳因素之一。
2.為了進行更多的上面的分析并包括針對不同于總血液期提取物的瘧疾抗原的免疫應答，在155位個體中進行更多的分析，在這155位個體中都得到了關于抗LSA-5抗體、1年內的瘧疾發(fā)作的發(fā)生率、年齡、血紅蛋白類型、G6PD缺乏癥、抗AMA-1IgG應答、抗MSP-1IgG應答的數(shù)據(jù)。
和預期的一樣，這個分析再次顯示了瘧疾發(fā)作的減少是年齡的函數(shù)(F比＝23.43；P＜0.001)，瘧疾發(fā)作的增加是抗MSP-1IgG滴度的函數(shù)(F比＝2.85；P＝0.0093)；以及瘧疾發(fā)作的減少是抗LSA-5IgG應答的函數(shù)(F比＝18.98；P＜0.0001)。
換句話說，這個分析除外了抗血液期提取物抗體(抗AMA-1抗體)的保護作用，表明瘧疾的危險隨著抗MSP-1抗體的增加而增加(即負性作用)，這有著臨界的顯著性，并且這個分析顯示出抗LSA-5有保護作用，保護作用極強，與年齡的保護作用一樣強，在Deilmo和其他地方中，年齡都被公認為是抗瘧疾發(fā)作的易感性狀態(tài)轉化的主要變量。
3.體外研究寄生蟲殺死，證實了抗體-單核細胞協(xié)同效應對于上面的免疫流行病學研究，有著抗LSA-5抗體強烈地減少瘧疾發(fā)作的次數(shù)的證據(jù)。我們因此研究了抗LSA-5的直接和間接作用。以前在泰國進行的被動轉移中所用的人抗體被用于制備重組DG571的親和純化的抗體。
發(fā)現(xiàn)相應的抗體對無性的血液期寄生蟲倍增沒有直接的作用，即不能抑制裂殖子侵入到紅細胞內。相反地，在存在正常的血液單核細胞時，觀察到抗LSA-5抗體能協(xié)同正常的血液單核細胞生成寄生蟲殺死因子，它們減少了惡性瘧原蟲的體外生長。與對照一起進行研究3次，包括陰性對照IgG、能給泰國兒童轉移保護的陽性對照非洲IgG，在每個試驗中都觀察到了相似的結果利用滴度為1∶200的親和純化的抗體，采用了稀釋10倍或20倍的抗體(即終末滴度為1∶20或1∶10，這是極低的抗體濃度)，可重復地獲得了強的寄生蟲殺死作用，為78％(1∶20滴度)或45％(1∶10滴度)。
這個結果說明抗LSA-5抗體具有與所述的抗MSP-3抗體的寄生蟲殺死作用相似的類型。
4.在塞內加爾的Dielmo進行的附加研究證實了IgG3-抗LSA5的作用對于上面的免疫流行病學和體外研究的數(shù)據(jù)，我們研究了各種IgG亞型在保護上的作用。事實上，只有抗體的嗜細胞亞型IgG1和IgG3能協(xié)同ADCI機制。詳盡的研究確定出了138例來自Dielmo的個體體內的IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4型抗LSA-5抗體的量。
發(fā)現(xiàn)只有IgG3亞型的抗LSA-5與瘧疾發(fā)作的出現(xiàn)反向相關(標準系數(shù)＝-0.380；p＝0.0003)。
在逐步回歸分析模型中，確認了瘧疾發(fā)作次數(shù)的減少和IgG3型抗LSA-5抗體增加之間的相關性，F(xiàn)比＝14.6和p值＝0.0002。
最后，利用nominal回歸分析再次確認了這一點(LRchi2＝10.45；p＝0.001)。
5.在塞內加爾的Ndiop進行的附加研究在Nidop的附近村莊的90位年齡從6個月到92歲的個體中進行了相同的研究，該處的傳播率更低。
在這個人群中，再次觀察到了抗瘧疾發(fā)作和IgG3抗LSA-5抗體水平之間極強的關聯(lián)F比＝27.53；p＞0.0001，但沒有發(fā)現(xiàn)與IgG1型抗LSA-5應答之間的關聯(lián)。
6.在馬里的Kolle進行的附加研究。
在這個研究中，本研究最初打算研究瘧疾寄生蟲的耐藥性，觀察到感染對氯喹耐藥的寄生蟲的個體組中有半數(shù)從來都不能清除他們體內的寄生蟲血癥以及從瘧疾中康復。根據(jù)寄生蟲學的及臨床的觀察，50位測試個體中的31位都受到了保護。能清除他們體內的寄生蟲血癥的患者比那些不能清除寄生蟲血癥的患者有著明顯更高的抗LSA-5的抗體滴度，對于MSP-3同樣如此在兩種情況中，發(fā)現(xiàn)了IgG3型抗LSA-5和IgG3型抗MSP-3有著最強的相關性。對與寄生蟲密度減少相關的抗體反應的研究顯示了IgG3型抗LSA-5抗體滴度與低寄生蟲密度之間的強相關性F比＝7.06；p＝0.01。
7.提高了具有IgG3型抗LSA-5抗體的腦型瘧疾患者的生存在217例東南亞瘧疾患者中，108例有腦型瘧疾發(fā)作，109例有急性無并發(fā)癥的瘧疾發(fā)作，兩組在對總寄生蟲提取物、MSP-3、或LSA-5的抗體滴度上沒有差異。這些結果與先前在4個其他的腦型瘧疾隊列中所獲得的結果一致。
所有的108例腦型瘧疾患者亞組都接受了最有效的藥物組合物(叫作青篙素-甲氟喹)的治療。對入選時的抗體滴度的分析顯示了經藥物治療的腦型瘧疾患者的預后上的顯著差異，依賴于這些患者體內預先存在的抗瘧疾抗體滴度在具有高滴度IgG3型抗MSP-3抗體或高IgG3型抗LSA-5抗體(見下文)的個體中發(fā)現(xiàn)了預后的明顯改善，即增加了生存時間。相反地，對其他瘧疾疫苗候選物的對照抗體例如抗SERP-P126、或抗AMA-1與藥物治療的腦型瘧疾的預后無關(沒有看到這些瘧疾疫苗候選物的抗體滴度與生存提高的相關性)。
因此，總而言之，研究強烈地提示預先存在的抗LSA-5抗體和抗MSP-3抗體提高了生存率，這為腦型瘧疾的新治療打開了一個途徑，即抗瘧疾藥物與抗LSA-5和/或MSP-3的抗體聯(lián)合以提高藥物治療過的腦型瘧疾患者的生存率。
結論LSA-5表現(xiàn)為最有希望的疫苗候選物之一，其具有兩個主要的靶點，一個是紅細胞前期，另一個是血液期1.LSA5能誘導小鼠、Aotus猴和人體抗子孢子攻擊，并能誘導阻斷子孢子進入到肝細胞內的抗體。
2.在多個不同的機構中，LSA5都能在體外條件以及在體內條件下暴露于瘧疾的人體中介導單核細胞依賴性寄生蟲殺死方式，以抗急性無并發(fā)癥的以及有并發(fā)癥的瘧疾。
在最為詳細的極為精確地記錄下臨床瘧疾的機構之一中，抗LSA-5IgG3型應答表現(xiàn)為是一種獲得對臨床瘧疾的抗性的主要的、非常顯著的因素。所采用的統(tǒng)計學分析的類型控制了可能的混淆因素的作用，其中年齡和血紅蛋白類型是主要的因素，并清楚地顯示了給定的抗體特異性的影響，與沒有發(fā)現(xiàn)與保護作用相關的其他抗體應答相比較，針對LSA-5的抗體獲得了抗瘧疾的保護作用。
217例東南亞瘧疾患者的表征-單因素分析獲得的參數(shù)

108例腦型瘧疾患者與109例急性瘧疾發(fā)作患者的比較

在腦型瘧疾患者和急性瘧疾發(fā)作患者之間，在年齡或抗體應答上都沒有可檢測到的差異存在(當用單因素分析檢驗時)。
根據(jù)108例腦型瘧疾患者亞組的預后所獲得的數(shù)據(jù)的比較*

(*＝患者沒有接受明顯不同的治療)。
在進展惡化的患者中，觀察到了平均年齡輕微增加的趨勢。
-多因素分析所獲得的參數(shù)-當控制了年齡時，當rIgG3-LSA5應答高時，發(fā)現(xiàn)降低了腦型瘧疾的危險(與急性無并發(fā)癥的瘧疾比較)L-R卡方＝7.65；p＝.0057。
-然后根據(jù)年齡和抗體應答，在腦型瘧疾患者亞組中檢驗了預后(死亡對存活)。
-當rigG3-MSP3-C端、或rigG3-MSP3b或rigG3-LSA5提高時，顯著地改善了預后(發(fā)現(xiàn)增加了生存的發(fā)生)。
-高IgG3特異性應答的相對“益處”(＝降低了死亡的發(fā)生)(當單獨地測定抗體應答時)如下-對于IgG3-MSP3C端，L-R卡方＝7.41；p＝.0065-對于IgG3-MSP3b，L-R卡方＝10.70；p＝.0011-對于IgG3-LSA5，L-R卡方＝6.047；p＝0.0139

表1
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序列表<110>巴斯德研究院<120>惡性瘧原蟲的肝期和血液期抗原LSA-5、包括該抗原的免疫原性復合物和抗瘧疾疫苗<130>B5676A AD/CAL<140>PCT/EP2004/014848<141>2004-12-15<150>EP 03293158.6<151>2003-12-15<160>19<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>9<212>PRT<213>Plasmodium falciparum<400>1Glu Glu Gln Ile Glu Glu Val Ile Gln1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>Plasmodium falciparum<400>2Glu Glu Ile Ile Glu Gln Val Val Pro1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>Plasmodium falciparum<400>3Glu Glu Leu Ile Glu Glu Val Val Pro1 5<210>4<211>9<212>PRT<213>Plasmodium falciparum<400>4Glu Glu Ile Ile Glu Glu Val Ile Pro1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>Plasmodium falciparum<400>5Glu Glu Ile Val Glu Glu Val Ile Tyr1 5<210>6<211>5<212>PRT
<213>Plasmodium falciparum<400>6Glu Glu Val Ile Pro1 5<210>7<211>9<212>PRT<213>Plasmodium falciparum<400>7Glu Glu Leu Val Glu Glu Val Ile Ala1 5<210>8<211>9<212>PRT<213>Plasmodium falciparum<400>8Glu Lys Leu Val Lys Glu Ile Val Pro1 5<210>9<211>9<212>PRT<213>Plasmodium falciparum<400>9Glu Gln Val Arg Glu Glu Val Ile Leu1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>Plasmodium falciparum<400>10Glu Glu Ile Val Glu Glu Val Ala Pro1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>Plasmodium falciparum<400>11Glu Glu Phe Val Glu Glu Val Ala Pro1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>Plasmodium falciparum<400>12Glu Val Glu Ile Glu Glu Ile Ile Pro1 5<210>13<211>9
<212>PRT<213>Plasmodium falciparum<400>13Glu Glu Leu Ile Glu Glu Val Ile Pro1 5<210>14<211>9<212>PRT<213>Plasmodium falciparum<400>14Glu Glu Leu Ile Glu Lys Val Ile Pro1 5<210>15<211>18<212>PRT<213>Plasmodium falciparum<400>15Glu Glu Val Val Glu Glu Leu Ile Glu Glu Val Ile Pro Glu Glu Leu1 5 10 15Val Leu<210>16<211>122<212>PRT<213>Plasmodium falciparum<400>16Glu Glu Gln Ile Glu Glu Val Ile Gln Glu Glu Ile Ile Glu Gln Val1 5 10 15Val Pro Glu Glu Leu Ile Glu Glu Val Val Pro Glu Glu Ile Ile Glu20 25 30Glu Val Ile Pro Glu Glu Ile Val Glu Glu Val Ile Tyr Glu Glu Val35 40 45Ile Pro Glu Glu Leu Val Glu Glu Val Ile Ala Glu Lys Leu Val Lys50 55 60Glu Ile Val Pro Glu Gln Val Arg Glu Glu Val Ile Leu Glu Glu Ile65 70 75 80Val Glu Glu Val Ala Pro Glu Glu Phe Val Glu Glu Val Ala Pro Glu85 90 95Val Glu Ile Glu Glu Ile Ile Pro Glu Glu Leu Ile Glu Glu Val Ile100 105 110Pro Glu Glu Leu Ile Glu Lys Val Ile Pro115 120<210>17<211>18<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceLSA-5 mixotope<220>
<221>PEPTIDE
<222>(1)..(2)<223>X＝E，K or none<220>
<221>PEPTIDE<222>(3)..(4)<223>X＝V or I<220>
<221>PEPTIDE<222>(4)..(5)<223>X＝V or I<220>
<221>PEPTIDE<222>(11)..(12)<223>X＝E or K<220>
<221>PEPTIDE<222>(14)..(15)<223>X＝P or A<220>
<221>PEPTIDE<222>(16)..(17)<223>X＝E，V or K<220>
<221>PEPTIDE<222>(17)..(18)<223>X＝L or I<220>
<221>PEPTIDE<222>(18)<223>X＝V or I<220>
<221>PEPTIDE<222>(9)..(10)<223>X＝I，V or R<400>17Xaa Glu Xaa Xaa Pro Glu Glu Leu Xaa Glu Xaa Val Ile Xaa Glu Xaa1 5 10 15Xaa Xaa<210>18<211>398<212>DNA<213>Plasmodium falciparum<400>18attccagaag aacaaattga agaggttata caagaagaaa taattgaaca agttgtacca 60gaagaattaa ttgaagaagt tgtaccagaa gaaataattg aagaggttat accagaagaa 120atagttgaag aggtaatata tgaagaggtg atacctgaag aactagtaga agaagttata 180gctgagaaac tggttaaaga gattgtacca gaacaagttc gtgaagaagt aacattagag 240gaaatcgttg aggagatgat acccgaagaa tttgtagaag aggttgcacc agaagttgaa 300atcgaggaaa taattcctga ggaattaata gaagaagtta taccagaggt attagttgaa 360gaggctgtac cagaagaact aatagaaaaa gttatacc 398<210>19<211>132<212>PRT<213>Plasmodium falciparum<400>19Ile Pro Glu Glu Gln Ile Glu Glu Val Ile Gln Glu Glu Ile Ile Glu1 5 10 15
Gln Val Val Pro Glu Glu Leu Ile Glu Glu Val Val Pro Glu Glu Ile20 25 30Ile Glu Glu Val Ile Pro Glu Glu Ile Val Glu Glu Val Ile Tyr Glu35 40 45Glu Val Ile Pro Glu Glu Leu Val Glu Glu Val Ile Ala Glu Lys Leu50 55 60Val Lys Glu Ile Val Pro Glu Gln Val Arg Glu Glu Val Thr Leu Glu65 70 75 80Glu Ile Val Glu Glu Met Ile Pro Glu Glu Phe Val Glu Glu Val Ala85 90 95Pro Glu Val Glu Ile Glu Glu Ile Ile Pro Glu Glu Leu Ile Glu Glu100 105 110Val Ile Pro Glu Val Leu Val Glu Glu Ala Val Pro Glu Glu Leu Ile115 120 125Glu Lys Val Ile130
權利要求
1.一種抗原性肽的混合物或一種多肽，其包括選自由SEQ ID No1至14和其變體組成的組的至少兩種肽、特別是至少3種肽，或者其由選自由SEQ ID No1至14和其變體組成的組的至少兩種肽、特別是至少3種肽組成，其中所述肽的混合物或多肽被抗LSA-5特異性抗體識別。
2.一種肽的混合物或多肽，其包括至少兩個SEQ ID No1的肽和/或至少一種所述肽的變體，或者其由至少兩個SEQ ID No1的肽和/或至少一種所述肽的變體組成，其中所述變體與SEQ ID No1的不同之處在于-第1位上的氨基酸是Q、A或L；和/或-第3位上的氨基酸是K、Q或V；和/或-第4位上的氨基酸是I、L、V、F或E；和/或-第5位上的氨基酸是V或R；和/或-第6位上的氨基酸是K；和/或-第7位上的氨基酸是Q或K；和/或-第8位上的氨基酸是I；和/或-第9位上的氨基酸是P、V或A，且其中所述肽或多肽被抗SEQ ID No16的LSA-5抗原的抗體識別。
3.權利要求1或2的抗原性肽，其由9到150個氨基酸、18到122個氨基酸、更優(yōu)選地18到36個氨基酸組成。
4.一種抗原性肽或一種多肽，其至少包括序列為EEVVEELIEEVIPEELVL(SEQ ID NO15)的共有的LSA-5肽，或它的經一或數(shù)個氨基酸的添加、缺失、或保守取代而源自LSA-5的變體，其中所述肽或多肽被抗SEQ ID NO16的LSA-5抗原的抗體識別。
5.權利要求1到3中任一項的肽的混合物或多肽，其還包括序列EEVVEELIEEVIPEELVL(SEQ ID NO15)的共有的LSA-5肽，或它的經一或數(shù)個氨基酸的添加、缺失、或保守取代而源自LSA-5的變體，其中所述肽或多肽被抗SEQ ID NO16的LSA-5抗原的抗體識別。
6.一種抗原性肽或多肽，其包括SEQ ID NO16的LSA-5抗原、或它的經一或數(shù)個氨基酸的添加、缺失、或保守取代而源自LSA-5的變體，其中所述肽或多肽被抗SEQ ID NO16的LSA-5抗原的抗體識別。
7.一種抗原性多肽，其由一種融合蛋白組成，所述融合蛋白包括一個抗原性部分和一個第二部分，所述抗原性部分是權利要求1到6中任一項的肽或多肽，所述第二部分與LSA-5抗原是異源的。
8.一種脂肽的抗原性混合物或一種抗原性脂多肽，其是權利要求1到7中任一項的肽的混合物或多肽，其中脂質分子分別與所述肽或多肽相連接。
9.權利要求7的脂肽或脂多肽，其中脂質分子是C末端的palmitoylysylamide殘基。
10.一種混合表位，其包括多種具有序列X1-E-X2-X2-P-E-E-L-X3-E-X4-V-I-X5-E-X6-X7-X2(SEQ ID No17)的合成肽，其中X1＝E、K或無；X2＝V或I；X3＝I、V或R；X4＝E或K；X5＝P或A；X6＝E、V或K；X7＝L或I。
11.權利要求10的混合表位，其是至少50個、至少100個、或至少500個對應于SEQ ID No17的不同序列的肽的混合物。
12.一種脂混合表位，其是權利要求9或10的混合表位，其中至少一部分合成肽與脂質分子相連接。
13.權利要求11的脂混合表位，其中脂質分子是棕櫚酸。
14.一種綴合物，其包括結合于支持物的權利要求1到13中任一項的肽、肽混合物、多肽、脂肽、脂多肽、脂肽混合物、脂多肽、混合表位或脂混合表位。
15.權利要求14的綴合物，其中支持物是病毒顆粒、或硝酸纖維素或聚苯乙烯珠、或生物可降解聚合物例如脂磷酸聚糖或聚L-乳酸。
16.一種免疫原性組合物，其包括權利要求1到7中任一項的肽的混合物或多肽、權利要求8或9的脂肽的混合物或脂多肽、權利要求10到13中任一項的混合表位或脂混合表位、或權利要求14或15的綴合物作為免疫原。
17.一種抗瘧疾疫苗，其包括權利要求1到7中任一項的肽的混合物或多肽、權利要求8或9的脂肽的混合物或脂多肽、權利要求10到13中任一項的混合表位或脂混合表位、或權利要求14或15的綴合物作為免疫原。
18.權利要求16的免疫原性組合物或權利要求17的疫苗，還包括選自LSA-1、LSA-3、LSA-5、SALSA、STARP、TRAP、PfEXP1、CS、MSP-3、P126-CERP-SERA和GLURP中的至少一種抗原。
19.權利要求16或17的免疫原性組合物或權利要求16或18的疫苗，其被配制成能引發(fā)嗜細胞的IgG1或IgG3型抗體。
20.權利要求16到19中任一項的免疫原性組合物或疫苗，其被配制成用于皮內或肌肉內注射。
21.權利要求20的免疫原性組合物或疫苗，其每一注射劑量包括1至100μg的免疫原，優(yōu)選2至50μg的免疫原。
22.權利要求16到21中任一項的免疫原性組合物或疫苗，用于預防或治療紅細胞前期瘧原蟲感染。
23.權利要求16到22中任一項的免疫原性組合物或疫苗，用于預防或治療血液期瘧原蟲感染。
24.權利要求16到23中任一項的免疫原性組合物或疫苗，還包括SBAS2和/或明礬和/或Montanide作為佐劑。
25.權利要求1到7中任一項的肽的混合物或多肽、權利要求8或9的脂肽的混合物或脂多肽、權利要求10到13中任一項的混合表位或脂混合表位、或權利要求14或15的綴合物用于制備抗瘧疾的疫苗組合物的用途。
26.一種純化的多克隆血清或單克隆抗體，其識別SEQ ID No16的LSA-5抗原。
27.一種人重組抗體或人源化小鼠抗體，其中所述抗體識別SEQ IDNo16的LSA-5抗原。
28.包括識別SEQ ID No16的LSA-5抗原的抗體的組合物用于制備抗瘧疾藥物的用途。
29.用于對瘧疾進行被動免疫治療的藥物，其包括權利要求26或27的血清或抗體。
30.權利要求29的藥物，還包括針對選自LSA-1、LSA-3、LSA-5、SALSA、STARP、TRAP、PfEXP1、CS、MSP-3、P126-CERP-SERA和GLURP中的至少一種抗原的抗體。
31.包括識別SEQ ID No16的LSA-5抗原的抗體的組合物用于制備治療腦型瘧疾患者的藥物的用途。
32.權利要求31的用途，其中與小分子的抗瘧疾藥物一起治療腦型瘧疾。
33.權利要求28或32的組合物或權利要求29或30的藥物的用途，其中抗體是嗜細胞抗體，特別是屬于IgG1或IgG3型的抗體。
34.對可能感染惡性瘧原蟲的個體進行體外瘧疾診斷的方法，該方法包括將來自所述個體的生物學樣品與權利要求1到7中任一項的肽的抗原性混合物或多肽相接觸，所述接觸在使得所述抗原性肽或多肽與可能存在于所述生物學樣品中的抗體之間形成抗原/抗體復合物的條件下進行，并在體外檢測可能形成的抗原/抗體復合物。
35.權利要求34的方法，其中通過ELISA檢測法進行體外診斷。
36.權利要求34或35的方法，其中還將所述生物學樣品與源自其他抗原的一或數(shù)種抗原性肽相接觸，所述其他抗原選自LSA-1、LSA-3、LSA-5、SALSA、STARP、TRAP、PfEXP1、CS、MSP-3、P126-CERP-SERA和GLURP。
37.用于體外診斷瘧疾的試劑盒，其至少包括權利要求1到7中任一項的肽的混合物或多肽。
38.權利要求37的試劑盒，其中所述抗原性肽或多肽結合于支持物。
39.權利要求37或38的試劑盒，還包括能夠使得所述抗原性肽或多肽與可能存在于所述生物學樣品中的抗體之間形成抗原/抗體復合物的試劑，以及使得能夠在體外檢測可能形成的抗原/抗體復合物的試劑。
40.對可能感染惡性瘧原蟲的個體進行體外瘧疾診斷的方法，其包括將來自所述個體的生物學樣品與權利要求26或權利要求27的抗體相接觸，所述接觸在能夠使得所述抗體與可能存在于所述生物學樣品中的特異于惡性瘧原蟲的抗原之間形成抗原/抗體復合物的條件下進行，并在體外檢測可能形成的抗原/抗體復合物。
41.一種用于體外診斷瘧疾的試劑盒，其包括權利要求26或權利要求27的抗體。
42.權利要求41的試劑盒，還包括能夠使得所述抗體與生物學樣品中可能存在的LSA-5抗原之間形成抗原/抗體復合物的試劑，以及使得能夠在體外檢測可能形成的抗原/抗體復合物的試劑。
43.編碼權利要求1到11中任一項的肽混合物的抗原性肽或多肽的分離的核苷酸序列。
44.一種重組核苷酸序列，其包括啟動子序列和編碼權利要求1到11中任一項的肽混合物的抗原性肽或多肽的分離的核苷酸序列。
45.權利要求43或44的核苷酸序列，其包括SEQ ID No18的序列。
46.一種重組克隆和/或表達載體，其包括權利要求43到45中任一項的核苷酸序列。
47.權利要求46的重組克隆和/或表達載體，其中為了在宿主細胞內的表達，所述核苷酸序列處于與宿主細胞同源或異源的啟動子和調節(jié)元件的控制之下。
48.權利要求46或47的表達載體在制備用于抗惡性瘧原蟲的基因免疫接種的藥物中的用途。
49.一種DNA疫苗，其包括權利要求43到45中任一項的核苷酸序列。
50.一種重組宿主細胞，其以權利要求45的載體轉化。
51.權利要求50的宿主細胞，其是細菌、酵母、昆蟲細胞、或哺乳動物細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗瘧疾。更具體地，本發(fā)明基于新的肝期和子孢子期惡性瘧原蟲抗原(稱作LSA－5)的表征。該抗原具有高度的抗原性，生活在疫區(qū)的個體體內的抗體發(fā)生率是極高的(總計90％)。本發(fā)明涉及包括LSA－5的部分序列的抗原性肽、肽混合物、或多肽、混合表位以及綴合物、以及包括這些物質的免疫原性組合物、疫苗和試劑盒。
文檔編號C07K17/00GK1922202SQ200480041742
公開日2007年2月28日 申請日期2004年12月15日 優(yōu)先權日2003年12月15日
發(fā)明者皮埃爾·德呂耶, 卡里馬·卜拉西米－澤格希杜爾 申請人:巴斯德研究院