專(zhuān)利名稱(chēng)：篩選高親和力抗體的方法
篩選高親和力抗體的方法本發(fā)明報(bào)告了基于抗體的熱力學(xué)參數(shù)確定高親和力抗體的方法，特別是基于過(guò)渡 態(tài)的熱力學(xué)評(píng)估結(jié)合熵，例如標(biāo)準(zhǔn)締合結(jié)合熵(associationbinding entropy, AS°|aSS )
和在抗原結(jié)合步驟過(guò)程中的熵負(fù)荷。
背景技術(shù)：
產(chǎn)生具有卓越的抗原特異性和超乎尋常的抗原復(fù)合體穩(wěn)定性的高親和力抗體是 診斷和治療抗體開(kāi)發(fā)的主要目標(biāo)。關(guān)于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的熱力學(xué)分析，最常用的技術(shù)是量熱法測(cè)定 (Chaires, J. B. , Annu. Rev. Biophys. 37(2008) 135-51 ；Perozzo, R.等 人’ J. Recept. Signal Transduct. Res. 24(1-2) (2004) 1-52 ；Li, L.等 A, Chem. Biol. Drug Des. 71(6) (2008)529-32 ；Liang, Y.，Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai)40(7)(2008)565-76 ； Thielges，M. C.等人，Biochemistry 47 (27) (2008) 7237-47)。反應(yīng)量熱確定所需的樣品量 高，例如至少125μ g/ml的抗體濃度和至少150 μ 1的樣品體積。此外，反應(yīng)量熱法需要高 的樣品純度且不耐受任何樣品雜質(zhì)或樣品異質(zhì)性，樣品緩沖液直接影響獲得的熱力學(xué)參數(shù) 的結(jié)果。反應(yīng)量熱法僅能夠解析平衡熱力學(xué)。表面等離振子共振(SPR)儀器測(cè)量(Roos, H.等人，J. Mol. Recognit. 11(1-6) (1998) 204-10 ；Van Regenmorte 1, Μ. H.等人，J. Mol. Recognit. 11 (1-6) (1998) 163-7 ； Gunnarsson, K. , Curr. Protoc. Immunol, 第 18 章，(2001)Unit 18. 6 ；Drake, Α. W.等 人，Anal. Biochem. 328 (1) (2004) 35-43 ；Kikuchi, Y.等人，J. Biosci. Bioeng. 100 (3)
(2005)311-7)允許以高通量方式快速測(cè)定溫度依賴性動(dòng)力學(xué)譜(參見(jiàn)例如，Canziani, G.A.等人，Anal. Biochem. 325(2) (2004)301-7 ；Safsten, P.等人，Anal. Biochem. 353(2)
(2006)181-190 ；Leonard, P.等人，J. Immunol. Methods 323 (2) (2007) 172-9)。ffassaf. D.等人(Anal. Biochem. 351 (2006) 241-253)報(bào)道了利用表面等離振子共 振微陣列高通量親和排列抗體。Roos, H.等人，J. Mol. Recognit. 11 (1998) 204-210中報(bào)道 了利用生物傳感技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用的熱力學(xué)分析。發(fā)明概述本發(fā)明提供了利用溫度不依賴性抗原復(fù)合體穩(wěn)定性選擇高親和力抗體的方法，特 征是焓驅(qū)動(dòng)的抗原締合，負(fù)的熵負(fù)荷和在抗原解離過(guò)程中大的熵改變。本發(fā)明的第一個(gè)方面是從結(jié)合抗原的多個(gè)抗體中選擇抗體的方法，所述方法包括 下列步驟-基于抗原的分子量?jī)?yōu)化表面等離振子共振測(cè)定中的信號(hào)應(yīng)答，從而在測(cè)定的溫 度范圍內(nèi)保持Rmax值恒定，-實(shí)施動(dòng)力學(xué)篩選步驟，包括根據(jù)通式(I)基于表面等離振子共振測(cè)定計(jì)算抗原 復(fù)合體穩(wěn)定性(I)抗原復(fù)合體穩(wěn)定性=(I"[BL (RU)-SL (RU)/BL (RU)])BL表示設(shè)置在抗原注射終點(diǎn)不久前的結(jié)合晚期(Binding Late)參照點(diǎn)，SL表示 設(shè)置在復(fù)合體解離期終點(diǎn)不久前的穩(wěn)定性晚期(lability Late)參照點(diǎn)，
-選擇具有大于95%復(fù)合體穩(wěn)定性的抗體，-在171、211、251、291、331和37°C，通過(guò)表面等離振子共振確定溫度依賴性 動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，-計(jì)算過(guò)渡態(tài)熱力學(xué)性質(zhì)，-基于溫度依賴性增加的抗原復(fù)合體締合速率常數(shù)Ka[l/Ms]，以及保留的或降低 的抗原復(fù)合體解離速率常數(shù)kd[l/s]選擇抗體。在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，-基于表面等離振子共振測(cè)定和利用熱力學(xué)篩選計(jì)算所述抗體的熱力學(xué)性質(zhì)，來(lái) 產(chǎn)生溫度依賴性動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，所述熱力學(xué)篩選是在17°C用107nM、在21°C用78nM、在25°C用 70nM、在用64nM、在33°C用58nM和在37°C用53nM的抗體濃度來(lái)實(shí)施的，和/或-熱力學(xué)性質(zhì)是焓驅(qū)動(dòng)的AHc^ass抗原復(fù)合體締合期和低于10J/K女mol的結(jié)合 熵 AS。Jass^ / 或-用解離期選擇抗體，所述解離期表現(xiàn)出負(fù)的或接近零的解離活化能 (EadiSS[kJ/mol])、負(fù)的解離焓(AIPtdiSS [kj/mol])和大的負(fù)解離熵(ASIdisS [kj/ mol])ο本發(fā)明的一個(gè)方面是生產(chǎn)抗體的方法，包括下列步驟a)提供多個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選是雜交瘤細(xì)胞或B細(xì)胞，每種細(xì)胞都表達(dá)抗體，b)在不同的溫度和不同的抗體濃度下，通過(guò)表面等離振子共振確定所述抗體與各 抗原結(jié)合的時(shí)間依賴量，c)基于等式(II)至(XIII)，(II)AG° = ΔΗ° _T*AS°(III) AG° =-R*T*lnKD(IV)InK11 =-1/T*( Δ H。/R)/斜率-(Δ S。/R)/截距(V)R*T*lnKD = ΔΗ° T0_T*AS° T0+AC° p (T-T0)—Τ* Δ Cp° 1η(Τ/Τ0)(VI) ka =。禪町)(VII) lnka/T = -1/T * (ΔΗ。$/Ε)/斜率 ++ lnkb/Α)織距(VIII) ka = A*e-WK*T(IX) Inka = InA/ 截距-(l/I^Ea/R) / 斜率(χ) Icd = (kb*T/A)*e(-·。揮町)(XI) lnkd/Τ = -1/T * (AH。$/R)/斜率 + (ASI/R + InkeZA)/截距(XII) kd = A*e-WK*T(XIII) Inkd = InA/ 截距-(l/I^Ea/R) / 斜率用b)中確定的時(shí)間依賴量至少計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)⑴標(biāo)準(zhǔn)締合結(jié)合熵(AS0Iass),(ii)標(biāo)準(zhǔn)解離結(jié)合熵(AS0Idiss)，(iii)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合熵(AS° )，(iv)自由(free)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合焓(AG° )，
(ν)標(biāo)準(zhǔn)解離自由結(jié)合焓(AG0Idiss)，(Vi)標(biāo)準(zhǔn)締合自由結(jié)合焓(AG0Iass),(vii)-T Δ S。，(viii)解離速率常數(shù)kd，(ix)平衡結(jié)合常數(shù)KD，和(χ)締合速率常數(shù)Ka，d)選擇生產(chǎn)這樣的抗體的細(xì)胞，所述抗體具有至少兩種下列的i)低于10J/K * mol的標(biāo)準(zhǔn)締合結(jié)合熵，ii)100J/mol * K或更高的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)解離結(jié)合熵，iii)100J/mol * K或更高的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合熵，e)在適合所述抗體表達(dá)的條件下，通過(guò)培養(yǎng)所述選定的細(xì)胞生產(chǎn)抗體，并從細(xì)胞 和/或培養(yǎng)基中回收所述抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括一個(gè)或多個(gè)下列額外的步驟-在a)之后和b)之前al)培養(yǎng)a)的細(xì)胞，并提供培養(yǎng)上清液，所述培養(yǎng)上清液 分別含有由所述細(xì)胞表達(dá)的抗體，-在d)之后和步驟e)之前dl)從所述選定的細(xì)胞中分離編碼所述抗體的核酸， 基于所述分離的核酸提供另一種核酸，所述另一種核酸編碼所述抗體的嵌合的、CDR移植 的、T細(xì)胞表位缺失的和/或人源化的變體，提供在表達(dá)盒中含有所述修飾的核酸的表達(dá)質(zhì) 粒，和用所述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、COS細(xì)胞或PER. C6細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于從多個(gè)抗體中選擇溫度不依賴性抗原結(jié)合抗體的方 法，例如，用于治療性處理，從而用低于10J/K * mol的標(biāo)準(zhǔn)締合結(jié)合熵(AS0Iass)選擇抗 體。在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，用至少下列2種選擇抗體a)低于10J/K * mol的標(biāo)準(zhǔn)締合結(jié)合熵(AS°|aSS ),b) I00j/mol * κ或更高的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)解離結(jié)合熵(AS°|diss)，c)100J/mol * K或更高的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合熵(AS° )。在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)締合結(jié)合熵(AS0Iass)低于5J/K 女mol。在另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)締合結(jié)合熵(AS0Iass )低于0J/K rnol。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)解離結(jié)合熵(ASIdiss )是125J/mol * K或更高。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)解離結(jié)合熵(ASc5IcUss )是I50j/mol * κ或更高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，絕 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合熵)是125J/mol * K或更高。在另一個(gè)實(shí)施方案中，絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合熵 (AS° )是 150J/mol * K 或更高。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，方法的特征是用-50kJ/mol或更低的自由標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合 焓)選擇抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的特征是用標(biāo)準(zhǔn)解離自由結(jié)合焓 (AG0Idiss)比標(biāo)準(zhǔn)締合自由結(jié)合焓(AGIass)的比例來(lái)選擇抗體，所述比例大于2. 3。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法的特征是用以下的-τ △ S。值選擇抗體
a) -80k J/mo 1 或更低，或b)+40kj/mol 或更高。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于從多個(gè)抗體中選擇溫度不依賴性抗原結(jié)合抗體的方 法，例如用于藥物組合物，包括這樣的步驟，所述步驟是用隨著溫度增加而保持在相同數(shù)量 級(jí)，或降低至多兩個(gè)數(shù)量級(jí)的解離速率常數(shù)kd(l/s)選擇抗體。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于從多個(gè)抗體中選擇溫度不依賴性抗原結(jié)合抗體的方 法，例如用于藥物組合物，包括這樣的步驟，所述步驟是用隨著溫度增加而保持恒定或降低 的平衡結(jié)合常數(shù)kD (M)選擇抗體。在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，溫度范圍是從13°C至37°C。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于從多個(gè)抗體中選擇溫度不依賴性抗原結(jié)合抗體的方 法，例如用于藥物組合物，包括步驟i)確定溫度-依賴性動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，ii)計(jì)算過(guò)渡態(tài)(TS)熱力學(xué)性質(zhì)，和iii)基于熱力學(xué)行為選擇抗體。在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，特征是所述熱力學(xué)行為是溫度依賴性 增加的抗原復(fù)合體締合速率常數(shù)ka[l/Ms]，和保持的或降低的抗原復(fù)合體解離速率常數(shù) kd[i/s]。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述熱力學(xué)行為是焓驅(qū)動(dòng)的AHc^ass抗原復(fù)合體締合期， 和低于ioj/κ女mol的結(jié)合熵ASc^asso在另一個(gè)實(shí)施方案中，用解離期選擇抗體，所述解 離期表現(xiàn)出負(fù)的或接近零的解離活化能(EadiSS[kJ/mol])、負(fù)的解離焓(AHIdiSS [kj/ mol])和大的負(fù)解離熵([kj/mol])。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)表面等離振子共振確定溫度依賴性動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，并包 括動(dòng)力學(xué)篩選步驟和熱力學(xué)篩選步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述動(dòng)力學(xué)篩選步驟包括基于 表面等離振子共振測(cè)定根據(jù)通式(I)計(jì)算抗原復(fù)合體穩(wěn)定性(I)抗原復(fù)合體穩(wěn)定性=(I"[BL (RU)-SL (RU)/BL (RU)])BL表示設(shè)置在抗原注射終點(diǎn)不久前的結(jié)合晚期參照點(diǎn)，SL表示設(shè)置在復(fù)合體解 離期終點(diǎn)不久前的穩(wěn)定性晚期參照點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括基于抗原的分子量 優(yōu)化表面等離振子共振測(cè)定中的信號(hào)應(yīng)答的步驟，從而在測(cè)定的溫度范圍內(nèi)保持ILx值恒定。在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，特征是所述通過(guò)表面等離振子共振測(cè)定 包括下列步驟a)通過(guò)結(jié)合在固體支持表面上的捕獲分子將抗體固定在所述固體支持表面上，b)提供包含抗原的溶液，c)將含有已知濃度的抗原的溶液流經(jīng)固體支持表面，從而允許抗原與固定化抗體 的締合，d)將不含抗原的溶液流經(jīng)固體支持表面，從而允許抗原從固定化抗體上解離，e)在步驟C)和d)的過(guò)程中監(jiān)控與固體支持表面結(jié)合的抗原的時(shí)間依賴量，并收 集結(jié)合數(shù)據(jù)，其中用不同濃度的抗原重復(fù)步驟c)和d)至少1次，和f)通過(guò)將e)中獲得的結(jié)合數(shù)據(jù)擬合到預(yù)定模型中，計(jì)算動(dòng)力學(xué)和/或熱力學(xué)參 數(shù)，所述預(yù)定模型是基于等式(II)至(XIII)用于抗原和固定化抗體之間相互作用的模型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體的固定通過(guò)物種特異性抗體捕獲分子進(jìn)行。本發(fā)明的一個(gè)方面是藥物組合物，所述組合物包含用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的抗體在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)選擇具有大于95%的復(fù)合體穩(wěn)定性的抗體，來(lái)實(shí)施動(dòng)力 學(xué)篩選中的抗體選擇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基于抗原的分子量?jī)?yōu)化抗原信號(hào)應(yīng)答。本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過(guò)表面等離振子共振選擇抗體的方法，其中產(chǎn)生溫度依 賴性動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)從而計(jì)算過(guò)渡態(tài)(TS)的熱力學(xué)性質(zhì)，并基于熱力學(xué)行為來(lái)選擇抗體，其中 所述溫度依賴性動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的產(chǎn)生是基于表面等離振子共振測(cè)定和利用熱力學(xué)篩選進(jìn)行 的所述抗體的熱力學(xué)性質(zhì)計(jì)算，所述熱力學(xué)篩選是在17°c用107nM、在21°C用78nM、在25°C 用70nM、在29°C用64nM、在33°C用58nM和在37°C用53nM的抗體濃度來(lái)實(shí)施的。發(fā)明詳述本發(fā)明報(bào)告了選擇與抗原結(jié)合的抗體的方法，特征是產(chǎn)生溫度依賴性的動(dòng)力學(xué)數(shù) 據(jù)從而計(jì)算過(guò)渡態(tài)(TS)的熱力學(xué)性質(zhì)，和基于熱力學(xué)行為選擇抗體。已發(fā)現(xiàn)基于表面等離振子共振的動(dòng)力學(xué)方法比傳統(tǒng)的量熱法測(cè)定有若干優(yōu)勢(shì)-能夠進(jìn)行高通量處理，_低樣品消耗，-測(cè)量親和力(affinity)取代親合力(avidity)，和-使用粗制的細(xì)胞上清液或復(fù)雜的培養(yǎng)混合物。表面等離子生物傳感表面是親和力基質(zhì)，用于例如從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中捕獲抗 體。因此，可以使用粗制的和復(fù)雜的混合物作為樣品。由于相互作用的搭檔之一固定在傳感 器的表面上，而將第二種化合物注射到流動(dòng)系統(tǒng)中，因此能夠測(cè)量平衡和過(guò)渡態(tài)的熱力學(xué)， 因?yàn)镕IA(流動(dòng)注射分析)系統(tǒng)可以獨(dú)立的監(jiān)控復(fù)合體的締合和解離期。利用該技術(shù)，能夠 計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)-自由標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合焓ΔG。，-標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合焓ΔΗ°，-標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合熵AS°，和過(guò)渡態(tài)參數(shù)-自由標(biāo)準(zhǔn)締合焓AG0Iass,
-標(biāo)準(zhǔn)締合焓 AHQ:j:ass,-標(biāo)準(zhǔn)締合熵AS0Iass,-活化能Eaass，-自由標(biāo)準(zhǔn)解離能AGIdiss,-標(biāo)準(zhǔn)解離焓AHIdiss,-標(biāo)準(zhǔn)解離熵ASIdiss^-解離能Eadiss。在使用非線性范特霍夫等式(van，t Hoff equation)的情況下，確定ACp值。本發(fā)明的一個(gè)方面是基于其熱力學(xué)特征選擇抗體的方法。通常，基于SPR的動(dòng)力學(xué)抗體篩選(參見(jiàn)例如，Steukers, M.等人，J. Immunol. Methods 310 (1-2) (2006) 126-35 ；Rich, R. L.等人，Anal. Biochem. 361 (1) (2007) 1-6)后續(xù) 第二個(gè)步驟為更高解析度的熱力學(xué)sra分析。
利用本發(fā)明方法可以選擇抗體，所述抗體在升高的溫度下具有至少恒定的或增加 的親和力，即在升高的溫度下至少恒定或增加的抗原復(fù)合體穩(wěn)定性?？乖瓘?fù)合體穩(wěn)定性是 抗體篩選工藝中的主要選擇標(biāo)準(zhǔn)。僅選擇原代細(xì)胞培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物生產(chǎn)分別在25°c或 37°C下具有高穩(wěn)定性抗原復(fù)合體的抗體。產(chǎn)生生產(chǎn)抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物，并在一個(gè)實(shí)施方案中進(jìn)行高通量分析，其中為了計(jì) 算過(guò)渡態(tài)(TS)的熱力學(xué)性質(zhì)，產(chǎn)生溫度依賴性的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。根據(jù)本發(fā)明方法，基于其熱 力學(xué)行為進(jìn)行抗體選擇。在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，選定的抗體的特征是溫度依賴性增加的抗原復(fù)合體 締合速率常數(shù)Ka[l/Ms]，以及保持的或降低的抗原復(fù)合體解離速率常數(shù)kd[l/s]。此類(lèi)抗體 通常特征是焓驅(qū)動(dòng)的AHIass抗原復(fù)合體締合期和負(fù)的結(jié)合熵ASIass，其在本申請(qǐng)中 表示“熵負(fù)荷”。用本發(fā)明方法選定的抗體的特征是抗原相互作用機(jī)制，表現(xiàn)為在結(jié)合平衡 中大的熵改變。該熵貢獻(xiàn)(entropic contribution)來(lái)自抗體-抗原復(fù)合體解離步驟，其 中發(fā)生了解離熵ASc^diss的大的正改變和大的負(fù)改變。此外，用本發(fā)明方法選定的抗體可 以具有源自抗原解離期的熱力學(xué)異常，其中在升高的溫度下解離速率常數(shù)kd[l/s]令人驚 訝的和預(yù)料之外的降低。此類(lèi)抗體的特征由熱力學(xué)參數(shù)表征，例如i)表現(xiàn)出負(fù)的或接近零 的解離活化能EadiSS [kj/mol]的解離期，ii)負(fù)的解離焓AHc^diSS [kj/mol]，和iii)大 的負(fù)解離熵ASc^diss [kj/mol]。需要指出的是這是該效應(yīng)的完全理論的處理。因此，本發(fā)明的方法允許基于熱力學(xué)參數(shù)從大量的高親和力抗體中選擇抗體，所 述參數(shù)提供了選定的抗體與抗原的相互作用模式的基礎(chǔ)，即，抗體誘導(dǎo)抗原的構(gòu)象改變或 抗體本身經(jīng)歷了構(gòu)象改變。因此，方法可用于選擇生產(chǎn)具有高的抗原復(fù)合體穩(wěn)定性的抗體 的 細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括動(dòng)力學(xué)篩選步驟和熱力學(xué)篩選步驟。對(duì)于 動(dòng)力學(xué)篩選，在抗原注射終點(diǎn)不久前設(shè)置結(jié)合晚期(BL)參照點(diǎn)，在復(fù)合體解離期終點(diǎn)不久 前設(shè)置穩(wěn)定性晚期(SL)參照點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用X-Y-點(diǎn)示BL和SL數(shù)據(jù)，X軸 顯示結(jié)合晚期參照點(diǎn)的應(yīng)答單位(RU)值，Y軸以應(yīng)答單位(RU)顯示穩(wěn)定性晚期參照點(diǎn)的 值(示例性的點(diǎn)圖參見(jiàn)

圖1)。此外，基于BL和SL數(shù)據(jù)，可以根據(jù)通式(I)計(jì)算抗原復(fù)合體 穩(wěn)定性抗原復(fù)合體穩(wěn)定性=(1-[BL(RU)-SL (RU)/BL (RU)]) (I)在另一個(gè)實(shí)施方案中，是通過(guò)X-Y點(diǎn)示了 BL和抗原復(fù)合體穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，X軸 以應(yīng)答單位(RU)顯示結(jié)合晚期參照點(diǎn)的值，Y軸顯示針對(duì)復(fù)合體穩(wěn)定性的百分比值(示例 性的點(diǎn)圖參見(jiàn)圖2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在25°C實(shí)施動(dòng)力學(xué)篩選步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，在37°C實(shí)施動(dòng)力學(xué)篩選步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在13°C和42°C之間的一組兩個(gè)或 多個(gè)不同的溫度實(shí)施動(dòng)力學(xué)篩選步驟。在熱力學(xué)篩選之前，在一個(gè)實(shí)施方案中，使用RPMI 1640培養(yǎng)基在100ml旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 瓶中培養(yǎng)單細(xì)胞保藏的克隆。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在熱力學(xué)篩選之前，通過(guò)蛋白A瓊脂糖 (TM)柱色譜，從上清液中純化抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于熱力學(xué)篩選的系統(tǒng)緩沖液是 HBS-EP0在另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品緩沖液添加了 lmg/ml羧甲基葡聚糖，以降低非特異性 的傳感基質(zhì)效應(yīng)。下文可以以抗人PTH抗體的分析作為一個(gè)實(shí)例，描述本發(fā)明的方法。該實(shí)例不需理解為對(duì)本發(fā)明方法的限制，其實(shí)際上是為了示例本發(fā)明方法的教導(dǎo)而存在的。本申請(qǐng)的 范圍敘述在權(quán)利要求中。在第一步中，實(shí)施雜交瘤上清液的動(dòng)力學(xué)篩選。圖1示意了來(lái)自549雜交瘤原代 培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)多次免疫和融合行動(dòng)的結(jié)合晚期數(shù)據(jù)和穩(wěn)定性晚期數(shù)據(jù)。選擇具有充分的抗原 應(yīng)答(BL)和緩慢的抗原復(fù)合體解離(SL)的雜交瘤細(xì)胞用于進(jìn)一步的篩選步驟。例如，使 用編號(hào)123、119、499、133和295的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)處理(參見(jiàn)圖1中的圓圈)，由于不充分的 復(fù)合體穩(wěn)定性拋棄了編號(hào)189、263和341的細(xì)胞(參見(jiàn)圖1中 的方框)。為了便于鑒別具有高抗原應(yīng)答和高復(fù)合體穩(wěn)定性的抗體，可以使用圖表，在所述 圖表中，以]表示的獲得的復(fù)合體穩(wěn)定性相對(duì)于結(jié)合晚期應(yīng)答信號(hào)繪制(參見(jiàn)例如圖 2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于動(dòng)力學(xué)篩選中的抗體選擇，選擇具有95%或更高的復(fù)合體穩(wěn)定 性的高抗原復(fù)合體穩(wěn)定性結(jié)合子。使用基于SPR的測(cè)量的大部分出版物不使用抗體捕獲系統(tǒng)作為傳感器表面呈遞 技術(shù)。通常，抗體或其片段共價(jià)的固定在傳感器上。該技術(shù)不可以高通量形式使用，因?yàn)楸?面不適合多目的的抗體呈遞，除了其技術(shù)上受配體固定的傳感器數(shù)目限制以外。如果使用捕獲系統(tǒng)進(jìn)行熱力學(xué)測(cè)量，抗體捕獲水平隨動(dòng)力學(xué)的溫度靈敏度而改變 (參見(jiàn)圖15)。為了使用用于熱力學(xué)的抗體捕獲系統(tǒng)，絕對(duì)需要保證同質(zhì)的、溫度不依賴性 的抗體捕獲水平。在低溫下，熱力學(xué)測(cè)量有兩個(gè)主要的問(wèn)題。第一，在低溫下，抗體捕獲系統(tǒng)的動(dòng)力 學(xué)太緩慢而不能捕獲足夠的二級(jí)抗體進(jìn)行分析。第二，抗原_抗體相互作用的動(dòng)力學(xué)也減 慢。動(dòng)力學(xué)顯示，由于在4°C和irC的緩慢的動(dòng)力學(xué)導(dǎo)致強(qiáng)烈的損失了測(cè)定解析度。在完 整的溫度范圍內(nèi)未能實(shí)現(xiàn)任何平衡。在溫度梯度中，Rmax值小且非同質(zhì)的。隨著增加溫度， 由于二級(jí)抗體更快的締合速率，捕獲的mAb的量同步增加。隨著增加溫度，抗原動(dòng)力學(xué)也 加速，且抗原Rmax值增加。由于未達(dá)到任何平衡，故這些測(cè)定的Rmax值更確切的是試錯(cuò)的 (error-prone) 0非同質(zhì)的傳感器性能導(dǎo)致熱力學(xué)計(jì)算的高誤差。計(jì)算的參數(shù)都不能達(dá)到 95%顯著性。因此，需要優(yōu)化實(shí)驗(yàn)使用的溫度梯度以及傳感器表面的制備。已發(fā)現(xiàn)，主要通過(guò) 抗體捕獲系統(tǒng)的溫度依賴性滴度，利用優(yōu)化的溫度梯度和調(diào)試的注射時(shí)間，來(lái)優(yōu)化傳感器 的性能，使得在完整的運(yùn)行過(guò)程中Rmax值是恒定的。圖15中比較了結(jié)果。Rmax平均值是 35RU+/-3RU。在> 30°C的溫度下達(dá)到平衡。本文使用的最低溫度是15°C。表1比較了 關(guān)于平衡的(線性范特霍夫)、締合期的(Eyring和Arrhenius)和解離期的(Eyring和 Arrhenius)熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算，利用傳統(tǒng)測(cè)定與優(yōu)化測(cè)定進(jìn)行比較。表1 在非優(yōu)化和優(yōu)化形式中相互作用的熱力學(xué)
權(quán)利要求
1.從多個(gè)抗體中選擇抗體的方法，所述方法包括下列步驟-基于抗原的分子量?jī)?yōu)化表面等離振子共振測(cè)定中的信號(hào)應(yīng)答，從而在測(cè)定的溫度范 圍內(nèi)保持Rmax值恒定，-實(shí)施動(dòng)力學(xué)篩選步驟，包括基于表面等離振子共振測(cè)定根據(jù)通式(I)計(jì)算抗原復(fù)合 體穩(wěn)定性(I)抗原復(fù)合體穩(wěn)定性=(I"[BL (RU)-SL (RU)/BL (RU)])BL表示設(shè)置在抗原注射終點(diǎn)不久前的結(jié)合晚期參照點(diǎn)，SL表示設(shè)置在復(fù)合體解離期 終點(diǎn)不久前的穩(wěn)定性晚期參照點(diǎn)，-選擇具有大于95%復(fù)合體穩(wěn)定性的抗體，-在171、211、251、291、331和37°C，通過(guò)表面等離振子共振確定溫度依賴性動(dòng)力 學(xué)數(shù)據(jù)，-基于等式(II)至(XIII)，計(jì)算過(guò)渡態(tài)熱力學(xué)性質(zhì)，-基于溫度依賴性增加的抗原復(fù)合體締合速率常數(shù)Ka[l/Ms]，以及保持的或降低的抗 原復(fù)合體解離速率常數(shù)kd[l/s]選擇抗體。
2.權(quán)利要求1的方法，特征是-所述熱力學(xué)性質(zhì)是焓驅(qū)動(dòng)的AHc^ass抗原復(fù)合體締合期和低于10J/K * mol的結(jié)合 熵 AS。Jass^ / 或-用解離期選擇抗體，所述解離期表現(xiàn)出負(fù)的或接近零的解離活化能(fedissDa/ mol])、負(fù)的解離焓(AH。|diss [kj/mol])和大的負(fù)解離熵(AS。|diss [kj/mol])。
3.用于從多個(gè)抗體中選擇溫度不依賴性抗原結(jié)合抗體的方法，例如，用于治療性處理， 其中用低于10J/K女mol的標(biāo)準(zhǔn)締合結(jié)合熵(AS0Iass)選擇抗體。
4.權(quán)利要求3的方法，特征是用至少下列2種選擇抗體a)低于10J/K* mol的標(biāo)準(zhǔn)締合結(jié)合熵(AS°|aSS ),b)100J/mol * K或更高的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)解離結(jié)合熵(AS0Idiss)， C) 100J/mol K或更高的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合熵(Δ S° )。
5.權(quán)利要求3或4的方法，特征是標(biāo)準(zhǔn)締合結(jié)合熵(AS0Iass)低于5J/K * mol。
6.權(quán)利要求3-5的任一項(xiàng)的方法，特征是標(biāo)準(zhǔn)締合結(jié)合熵(AS0Iass)低于0J/K*mol ο
7.權(quán)利要求3-6的任一項(xiàng)的方法，特征是絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)解離結(jié)合熵(AS0Idiss)是125J/ mol -k K或更高。
8.權(quán)利要求3-7的任一項(xiàng)的方法，特征是絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)解離結(jié)合熵(AS0Idiss)是150J/ mol -k K或更高。
9.權(quán)利要求3-8的任一項(xiàng)的方法，特征是絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合熵(AS°)是125J/mol女K 或更高。
10.權(quán)利要求3-9的任一項(xiàng)的方法，特征是絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合熵(AS°)是150J/mol女K或更高。
11.權(quán)利要求3-10的任一項(xiàng)的方法，特征是用-50kJ/mol或更低的自由標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合焓(AG0 )選擇抗體。
12.權(quán)利要求3-11的任一項(xiàng)的方法，特征是用標(biāo)準(zhǔn)解離自由結(jié)合焓(AG0Idiss)與標(biāo) 準(zhǔn)締合自由結(jié)合焓(AG0Iass)大于2. 3的比例來(lái)選擇抗體。
13.權(quán)利要求3-12的任一項(xiàng)的方法，特征是用以下的-TΔ S。值選擇抗體a)-80kJ/mol或更低，或b)+40kj/mol或更高。
14.用于從多個(gè)抗體中選擇溫度不依賴性抗原結(jié)合抗體的方法，包括用隨著溫度增加 而保持在相同數(shù)量級(jí)，或降低至多兩個(gè)數(shù)量級(jí)的解離速率常數(shù)kd(l/s)選擇抗體的步驟。
15.用于從多個(gè)抗體中選擇溫度不依賴性抗原結(jié)合抗體的方法，包括用隨著溫度增加 而保持恒定或降低的平衡結(jié)合常數(shù)kD(M)選擇抗體的步驟。
16.權(quán)利要求3-15的任一項(xiàng)的方法，特征是溫度范圍從13°C至37°C。
17.用于從多個(gè)抗體中選擇溫度不依賴性抗原結(jié)合抗體的方法，包括步驟i)確定溫度-依賴性動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)， )計(jì)算過(guò)渡態(tài)(化)熱力學(xué)性質(zhì)，和iii)基于熱力學(xué)行為選擇抗體。
18.權(quán)利要求17的方法，特征是所述熱力學(xué)行為是溫度依賴性增加的抗原復(fù)合體締合 速率常數(shù)ka[l/Ms]，和保持的或降低的抗原復(fù)合體解離速率常數(shù)kd[l/s]。
19.權(quán)利要求17或18的方法，特征是所述熱力學(xué)行為是焓驅(qū)動(dòng)的AHc^ass抗原復(fù)合 體締合期，和低于10J/K * mol的結(jié)合熵AS°:j:ass0
20.權(quán)利要求17-19的任一項(xiàng)的方法，特征是用解離期選擇抗體，所述解離期表現(xiàn)出負(fù) 的或接近零的解離活化能(EadiSS[kJ/mol])、負(fù)的解離焓(AHIdiSS [kj/mol])和大的 負(fù)解離熵(AS°|diss [kj/mol])。
21.權(quán)利要求3-20的任一項(xiàng)的方法，特征是通過(guò)表面等離振子共振確定溫度依賴性動(dòng) 力學(xué)數(shù)據(jù)，并包括動(dòng)力學(xué)篩選步驟和熱力學(xué)篩選步驟。
22.權(quán)利要求21的方法，特征是所述動(dòng)力學(xué)篩選步驟包括基于表面等離振子共振測(cè)定 根據(jù)通式(I)計(jì)算抗原復(fù)合體穩(wěn)定性(I)抗原復(fù)合體穩(wěn)定性=(1-[BL(RU)-SL(RU)/BL(RU)]),BL表示設(shè)置在抗原注射終點(diǎn)不久前的結(jié)合晚期參照點(diǎn)，SL表示設(shè)置在復(fù)合體解離期 終點(diǎn)不久前的穩(wěn)定性晚期參照點(diǎn)。
23.權(quán)利要求21或22的方法，特征是方法包括基于抗原的分子量?jī)?yōu)化表面等離振子共 振測(cè)定中的信號(hào)應(yīng)答的步驟，從而在測(cè)定的溫度范圍內(nèi)保持Rmax值恒定。
24.權(quán)利要求21-23的任一項(xiàng)的方法，特征是所述通過(guò)表面等離振子共振測(cè)定包括下 列步驟a)通過(guò)結(jié)合在固體支持表面上的捕獲分子將抗體固定在所述固體支持表面上，b)提供包含抗原的溶液，c)將含有已知濃度的抗原的溶液流經(jīng)固體支持表面，從而允許抗原與固定化抗體的締合，d)將不含抗原的溶液流經(jīng)固體支持表面，從而允許抗原從固定化抗體上解離，e)在步驟c)和d)的過(guò)程中監(jiān)控與固體支持表面結(jié)合的抗原的時(shí)間依賴量，并收集結(jié) 合數(shù)據(jù)，其中用不同濃度的抗原重復(fù)步驟c)和d)至少1次，和f)通過(guò)將e)中獲得的結(jié)合數(shù)據(jù)擬合到預(yù)定模型中，計(jì)算動(dòng)力學(xué)和/或熱力學(xué)參數(shù)，所 述預(yù)定模型基于等式(II)至(XIII)用于抗原和固定化抗體之間的相互作用。
25.權(quán)利要求對(duì)的方法，特征是通過(guò)物種特異性抗體捕獲分子固定所述抗體。
26.權(quán)利要求17-25的任一項(xiàng)的方法，特征是通過(guò)用大于95%的復(fù)合體穩(wěn)定性選擇抗 體，來(lái)實(shí)施動(dòng)力學(xué)篩選。
27.權(quán)利要求21-26的任一項(xiàng)的方法，特征是基于抗原的分子量?jī)?yōu)化抗原信號(hào)應(yīng)答。
28.用于生產(chǎn)抗體的方法，包括下列步驟a)提供多個(gè)細(xì)胞，每種細(xì)胞都表達(dá)抗體，b)在不同的溫度和不同的抗體濃度下，通過(guò)表面等離振子共振確定與各抗原結(jié)合的所 述抗體的時(shí)間依賴量，c)基于等式(II)至(XIII)，(II)= ΔΗ° -T*AS°(III)AG° =-R*T*lnKD(IV)InK11= _1/Τ*( Δ H° /R)/斜率-(Δ S。/R)/截距(V)R*T*lnKD= ΔΗ° T0_T*AS° T0+AC° ρ (T-T0)-Τ* Δ Cp° 1η(Τ/Τ0)(VI)ka = (kb*T/A)*e(-AG°_*T)(VII)lnka/T = -1/Τ * (AH。J/R)/斜率 + (AB°i*R + InkbZA)/截距(VHDka = A*e-Ea/E*T(IX)Inka = InA/ 截距-(l/T*Ea/R) / 斜率(X)kd = (kb*m)*eWi/R*T)(XI)lnk/Γ = -1/Τ * (ΔΗΙ/R)/斜率 + (AS0JZR + Inke/A)/截距(XH)kd = A*e-Ea/E*T(XIII) Inkd = InA/ 截距-(1/I^Ea/R) / 斜率 用b)中確定的時(shí)間依賴量至少計(jì)算熱力學(xué)參數(shù) ⑴標(biāo)準(zhǔn)締合結(jié)合熵(AS0Iass),(ii)標(biāo)準(zhǔn)解離結(jié)合熵(AS°:j:diss)，(iii)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合熵(as°)，(iv)自由標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合焓(AG°)，(V)標(biāo)準(zhǔn)解離自由結(jié)合焓(AGQ|diss)，(vi)標(biāo)準(zhǔn)締合自由結(jié)合焓(AG0Iass),(vii)-TAS°，(viii)解離速率常數(shù)kd，(ix)平衡結(jié)合常數(shù)KD，和(x)締合速率常數(shù)Ka，d)選擇生產(chǎn)這樣的抗體的細(xì)胞，所述抗體具有至少兩種下列的i)低于10J/K女mol的標(biāo)準(zhǔn)締合結(jié)合熵，ii)100J/mol* K或更高的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)解離結(jié)合熵，iii)100J/molK或更高的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合熵，e)在適合所述抗體表達(dá)的條件下，通過(guò)培養(yǎng)所述選定的細(xì)胞生產(chǎn)抗體，并從細(xì)胞和/ 或培養(yǎng)基中回收所述抗體。
29.權(quán)利要求觀的方法，包括一個(gè)或多個(gè)下列額外的步驟-在a)之后和b)之前al)培養(yǎng)a)的細(xì)胞，并提供培養(yǎng)上清液，所述培養(yǎng)上清液分別 含有由所述細(xì)胞表達(dá)的抗體，-在d)之后和步驟e)之前dl)從所述選定的細(xì)胞中分離編碼所述抗體的核酸，基于 所述分離的核酸提供另一種核酸，所述另一種核酸編碼所述抗體的嵌合的、CDR移植的、T 細(xì)胞表位缺失的和/或人源化的變體，提供在表達(dá)盒中含有所述修飾的核酸的表達(dá)質(zhì)粒， 和用所述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、COS細(xì)胞或PER. C6 細(xì)胞。
30.藥物組合物，包含權(quán)利要求1- 的任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的抗體。
全文摘要
本發(fā)明報(bào)告了用于生產(chǎn)抗體的方法，包括步驟a)提供多個(gè)雜交瘤細(xì)胞，每種細(xì)胞都表達(dá)抗體，b)在不同的溫度和不同的抗體濃度下，通過(guò)表面等離振子共振確定所述抗體與各抗原結(jié)合的時(shí)間依賴量，c)基于等式(II)至(XIII)，用b)中確定的時(shí)間依賴量至少計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)(i)標(biāo)準(zhǔn)締合結(jié)合熵式(A)，(ii)標(biāo)準(zhǔn)解離結(jié)合熵式(B)，(iii)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合熵(ΔS°)，(iv)自由標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合焓(ΔG°)，(v)標(biāo)準(zhǔn)解離自由結(jié)合焓式(C)，(vi)標(biāo)準(zhǔn)締合自由結(jié)合焓式(D)，(vii)-TΔS°，(viii)解離速率常數(shù)kd，(ix)平衡結(jié)合常數(shù)KD，和(x)締合速率常數(shù)Ka，d)選擇生產(chǎn)這樣的抗體的雜交瘤細(xì)胞，所述抗體具有至少兩種下列的i)低于10J/K＊mol的標(biāo)準(zhǔn)締合結(jié)合熵，ii)100J/mol＊K或更高的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)解離結(jié)合熵，iii)100J/mol＊K或更高的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合熵，e)在適合所述抗體表達(dá)的條件下，通過(guò)培養(yǎng)所述選定的細(xì)胞生產(chǎn)抗體，并從細(xì)胞或/和培養(yǎng)基中回收所述抗體。
文檔編號(hào)G01N21/55GK102132143SQ200980133062
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2009年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月27日
發(fā)明者普羅夫 L·范, M·施拉伊姆爾 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司