專利名稱：一種高親和力鐮刀菌特異單鏈抗體及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種高親和力鐮刀菌特異單鏈抗體， 同時還涉及一種高親和力鐮刀菌特異單鏈抗體的制備方法，還涉及一種高親和力鐮刀菌特異單鏈抗體的用途。
背景技術(shù)：
赤霉病(Fusarium head blight, FHB)是世界溫暖潮濕和半潮濕麥區(qū)廣泛發(fā)生的一禾中危害小麥(Triticum aestivum)、大麥(Hordeum vulgare)、燕麥(Avena sativa L.)、 玉米(Zea mays L.)、水稻(Oryza sativa)、黑麥(Secale cereale L.)等谷類作物的真菌病害，影響作物的生長發(fā)育狀況及籽粒質(zhì)量，對經(jīng)濟生活造成嚴(yán)重的損失。在我國小麥感染赤霉病的面積達(dá)到700萬hm2，約占全國小麥總面積的1/4。赤霉病是由多種鐮刀菌引起的，禾谷鐮刀菌亞洲種(Fusarium asiaticum)是我國小麥赤霉病的優(yōu)勢致病種群。禾谷鐮刀菌侵染作物后可在籽粒上產(chǎn)生多種毒素，如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol， DON)、雪腐鐮刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)、玉米赤霉烯酮(karalenone，^N)、伏馬菌素 (Fumonisins, FBs)、T-2毒素等，這些毒素能抑制真核生物細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，破壞人和動物的免疫系統(tǒng)，使人畜中毒，表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、免疫功能下降等，對人畜健康造成重大隱患。目前赤霉病抗源匱乏極大地限制了小麥抗赤霉病育種的進(jìn)展。迄今為止，還未發(fā)現(xiàn)對赤霉病完全免疫的小麥品種。以傳統(tǒng)雜交方法培育抗性品種、對病原菌及其宿主載體噴灑化學(xué)農(nóng)藥和依靠農(nóng)業(yè)輪作套種是常用的防控赤霉病的主要策略。隨著生物科學(xué)，尤其是以基因工程為核心的生物技術(shù)的發(fā)展，將不同來源的抗病基因?qū)胫参?，在分子水平上定向重組遺傳物質(zhì)，相比傳統(tǒng)育種和化學(xué)防控，其不受物種間屏障影響及減少對環(huán)境污染破壞，不僅節(jié)約時間和花費，而且更能賦予植物抵抗病原菌的廣譜抗性和持久性。本課題組前期研究中已將禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁特異抗體CWP2基因(Accession number :AJ517190)通過基因工程技術(shù)導(dǎo)入小麥中，大田和溫室接種試驗證實轉(zhuǎn)基因小麥抗赤霉病侵染的能力得到提高，并能提高產(chǎn)量。本發(fā)明通過對已有禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁特異抗體CWP2進(jìn)行改造，獲得了一種高親和力的抗鐮刀菌單鏈抗體，這為通過轉(zhuǎn)基因方法培育小麥赤霉病高抗品種提供了新抗源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種高親和力鐮刀菌特異單鏈抗體，此抗體與禾谷鐮刀菌(Fusarium asiaticum)細(xì)胞壁蛋白的親和力比親本抗體CWP2 (Accession number AJ517190)高 15 倍。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種高親和力鐮刀菌特異單鏈抗體的制備方法，即利用Error-prone PCR禾口 DNA shuffling技術(shù)對已有的抗體基因CWP2 (Accession number :AJ517190)進(jìn)行基因突變和序列重排。Error-prone PCR和DNA shuffling技術(shù)是在體外進(jìn)行基因重組的一種技術(shù)，它通過體外模擬自然界幾百萬年的進(jìn)化過程，在短時間
3內(nèi)篩選出活性、穩(wěn)定性、親和力提高的蛋白，為人類服務(wù)。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種高親和力鐮刀菌特異單鏈抗體在培育小麥赤霉病高抗品種中的應(yīng)用，本發(fā)明的單鏈抗體豐富了赤霉病抗源，為解決小麥赤霉病抗性種質(zhì)資源匱乏以及轉(zhuǎn)基因培育小麥赤霉病高抗品種奠定基礎(chǔ)?！N高親和力鐮刀菌特異單鏈抗體的制備方法，其步驟是A、利用Error-prone PCR和DNA shuffling技術(shù)對禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁特異抗體 CWP2 (Accession number :AJ517190)進(jìn)行基因突變和序列重排。B、將基因突變和序列重排后的突變基因連入噬菌體展示必需的載體中，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，構(gòu)建突變抗體庫。C、利用噬菌體展示技術(shù)對突變抗體庫進(jìn)行淘選，經(jīng)過三輪淘選富集得到與禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁蛋白特異結(jié)合的突變體蛋白。D、Phage-ELISA技術(shù)鑒定挑選到的突變體與禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁蛋白的結(jié)合能力。E、Phage-ELISA技術(shù)鑒定為陽性的克隆做表達(dá)ELISA鑒定，辨別其與親本單鏈抗體CWP2對禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁蛋白結(jié)合能力的強弱。F、表達(dá)ELISA鑒定為高親和力的單鏈抗體與禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁蛋白做Western blot分析，證明了此抗體能夠與禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁中一種主要蛋白結(jié)合。G、表達(dá)ELISA鑒定為高親和力的單鏈抗體與親本抗體CWP2同時做表面等離子共振檢測，進(jìn)一步確認(rèn)兩者親和力的高低。最終通過表面等離子共振檢測，證實挑選得到高親和力的單鏈抗體，申請人將其命名為CWPa，它與禾谷鐮刀菌(Fusarium asiaticum)細(xì)胞壁蛋白的親和力比親本抗體 CWP2 (Accession number :AJ517190)高 15 倍。本發(fā)明的高親和力抗鐮刀菌單鏈抗體CWPa由852個核苷酸組成，一種抗鐮刀菌高親和力單鏈抗體，其序列為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的高親和力抗鐮刀菌單鏈抗體CWPa由283個氨基酸組成，一種抗鐮刀菌高親和力單鏈抗體，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的抗鐮刀菌單鏈抗體主要由抗體重鏈可變區(qū)Vh、抗體輕鏈可變區(qū)\和連接肽組成，抗體重鏈可變區(qū)Vh和抗體輕鏈可變區(qū)\通過連接肽(Gly4 Ser)3連接共同完成鐮刀菌的識別和結(jié)合。一種高親和力鐮刀菌特異單鏈抗體在培育小麥赤霉病高抗品種中的應(yīng)用，其應(yīng)用是本發(fā)明得到的高親和力單鏈抗體CWPa能夠在大腸桿菌中高效、大量的表達(dá)。將獲得的高親和力單鏈抗體CWPa用于檢測其與來自小麥、紫羅蘭、黃姜、西瓜、黃瓜的鐮刀菌及來自油菜的核盤菌和桃子的桃褐腐菌結(jié)合能力及特異性，步驟見實施例2，實驗結(jié)果見圖 10所示，證明本發(fā)明的高親和力單鏈抗體CWPa能夠與來不同物種的鐮刀菌特異結(jié)合，與非鐮刀菌沒有結(jié)合能力。這為轉(zhuǎn)基因作物抗鐮刀菌侵染提供了基因來源。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明的有益效果之一是利用Error-prone PCR和DNA shuffling技術(shù)，構(gòu)建了抗鐮刀菌單鏈抗體基因突變文庫，通過噬菌體展示技術(shù)篩選獲得一個親和力比原始抗體提高的單鏈抗體及其編碼基因。
2、本發(fā)明的有益效果之二是提供的單鏈抗體可用于轉(zhuǎn)基因研究，為培育小麥赤霉病高抗品種提供了新抗源。3、本發(fā)明的有益效果之三是高親和力單鏈抗體CWI^a相比親本抗體CWP2改變了三個氨基酸，分別是第23位纈氨酸(Val)突變?yōu)楸彼?Ala) ’第30位天冬氨酸(Asp)突變?yōu)楦拾彼?Gly)和第209位甘氨酸(Gly)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)，其中第30位氨基酸改變發(fā)生在抗體的高變區(qū)(CDR區(qū))，其余兩個突變發(fā)生在骨架區(qū)(Framework)，這幾處改變導(dǎo)致了抗體高變區(qū)(⑶R區(qū))的空間結(jié)構(gòu)整體趨向了一個方向，這是導(dǎo)致抗體親和力增加的根本原因。4、本發(fā)明的有益效果之四是獲得了親和力比親本抗體CWP2高15倍的抗鐮刀菌特異單鏈抗體CWPa。


圖1為一種DNA shuffling凝膠電泳示意圖。A .Error-prone PCR產(chǎn)物；B :10_50bpDNA小片段；C 無引物PCR擴增的彌散條帶； D 有引物PCR擴增的重組scFv DNA。圖中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1 重組scFvDNA。圖2為一種載體pHENHi結(jié)構(gòu)圖。圖3為一種檢測抗體基因文庫陽性克隆率提取的質(zhì)粒DNA凝膠電泳示意圖。圖中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1 19 19個單克隆菌編號。圖4為一種檢測抗體基因文庫陽性克隆率PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳示意圖。圖中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1 19 19個單克隆菌PCR產(chǎn)物圖5為一種純化的單鏈抗體CWPa和親本抗體CWP2的SDS-PAGE電泳檢測示意圖。圖中M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)示意圖；泳道1 :CWPa蛋白，泳道2 :CWP2蛋白。圖6為一種單鏈抗體CWI^a和親本CWP2做表達(dá)ELISA后顯色值比較的柱狀示意圖。圖7為一種純化的單鏈抗體CWPa與禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁蛋白CWPs結(jié)合的Wfestern blot分析示意圖。圖中M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1 禾谷鐮刀菌CWPs蛋白圖8為一種單鏈抗體CWPa和親本CWP2做表面等離子共振的曲線示意圖。圖中A 單鏈抗體CWI^a與禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁蛋白CWPs結(jié)合解離曲線；B 單鏈抗體CWP2與禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁蛋白CWI^s結(jié)合解離曲線；C:在同一濃度下(0. 36 μ M)，CWI^a與 CWP2結(jié)合解離曲線比較。圖9為一種單鏈抗體CWPa和親本CWP2的三維空間結(jié)構(gòu)圖。圖10為一種單鏈抗體CWPa和親本CWP2與鐮刀菌特異結(jié)合的表達(dá)ELISA柱狀示意圖。圖中1 來自小麥的禾谷鐮刀菌(Fusarium asiaticum)細(xì)胞壁蛋白；2:來自紫羅蘭的尖孢鐮刀菌紫羅蘭?；?F.oxysporum f. sp. matthiolae)細(xì)胞壁蛋白；3 來自黃姜的尖孢鐮刀菌姜?；?F.oxysporum f. sp. zingiberi)細(xì)胞壁蛋白；4:來自西瓜的尖孢鐮刀菌西瓜?；?F.oxysporum f. sp. niveum)細(xì)胞壁蛋白；5:來自小麥的黃色鐮刀菌(F. culmorum) ；6 來自黃瓜的茄腐鐮刀菌(F. solani) ；7:來自小麥的三線鐮刀菌(F. tricinctum) ；8:來自油菜的核盤菌(S. sclerotiorum) ；9:來自桃子的桃褐腐菌
5(M. fructicola) ；10 對照液體 GYT 培養(yǎng)基。
具體實施例方式實施例1 一種高親和力鐮刀菌特異單鏈抗體的制備方法，其步驟是A.利用 Error-prone PCR 禾Π DNA shuffling 技術(shù)改造抗體基因1)以禾谷鐮刀菌抗體基因CWP2為模板(Accession number :AJ517190)，用正向引物pllIF(ACGTACCATGGCTGCCGTGACGT)和反向引物pllIR(AGTCAGTCGACGGGCTGGCCTAG)進(jìn)行 Error-prone PCR擴增。在 50 μ 1 PCR 反應(yīng)液中，含有 5 μ 1 PCR緩沖液(IOmM Tris-HCl (ρΗ 8. 3), 50mM KC1,7. 5mMMgC12,0. 5mM MnCl2, ),0. 2mM dNTPs,0. 8mM dCTP and dTTP，正反向引物各 0. 3yM，5U Taq 聚合酶。Error-prone PCR 反應(yīng)條件為95°C 5min ；94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，30 個循環(huán)；最后 72°C IOmin02) Error-prone PCR產(chǎn)物用DNA凝膠純化試劑盒(購自QIAGEN公司，按照該試劑盒的說明書操作)回收。3)將純化的 Error-prone PCR 產(chǎn)物(約 2 μ g)用 0. 06U DNase 1 在 37°C 消化 lOmin，然后于80°C溫育IOmin終止反應(yīng)。4)酶切產(chǎn)物通過1. 8% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測，用小片段純化試劑盒(購自 BioDev公司，按照該試劑盒的說明書操作)回收10-50bp的DNA小片段。5)以600ng回收后DNA小片段為模板，進(jìn)行無引物PCR擴增，無引物PCR體系如下PCR 緩沖液(IOmM Tris-HCl, (ρΗ 9. 0) ,0. 1% (V/V)6) Triton X-100,2. 2mM MgCl2, 50mM KCl)，每種 dNTP各0. 2mM，5U Taq聚合酶。PCR 反應(yīng)條件為95°C 3min ；94°C 50s, 55°C 50s, 72°C 50s，；35 個循環(huán)；最后 72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物通過(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到彌散的DNA條帶。 7)以 20ng 無引物 PCR 產(chǎn)物為模板，用正向引物 pll IF (ACGTACCATGGCTGCCGTGACGT) 和反向引物pinR(AGTCAGTCGACGGGCTGGCCTAG)進(jìn)行有引物PCR擴增，有引物PCR體系如下PCR緩沖液(含Mg2+)，每種dNTP各0. 2mM，正、反向引物各0. 3yM，5U Taq聚合酶。PCR 反應(yīng)條件為95°C 3min ；94°C 50s, 55°C 50s, 72°C 50s，15 個循環(huán)；最后 72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物通過(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測，其結(jié)果如圖1所示，得到與親本CWP2 DNA大小一致的條帶。8)有引物PCR產(chǎn)物用DNA凝膠純化試劑盒(購自QIAGEN公司，按照該試劑盒的說明書操作)回收。B.載體pHENHi及重組單鏈抗體(scFv)基因的酶切、連接1)分別用Nco I和Ml I限制性內(nèi)切酶(購自Takara公司，按照該酶的說明書操作)雙酶切載體PHENHi (德國弗朗霍夫分子生物與應(yīng)用生態(tài)學(xué)研究所贈送，見填寫遺傳資源表)和步驟A中得到的重組scFv片段。2)用DNA凝膠回收試劑盒(購自QIAGEN公司，按照該試劑盒的說明書操作)純化步驟1)酶切后的PHENHi載體和重組scFv片段。3)用T4 DNA連接酶(購自Takara公司，按照該酶的說明書操作)連接步驟2)回收的pHENHi載體和重組scFv片段，得到酶切連接產(chǎn)物pHENHi-scFv。4)參照J(rèn).薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實驗指南》，科學(xué)出版社，2003年，第三版介紹的方法對步驟3)得到的酶切連接產(chǎn)物pHENHi-scFv進(jìn)行乙醇沉淀除鹽。C.單鏈抗體基因突變文庫構(gòu)建1)大腸桿菌XLl-Blue MRF’感受態(tài)細(xì)胞制備用無菌牙簽蘸取_80°C冰箱保存的大腸桿菌XLl-Blue MRF’株，在LB固體培養(yǎng)基 (成分(W/ν)胰蛋白胨，0. 5% (W/V)酵母提取物，(ff/V)NaCl,l. 5% (W/V)瓊脂，pH 7. 0)平板上劃線，于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 后，挑取一單克隆菌落接種到5ml LB液體培養(yǎng)基 (成分(W/ν)胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母提取物，(W/V)NaCl, pH 7.0)中，37°C， 200r/min振蕩過夜培養(yǎng)16h。取1. 6ml菌液加入到160ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C，230r/ min振蕩培養(yǎng)至0D_達(dá)到0. 45左右時，取出培養(yǎng)菌的三角瓶置于冰上冷卻30min后，將菌液分裝于50ml離心管中，40C，4000r/min離心15min，棄上清，然后用30ml預(yù)冷的10% (V/ V)甘油洗滌菌體沉淀兩次G°C，4000r/min離心15min后棄上清)。最后每個離心管中加入100 μ 1預(yù)冷的GYT培養(yǎng)基(成分0. 25% (W/V)胰蛋白胨，0. 125% (W/V)酵母提取物， 10% (V/V)甘油)懸浮菌體，分裝成10(^1/管，立即保存于-801冰箱。2)電轉(zhuǎn)化酶切連接產(chǎn)物將_80°C保存的大腸桿菌XLl-Blue MRF，感受態(tài)細(xì)胞取出，置冰上溶化后，每管感受態(tài)細(xì)胞(100 μ 1)中加入5 μ 1酶切連接產(chǎn)物pHENHi-scFv，小心輕微地混勻后放冰上靜置 3min，然后將感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯(0. 2mm)(購自BIO-RAD公司)中，用 BIO-RAD公司的MicroPulser 電轉(zhuǎn)化儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化(設(shè)置Bacteria Ec2程序)。轉(zhuǎn)化后立即加入Iml SOC培養(yǎng)基(成分2% (W/V)胰蛋白胨，0. 5% (W/V)酵母提取物，0. 05% (W/ V) NaCl，20mM葡萄糖，pH 7. 0)到電轉(zhuǎn)化杯中，并將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)Ih使細(xì)菌復(fù)蘇。3)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞涂布平板培養(yǎng)取出復(fù)蘇后的感受態(tài)細(xì)胞，取100 μ 1涂布于LB固體培養(yǎng)基(含(W/V)葡萄糖，100 μ g/ml氨芐青霉素(Amp))平板用于計算單克隆菌落數(shù)。其余的菌液通過6000r/min 離心Imin后吸取部分上清丟棄，每管保留約100 150 μ 1上清重懸菌體，涂布于LB固體培養(yǎng)基(含(W/V)葡萄糖，100 μ g/ml Amp)平板。培養(yǎng)基平板放置于37°C恒溫箱過夜培養(yǎng)12 1 至單克隆菌落長出。4)抗體基因文庫收集保存計算電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞涂布平板培養(yǎng)后長出的單克隆菌落數(shù)量，估算抗體基因文庫容量。收集LB固體培養(yǎng)基平板上長出的菌落，加入等體積50% (V/V)甘油保存于_80°C 冰箱。通過以上步驟操作，最后構(gòu)建的抗鐮刀菌單鏈抗體基因文庫容量約為3X106cfu。D.單鏈抗體基因突變文庫鑒定1)從步驟C中的平板上長出的轉(zhuǎn)化子中隨機挑取19個單克隆菌落接種到LB液體培養(yǎng)基(含(W/ν)葡萄糖，lOOyg/ml Amp)中，37°C，220r/min振蕩過夜培養(yǎng)16h。2)參照J(rèn).薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實驗指南》，科學(xué)出版社，2003年，第三版介紹的煮沸裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過0.8% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測抗體基因文庫的陽性率。3)以步驟2)得到的質(zhì)粒DNA為模板，用正向引物pi I IF (ACGTACCATGGCTGCCGTGACGT)和反向引物 pIIIR(AGTCAGTCGACGGGCTGGCCTAG)進(jìn)行有引物PCR擴增。在25 μ 1 PCR反應(yīng)液中，含有IOng質(zhì)粒DNA, 2. 5 μ 1 PCR緩沖液(含Mg2+)， 2μ 1 1. 25mM dNTPs，1 μ 1 正向引物 pIIIF(10 μ Μ)，1 μ 1 反向引物 pIIIR(10 μ Μ)，1. 25 U Taq 聚合酶。PCR 反應(yīng)條件為94°C 5min ;94°C 50sec,55°C 50s, 72°C 50s，;35 個循環(huán)；最后72°C IOmin0 PCR產(chǎn)物通過(ff/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測抗體基因文庫的陽性率。鑒定結(jié)果如圖3 4所示，構(gòu)建的抗體基因突變文庫陽性率100%。E.禾谷鐮刀菌5035細(xì)胞壁蛋白(CWPs)制備1)用接種針挑取禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)菌株50；35，接種于20ml CMC培養(yǎng)基(成分0. 75% (W/V)羧甲基纖維素酯，0. 05% (ff/V)NH4NO3,0. 05% (ff/V)KH2PO4, 0. 025% (WA)MgSO4 ‘ 7H20,0. 05% (ff/V)酵母粉)中，28°C，200r/min 振蕩光照培養(yǎng) 3 天。2)取Iml孢子液接種于200ml Czapek培養(yǎng)基(成分3% (W/V)蔗糖，0. 3% (W/V) NaNO3,0. 1% (ff/V)K2HPO4jO. 05% (ff/V)MgSO4 ·7Η20,0. 05% (ff/V)KCl,0. 001% (ff/V)FeSO4, pH 9.0)中，28°C，225r/min振蕩避光培養(yǎng)5 7天。3)用2層滅菌紗布過濾培養(yǎng)液，并用滅菌水洗滌3次后將菌絲置于超凈工作臺上吹干。4)在研缽中加入液氮研磨菌絲，裝入2ml離心管中，置于冰上。5)加入 1. 5 2ml CffP 緩沖液(IOmM Tris-HCl, ImM 苯甲基磺酰氟(PMSF)，pH 7. 8)混勻。6) 4°C，50r/min 旋轉(zhuǎn)洗滌 30min。7)4°C，4600r/min 離心 lOmin，棄上清。8)用預(yù)冷的 CWP 洗脫液(1M NaCl，ImM PMSF)洗滌 3 5 次(每次 4°C，50r/min 旋轉(zhuǎn)洗滌30min，再4°C，4600r/min離心IOmin后棄上清)。9)加入 IOml 含 ImM PMSF 的滅菌水混勻，4600r/min 離心 IOmin。10)提取的串珠鐮刀菌CWP溶于IxPBS中，于_20°C保存?zhèn)溆?。F.噬菌體展示篩選單鏈抗體基因文庫1)取步驟C中收集保存的菌液(抗體基因文庫)500 μ 1加入到50ml 2TY培養(yǎng)基 (成分1.6% (W/V)胰蛋白胨，(W/V)酵母提取物，0.5% (W/V)NaCl, pH 7.0)(含 (W/V)葡萄糖，100 μ g/ml Amp)中，37°C，200r/min 振蕩培養(yǎng)至 OD6tltl 達(dá)到 0. 5。2)取5ml菌液于50ml離心管中，加入0. 5μ 1 Ml 3Κ07輔助噬菌體(購自Amersham Biosciences公司，參照J(rèn).薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實驗指南》，科學(xué)出版社，2003 年，第三版介紹的方法制備保存，其中噬菌體的量為大腸桿菌的20倍)，混勻后于37°C水浴靜置30min。3) 4000r/min離心lOmin，去上清，然后重懸于120ml 2TY培養(yǎng)基中(含100 μ g/ mlAmp, 25 μ g/ml 卡那霉素(Kan))，30°C，200r/min 振蕩過夜培養(yǎng)至少 15h。4)將過夜培養(yǎng)的菌液分裝于50ml離心管中，4°C，8000r/min離心lOmin。5)取上清，加入 1/5 體積的 PEG/NaCl 溶液 QO% (W/V)聚乙二醇(PEG) 6000, 2. 5M NaCl)，充分混勻后置冰上沉淀lh。6)4°C,8000r/min離心30min，去上清，將沉淀重懸于20ml滅菌水中，并立即加入 1/5體積的PEG/NaCl溶液，充分混勻后4°C放置20min。
7)4°C,4000r/min 離心 30min，去上清。8)輕微離心，去除殘留的PEG/NaCl溶液。9)加入Iml滅菌水重懸沉淀，并4°C，4000r/min離心lOmin，取上清于4°C保存(取 10 μ 1采用IO-2 10-11梯度稀釋來測定滴度)。10)用步驟E提取的禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁蛋白CWPs包被Immunotube管(Iml)，37°C 水浴濁。11)用 PBS 磷酸鹽緩沖液(137mM NaCl, 2. 7mM KCl，IOmM Na2HPO4,1. 8mMKH2P04, pH 7. 2 7. 4)洗滌3次。12)向Immunotube管中加入封閉液(含2% (W/V)脫脂奶粉的PBS溶液)， 37°C水浴封閉2h(用封閉液封閉另一新Immimotube管作為陰性對照)。13)用 4ml PBS 分別洗 Immunotube 管 3 次，每次 Imin014)從步驟9)中取IO13噬菌體加入Immunotube管，37°C水浴2h。15)用 4ml PBST (含 0. 1 % (V/V) Tween 20 的 PBS)和 PBS 分別洗滌 15 次，每次 Imin (第二輪和第三輪淘選時增加洗滌次數(shù)至25次和35次)。16) Iml 三乙胺溶液(IOOmM)加入 Immunotube 管，室溫(20_25°C )靜置 lOmin。17)立即加入500 μ 1 Tris-HCl溶液(ΙΜ,ρΗ 7.4)中和，并轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。18)取IOml在37 °C，200r/min振蕩培養(yǎng)條件下生長到OD6tltl為0. 5的大腸桿菌 XLl-BlueMRF'加入到50ml離心管中，37°C水浴侵染30min。19)4000r/min 離心 lOmin，去上清。20)加入Iml LB培養(yǎng)基重懸菌體后涂布于TYE固體培養(yǎng)基(成分1 % (W/V)胰蛋白胨，0.5% (W/V)酵母提取物，0.8% (W/V)NaCl,1.5% (W/V)瓊脂，pH 7.0)平板上(涂板時采用10_3 10_6梯度稀釋來測定滴度)，37°C恒溫箱過夜培養(yǎng)12 1 至菌落長出。21)收集TYE固體培養(yǎng)基平板上長出的菌落，取一部分進(jìn)行下一輪淘選，其余加入等體積50% (V/V)甘油保存于-80°C冰箱。G. Phage-ELISA鑒定淘選抗體庫1)步驟F完成三輪淘選后，用滅菌牙簽從TYE固體培養(yǎng)基平板上隨機挑取78個單克隆菌接種到裝有180 μ 1 2ΤΥ培養(yǎng)基(含(W/V)葡萄糖，100 μ g/ml Amp)的96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板于30°C，150r/min振蕩培養(yǎng)16h。2)從每孔中取20 μ 1菌液加入到新的裝有180 μ 1 2ΤΥ培養(yǎng)基(含(W/V)葡萄糖，100 μ g/ml Amp, IO8輔助噬菌體M13K07)的96孔培養(yǎng)板中，37°C，150r/min振蕩培養(yǎng) 2h。3) 1800r/min 離心 lOmin，棄上清。4)加入 180 μ 1 新的 2ΤΥ 培養(yǎng)基(含 100 μ g/ml Amp, 50 μ g/ml Kana)至培養(yǎng)板中，37°C，150r/min 振蕩培養(yǎng) 16h。5) 1800r/min離心lOmin，每孔中取100 μ 1上清用于ELISA鑒定。6)在ELISA板孔中加入100 μ 1禾谷鐮刀菌CWPs，37°C水浴包被2h。7)用 300μ 1 PBS 洗滌 3 次。8)在抗原包被的孔及對照孔(未加禾谷鐮刀菌CWPs)中分別加入300μ1封閉液 (含2% (W/V)脫脂奶粉的PBS溶液)，于37°C水浴封閉池。
9)用300 μ 1 PBS分別洗滌3次，每次Imin010)在抗原包被孔及其對照孔中分別加入ΙΟΟμΙ步驟5)收集的上清，并加入 200 μ 1封閉液，37°C反應(yīng)2h。11)用 300 μ 1 0. PBST 和 PBS 分別洗滌 3 次，每次 lmin。12)每孔加入100 μ 1封閉液稀釋(體積比為1 5000)的偶聯(lián)辣根過氧化物酶的抗Μ13噬菌體抗體(購自Amersham Biosciences公司)，37°C反應(yīng)2h。13)用 300 μ 1 0. 1% PBST 和 PBS 分別洗滌 3 次，每次 Imin014)每孔加入100 μ 1顯色液(可溶性單組份TMB底物)，黑暗條件下反應(yīng)15min。15)每孔加入2M H2SO4溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測OD45tl讀值。Phage-ELISA鑒定結(jié)果顯示，78個單克隆樣品中全部顯色，未包被禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁CWI^s抗原的對照孔不顯色，樣品OD45tl值與對照OD45tl值之比P/N值為3. 5 15. 7。其中有5個單克隆顯色值高于親本CWP2。說明通過淘選使禾谷鐮刀菌特異性單鏈抗體富集，且得到了顯色值較親本CWP2高的單鏈抗體。將5個顯色值高于親本CWP2的單克隆培養(yǎng)菌液送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，結(jié)果分析后得到1個可用于檢測禾谷鐮刀菌的單鏈抗體。將含有這1個基因的大腸桿菌單克隆培養(yǎng)菌液加等體積50% (V/V)甘油保存于-80°C 冰箱。H.原核表達(dá)高親和力的單鏈抗體和親本CWP2單鏈抗體及抗體回收1)分別取5μ 1甘油保存的含有從步驟G中挑到的高親和力抗體基因和親本CWP2 基因的大腸桿菌XLl-Blue MRF’接種于20ml 2TY培養(yǎng)基(含1 % (W/V)葡萄糖，100 μ g/ mlAmp)中，37°C，200r/min 振蕩過夜培養(yǎng) 12h。2)取8ml過夜培養(yǎng)菌液加入160ml 2TY培養(yǎng)基(含1 % (W/V)葡萄糖，100 μ g/ml Amp)中，37°C，200r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)到0. 5左右。3)加入終濃度為ImM的IPTG，置于30°C，200r/min誘導(dǎo)表達(dá)8h。4)取培養(yǎng)菌液分裝到50ml離心管中，4°C，3000g離心lOmin，棄上清。5)每管中加入 500 μ 1 PPB 溶液(30mM Tris-HCl,20% (W/V)蔗糖，pH 8. 0)重懸菌體，再加入ι μ 1乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(終濃度ImM)，冰上放置15min。6)4°C，3000g離心15min，上清裝入另一離心管中。7)每管中加入1ml MgCl2溶液(終濃度5mM)重懸菌體，再加入2 μ 1 EDTA溶液 (終濃度ImM)，冰上放置15min。8)4°C，3000g離心15min，上清與步驟6)上清合并。9)取收集步驟6)和8)上清的離心管于4°C,12000r/min離心15min。10)取上清用PBS透析。I.用Ni-NAT柱純化原核表達(dá)的單鏈抗體1)安裝純化柱(購自BIO-RAD公司)，加入200 μ 1充分混勻的基質(zhì)(購自QIAGEN 公司)，使其固定池以上。2)剪去下端封口，使液體流下，用aiil PBS進(jìn)行平衡。3)加入從步驟H中回收的單鏈抗體樣品過柱，收集保存過柱后的樣品流出液。4)加Iml緩沖液B (50mM Na2HPO4, 20mM咪唑)洗脫純化柱4次，分別收集洗脫液為 B1、B2、B3、B4(雜蛋白)。
5)加400 μ 1緩沖液C (50mM Na2HPO4, 250mM咪唑)洗脫純化柱3次，分別收集洗脫液為C1、C2、C3(目的蛋白)。6)加anl PBS平衡純化柱后，加入Iml 30% (V/V)酒精4°C保存純化柱。7)純化的目的蛋白(單鏈抗體)通過SDS-PAGE電泳檢測(圖5)后用PBS透析。J.表達(dá)ELISA鑒定淘選抗體庫1)在ELISA板孔中加入100 μ 1禾谷鐮刀菌CWPs，37°C水浴包被2h。2)用 300 μ 1 PBS 洗滌 3 次。3)在抗原包被的孔及對照孔(未加禾谷鐮刀菌CWPs)中分別加入300 μ 1封閉液 (含2% (W/V)脫脂奶粉的PBS溶液)，于37°C水浴封閉池。4)用300 μ 1 PBS分別洗滌3次，每次Imin05)在抗原包被孔及其對照孔中分別加入5 μ 1純化的單鏈抗體CWPa和CWP2，并加入200 μ 1封閉液，37°C反應(yīng)濁。6)用 300 μ 1 0. 1% PBST 和 PBS 分別洗滌 3 次，每次 Imin07)每孔加入100 μ 1封閉液稀釋(體積比為1 5000)的抗His單克隆抗體(購自天根生化科技(北京)有限公司)，37°C反應(yīng)池。8)用 300 μ 1 0. 1% PBST 和 PBS 分別洗滌 3 次，每次 Imin09)每孔加入100 μ 1封閉液稀釋(體積比為1 5000)的堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的羊抗鼠Fc特異抗體(購自Sigma公司)，37°C反應(yīng)池。10)用 300 μ 1 0. 1% PBST 和 PBS 分別洗滌 3 次，每次 Imin011)每孔加入100 μ 1顯色液(0. 1 % (W/V)對硝基苯磷酸二鈉溶液)，黑暗條件下反應(yīng)30min。12)每孔加入50 μ 1 NaOH溶液(3Μ)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測OD4tl5讀值。表達(dá)ELISA鑒定結(jié)果顯示(圖6)，步驟G中挑到的高親和力抗體的顯色值比親本 CWP2高，通過統(tǒng)計學(xué)方法計算，這個單鏈抗體對親本CWP2差異顯著(P < 0. 05)。說明篩選得到了親和力比對CWP2高的單鏈抗體。命名為CWPa，一種分離的多肽，其序列為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，含有該基因的大腸桿菌命名為重組大腸桿菌XLl-Blue MRFVCWPa，單克隆培養(yǎng)菌液加等體積 50% (V/V)甘油保存于_80°C冰箱。KJestern blot分析證明高親和力的單鏈抗體CWPa 與禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁蛋白結(jié)合能力1)取步驟E中制備的2 μ g CffPs蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后凝膠不用染色液染色。2)用 BIO-RAD 公司Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell 半干轉(zhuǎn)印裝置將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，于200mA恒定電流轉(zhuǎn)膜40min。3)轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將尼龍膜轉(zhuǎn)移到含有封閉液(5% (W/V)脫脂奶粉，20mM Tris-HCl (pH 8. 0)，150mM NaCl)的雜交盒中，室溫O0_25°C )平緩搖動15 20min后放置4°C過夜。4)倒掉封閉液，加入 IOml TBST(20mM Tris-HCl (pH 8. 0), 150mM NaCl，0. 1% (V/ V) Tween 20)洗滌 3 次，每次 5min。5)加入500ng純化的單鏈抗體CWPa，室溫O0_25°C )平緩搖動2h。
6)倒掉抗體，加入 IOml TBST(20mM Tris-HCl (pH 8. 0), 150mM NaCl，0. 1% (V/V) Tween 20)洗滌3次，每次5min。7)加入IOml經(jīng)TBST稀釋(體積比為1 5000)的抗His單克隆抗體(購自天根生化科技(北京)有限公司)，室溫O0-25°C )平緩搖動池。8)倒掉液體，用 IOml TBST 緩沖液(20mM Tris-HCl (pH 8. 0), 150mM NaCl，0. 1% (V/V) Tween 20)洗滌 3 次，每次 5min。9)再加入IOml經(jīng)TBST緩沖液稀釋(體積比為1 5000)的AP標(biāo)記羊抗鼠Fc特異抗體(購自Sigma公司)，室溫Q0-25°C )平緩搖動池。10)倒掉液體，用 IOml TBST 和 TBS (20mM Tris-HCl (pH 8. 0)，150mM NaCl)分別洗滌5次，每次5min。11)最后用BCIP/NBT顯色試劑盒(購自武漢博士德生物工程有限公司，按照試劑盒說明書操作)顯色10 20min后，用蒸餾水終止反應(yīng)，即可觀察并照相。結(jié)果如圖7所示，在約60kD大小處出現(xiàn)一條明顯的特異性條帶，證明挑選得到的高親和力抗體CWPa能夠與禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁一種主要蛋白結(jié)合。L.表面等離子共振技術(shù)(SPR)檢測CWPa與CWP2的親和力1)按照BIAcore 3000的操作手冊安裝芯片，設(shè)定工作溫度為25°C，注射運行緩沖液(PBS，pH = 7. 4)，流速IOyL mirT1，初始化傳感芯片3_4次，2 ^iin后得到穩(wěn)定基線。2)注入活化試劑(EDC/NHSS，1 1)使芯片表面活化7min。3)注入抗原蛋白(50 μ g mL—1，溶于乙酸pH = 4.5) 5min，使其與芯片結(jié)合。4)通入乙醇胺(1M，pH = 8. 5) 7min，使未結(jié)合蛋白的活化位點失活。5)注射運行緩沖液(PBS, pH = 7. 4)，使基線穩(wěn)定5min。6)分別通入系列濃度抗體(溶于PBS緩沖溶液)5 min，每次通入抗體溶液前用甘氨酸(100mM，pH = 2. 0)再生芯片lOmin，洗脫與固定于芯片表面的抗原結(jié)合的抗體。即可得到不同濃度抗體與芯片上固定的抗原的結(jié)合曲線，見圖8。7)通過隨機附送的軟件 BIAcore evaluation version 4. 1 and IGOR Pro (version 6. 0. 3. 1, WaveMetrics, Inc)分別計算 CWPa 和 CWP2 的親和力。計算結(jié)果顯示，單鏈抗體CWPa的結(jié)合常數(shù)K。n :8. 34X IO3 (M"1^1)，解離常數(shù)K。ff 1. 30 X 10_3 (S-1)，平衡解離常數(shù) Kd (KD = K。ff/K。n) 1. 56 X 10_7 (M)；親本 CWP2 的結(jié)合常數(shù) Kon :3. 19X IO3 (Μ、-1)，解離常數(shù) Koff 7. 34X 10_3 (S-1)，平衡解離常數(shù) Kd (KD = Koff/ Kon) 2. 30 X 10_6 (M)。通過比較發(fā)現(xiàn)，單鏈抗體CWPa與禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁蛋白CWPs結(jié)合速率是親本CWP2的2. 6倍，而解離速率比CWP2慢5. 6倍，整體平衡解離常數(shù)是CWP2的15倍， 說明單鏈抗體CWPa的親和力是親本CWP2的15倍。M.比較高親和力的單鏈抗體CWPa與親本CWP2的突變位點通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的核算序列比對，高親和力抗體CWI^a基因序列與親本CWP2有6個堿基不同，對應(yīng)3個氨基酸改變，分別是第23位纈氨酸(Val)突變?yōu)楸彼?Ala)；第30位天冬氨酸(Asp)突變?yōu)楦拾彼?Gly)和第209位甘氨酸(Gly) 突變?yōu)榻z氨酸(Ser)，其中第30位氨基酸的改變發(fā)生在抗體的高變區(qū)(CDR區(qū))，其余兩個突變發(fā)生在骨架區(qū)(Framework)。將CWPa和CWP2的氨基酸序列輸入CPHmodels-3. 0 Server (http//www. cbs. dtu. dk/services/CPHmodels/)網(wǎng)站，分別得到兩個抗體的空間結(jié)構(gòu)，利用Swiss-pdb viewer軟件展示出兩個抗體的三維空間結(jié)構(gòu)，見圖9。比較CWPa和CWP2單鏈抗體的結(jié)構(gòu)圖發(fā)現(xiàn)，單鏈抗體CWPa的高變區(qū)(⑶R區(qū))全部朝向同一個方向，而CWP2的高變區(qū)(CDR區(qū))的方向各不相同，同一方向的高變區(qū)更有力于結(jié)合禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁蛋白，這是單鏈抗體CWPa親和力高于親本CWP2的原因。實施例2 —種高親和力鐮刀菌特異單鏈抗體在培育小麥赤霉病高抗品種中的應(yīng)用，其步驟是1)在ELISA板孔中分別加入來源小麥的禾谷鐮刀菌(Fusarium asiaticum)細(xì)胞壁蛋白、來源紫羅蘭的尖孢鐮刀菌紫羅蘭?；?F.oxysporum f. sp. matthiolae)細(xì)胞壁蛋白、來源黃姜的尖孢鐮刀菌姜?；?F.oxysporum f. sp. zingiberi)細(xì)胞壁蛋白、來源西瓜的尖孢鐮刀菌西瓜?；?F.oxysporum f. sp. niveum)細(xì)胞壁蛋白、來源小麥的黃色鐮刀菌(F. culmorum)、來源黃瓜的茄腐鐮刀菌(F. solani)、來源小麥的三線鐮刀菌(F. tricinctum)、來源油菜的核盤菌(S. sclerotiorum)、來源桃子的桃褐腐菌 (M. fructicola)和對照液體GYT培養(yǎng)基各100 μ 1，37°C水浴包被2h。2)用 300 μ 1 PBS 洗滌 3 次。3)在抗原包被的孔及對照孔(空白孔)中分別加入300μ 1封閉液(含2% (W/V) 脫脂奶粉的PBS溶液)，于37°C水浴封閉池。4)用300 μ 1 PBS分別洗滌3次，每次Imin05)在抗原包被孔及其對照孔中分別加入5μ 1單鏈抗體CWI^a和CWP2，并加入 200 μ 1封閉液，37°C反應(yīng)2h。6)用 300 μ 1 0. 1% PBST 和 PBS 分別洗滌 3 次，每次 Imin07)每孔加入100 μ 1封閉液稀釋(體積比為1 5000)的抗His單克隆抗體(購自天根生化科技(北京)有限公司)，37°C反應(yīng)池。8)用 300 μ 1 0. 1% PBST 和 PBS 分別洗滌 3 次，每次 Imin09)每孔加入100 μ 1封閉液稀釋(體積比為1 5000)的堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的羊抗鼠Fc特異抗體(購自Sigma公司)，37°C反應(yīng)池。10)用 300 μ 1 0. 1% PBST 和 PBS 分別洗滌 3 次，每次 Imin011)每孔加入100 μ 1顯色液(0. 1 % (W/V)對硝基苯磷酸二鈉溶液)，黑暗條件下反應(yīng)30min。12)每孔加入50 μ 1 NaOH溶液(3Μ)終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測OD4tl5讀值結(jié)果見圖10，單鏈抗體CWI^a和CWP2都能夠與鐮刀菌特異性結(jié)合，與非鐮刀菌(核盤菌和桃褐腐菌)不反應(yīng)，且單鏈抗體CWPa的顯色值均高于親本CWP2，說明單鏈抗體CWPa 是鐮刀菌特異的抗體且親和力高于親本CWP2。這為轉(zhuǎn)基因作物抗鐮刀菌侵染提供了基因來源。所述的來源小麥的禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁蛋白、來源紫羅蘭的尖孢鐮刀菌紫羅蘭?；图?xì)胞壁蛋白、來源黃姜的尖孢鐮刀菌姜?；图?xì)胞壁蛋白、來源西瓜的尖孢鐮刀菌西瓜專化型細(xì)胞壁蛋白、來源小麥的黃色鐮刀菌、來源黃瓜的茄腐鐮刀菌、來源小麥的三線鐮刀菌、來源油菜的核盤菌、來源桃子的桃褐腐菌，采用以下步驟制備1)取病健交界處的組織，用1%。(w/v)升汞溶液浸泡處理lmin，無菌水清洗3次。2)置于 PDA (成分20% (w/v)馬鈴薯，2% (w/v)葡萄糖，1.5% (w/v)瓊脂)平板上25°C培養(yǎng)5d?；脤㈤L出的菌落在顯微鏡下觀察并切取菌絲尖端于新的PDA平板上25°C培養(yǎng)5d。4)用刮棒刮下培養(yǎng)菌絲，并用滅菌水洗滌3次后將菌絲置于超凈工作臺上吹干。5)在研缽中加入液氮研磨菌絲，裝入2ml離心管中，置于冰上。6)向離心管中加入Iml PBS，于_20°C保存?zhèn)溆?。獲得禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌紫羅蘭專化型、尖孢鐮刀菌姜專化型、尖孢鐮刀菌西瓜?；?、黃色鐮刀菌、茄腐鐮刀菌、三線鐮刀菌、核盤菌、桃褐腐菌的細(xì)胞壁蛋白。
權(quán)利要求
1.一種抗鐮刀菌高親和力單鏈抗體，其序列為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
2.一種抗鐮刀菌高親和力單鏈抗體，其序列為SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的一種高親和力鐮刀菌特異單鏈抗體在培育小麥赤霉病高抗品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高親和力鐮刀菌特異單鏈抗體及制備方法，其步驟A、對禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁特異抗體CWP2進(jìn)行基因突變。B、構(gòu)建突變抗體文庫。C、利用噬菌體展示對突變抗體庫進(jìn)行淘選，富集得到抗體蛋白。D、PhageELISA分析富集的突變體與禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁蛋白的結(jié)合能力。E、表達(dá)ELISA鑒定步驟D中得到的突變抗體與親本抗體CWP2對禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁蛋白結(jié)合的強弱。F、表達(dá)ELISA鑒定為高親和力的抗體與禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁蛋白做Westernblot分析。G、鑒定為高親和力的單鏈抗體與親本抗體CWP2做表面等離子共振檢測，證明高親和力的單鏈抗體與禾谷鐮刀菌細(xì)胞壁蛋白的親和力是親本抗體CWP2的15倍。這個高親和力單鏈抗體豐富了赤霉病抗源，為培育小麥赤霉病高抗品種奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C07K16/14GK102492037SQ201110407999
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者劉錦龍, 廖玉才, 張靜柏, 李和平 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)