水稻細胞周期蛋白OsCYCP4；4的應(yīng)用及提高水稻耐低磷脅迫的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種水稻細胞周期蛋白0SCYCP4; 4 的應(yīng)用及提高水稻耐低磷脅迫的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]磷是一切生命所必需的大量元素之一。磷元素不僅構(gòu)成了細胞內(nèi)包括DNA，RNA， ATP和磷脂等在內(nèi)的重要大分子，而且還參與調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，能量代謝和光合作用等重要的 生理生化過程（Abel S(2011)Phosphate sensing in root development.Curr Opin Plant Biol 14:303-309)。隨著分子生物學(xué)研究水平的不斷提高，我們對植物體磷吸收和 體內(nèi)代謝的復(fù)雜生理生化過程有了一定的了解。植物中參與響應(yīng)低磷脅迫的基因不斷被發(fā) 現(xiàn)，這些基因包括編碼受磷饑餓誘導(dǎo)的可使植物特異性高效吸收和利用磷的磷酸鹽轉(zhuǎn)運體 和磷酸酶，而其他基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控這些磷饑餓誘導(dǎo)基因的表達(Wu P(2014) SPX4Negatively Regulates Phosphate Signaling and Homeostasis through Its Interaction with PHR2in Rice.Plant Cell 26:1586_1597;Zhou J，Jiao F，Wu Z，Li Y， Wang X,He X,Zhong ff,ffu P(2008)0sPHR2is involved in phosphate-starvation signaling and excessive phosphate accumulation in shoots of plants. Plant Physiol 146:1673-1686;Zhang Z,Liao H，Lucas WJ(2014)Molecular mechanisms underlying phosphate sensing, signaling,and adaptation in plants .J Integr Plant Biol 56:192-220)。
[0003] 缺磷抑制作物地上部分生長，進而嚴重影響作物產(chǎn)量。但是到目前為止對于磷饑 餓脅迫如何抑制植物生長的分子機制還不是很清楚。已有研究報道植物生長抑制不是由植 物體內(nèi)磷含量低直接造成的，而是由一系列受磷饑餓觸發(fā)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)后的結(jié)果 (Rouached H,Stefanovic A,Secco D,Bulak AA,Gout E,Bligny R,Poirier Y(2011) Uncoupling phosphate deficiency from its major effects on growth and transcriptome via PHOlexpression in Arabidopsis .Plant J 65:557-570) 〇 因此，石開究 磷饑餓抑制植物地上部分生長的機理對培育磷高效利用作物非常重要。
[0004] 細胞周期蛋白復(fù)合體PH080/PH085是酵母磷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（ΡΗ0,Phosphate Signal Transduct ion)通路中轉(zhuǎn)錄因子PH04的重要負調(diào)控因子(Gil liquet V，Legrain M，Berben G,Hilger F(1990)Negative regulatory elements of the Saccharomyces cerevisiae ΡΗ0 system:interaction between PH080and PH085proteins.Gene 96:181-188)，同時參 與調(diào)控酵母細胞周期中GO期的起始(Wanke V，Pedruzzi I，Cameroni E，Dubouloz F，De Virgilio C(2005)Regulation of GOentry by the Pho8〇-Pho85cyc1in-CDK complex.EMBO J 24:4271-4278)dPH080同源蛋白在擬南芥和水稻中各存在7個，被命名為 一個植物細胞周期家族新成員P類型cyclin蛋白（CYCP) Jorres實驗室通過互補實驗發(fā)現(xiàn)， AtCYCP4;2可以部分恢復(fù)酵母ph〇80突變體中的磷信號；酵母雙雜交實驗顯示AtCYCP與 ⑶KA;1互作;但懸浮細胞中AtCYCPs的轉(zhuǎn)錄水平不受培養(yǎng)液磷濃度的影響（Torres AJ，de Almeida EJ,Raes J,Magyar Z,De Groodt R,Inze D,De Veylder L(2004)Molecular characterization of Arabidopsis PH080_like proteins,a novel class of CDKA；1-interacting cyclins. Cell Mol Life Sci 61:1485-1497)。但到目前為止沒有發(fā)現(xiàn)擬南 芥中CYCP家族與磷饑餓信號響應(yīng)的聯(lián)系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種水稻細胞周期蛋白0sCYCP4;4的應(yīng)用，水稻細胞周期 蛋白0sCYCP4;4負調(diào)控水稻生長。0sCYCP4;4功能缺失突變體降低低磷抑制地上部生長的敏 感性。
[0006] 本發(fā)明還提供了一種提高水稻耐低磷脅迫的方法，通過將水稻細胞周期基因 0sCYCP4;4從目的水稻上敲除，得到的轉(zhuǎn)基因水稻在低磷狀態(tài)下耐受性更高，為提高植物對 低磷耐受性和培育適用于磷貧瘠土壤的水稻新品種提供了保障。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0008] 一種水稻細胞周期蛋白0sCYCP4;4在調(diào)控低磷脅迫下水稻生長的應(yīng)用。
[0009] 作為優(yōu)選，水稻細胞周期蛋白0sCYCP4;4的氨基酸序列見SEQ ID N0.1所示。
[0010]作為優(yōu)選，水稻細胞周期蛋白〇sCYCP4; 4負調(diào)控水稻生長。
[0011] -種編碼水稻細胞周期蛋白0sCYCP4;4的基因，該基因為水稻細胞周期基因 0SCYCP4;4，水稻細胞周期基因0 SCYCP4;4的核苷酸序列見SEQIDN0.2所示。
[0012] 發(fā)明人經(jīng)過長期研究，首次發(fā)現(xiàn)低磷脅迫下與水稻生長調(diào)控直接相關(guān)的因子-水 稻細胞周期蛋白0sCYCP4; 4，水稻細胞周期基因0sCYCP4; 4的表達在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上 均受磷饑餓脅迫的誘導(dǎo)。過量表達0sCYCP4;4基因抑制水稻生長，證明其負調(diào)控水稻生長。 在正常培養(yǎng)條件下，0sCYCP4;4功能缺失突變體與野生型相比沒有明顯的表型差異，但突變 體磷含量明顯高于野生型。在缺磷條件下，0sCYCP4;4功能缺失突變體降低低磷抑制地上部 生長的敏感性。利用發(fā)現(xiàn)的水稻細胞周期蛋白0sCYCP4;4在低磷脅迫下負調(diào)控水稻生長的 特點，為提高植物對低磷耐受性和培育適用于磷貧瘠土壤的水稻新品種提供了保障。
[0013] 一種提高水稻耐低磷脅迫的方法，通過將水稻細胞周期蛋白0sCYCP4; 4的編碼基 因水稻細胞周期基因0sCYCP4; 4從目的水稻上敲除，使得水稻耐低磷脅迫能力提高。水稻細 胞周期基因0sCYCP4; 4缺失后能提高植株磷含量，且降低植株對低磷抑制生長的敏感性。
[0014] 作為優(yōu)選，將水稻細胞周期蛋白0sCYCP4; 4的編碼基因水稻細胞周期基因 0sCYCP4; 4從目的水稻上敲除的方法為:采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將載體轉(zhuǎn)入目的水稻的愈傷組 織中，培養(yǎng)獲得0sCYCP4; 4基因敲除的突變體。
[0015]作為優(yōu)選，水稻細胞周期基因0sCYCP4;4缺失后提高了水稻植株磷含量，且降低水 稻植株對低磷抑制生長的敏感性。
[0016] 作為優(yōu)選，水稻細胞周期基因0SCYCP4;4的核苷酸序列見SEQIDN0.2所示。
[0017] 作為優(yōu)選，所述載體為 pYLCRISPR/Cas9-MH-0sCYCP4; 4。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是:通過將水稻細胞周期基因0sCYCP4;4從目的水稻上敲除，得 到的轉(zhuǎn)基因水稻在低磷狀態(tài)下耐受性更高，為提高植物對低磷耐受性和培育適用于磷貧瘠 土壤的水稻新品種提供了保障。
【附圖說明】
[0019]圖l:0sCYCP4;4(水稻細胞周期基因）對低磷脅迫的響應(yīng)。A，水稻正常供磷(200μΜ， HP)和低磷（1 ΟμΜ，LP)處理21天后地上（shoo t)和地下（roo t)部分0sCYCP4; 4基因表達水平 的實時定量PCR檢測結(jié)果;B，0sCYCP4; 4基因組融合GUS的轉(zhuǎn)基因植株在正常供磷（200μΜ， HP)和低磷（10yM，LP)處理21天后地上(shoot)和地下(root)部分⑶S染色結(jié)果。
[0020] 圖2: 0SCYCP4; 4過表達轉(zhuǎn)基因水稻的表型觀察。A，7天苗表型;B，A中苗根(root)和 地上部分（shoot)長度統(tǒng)計。苗數(shù)15顆。野生型：SSBM;0sCYCP4;4過表達植株：0sCYCP4; 40VER-5，0sCYCP4;40VER-9和0sCYCP4;40VER-10。
[0021 ] 圖3:突變體cycp4;4的磷含量:A，地上（shoot)和地下(root)部分無機磷含量;B， 地上(shoot)和地下(root)部分總磷含量。
[0022] 圖4:突變體cycp4; 4在低磷下的響應(yīng)。A:突變體cycp4; 4在正常供磷(200μΜ，HP)和 低磷（10yM，LP)處理21天的表型觀察;B，A中植株地上（shoot)和地下(root)部分長度的測 量和統(tǒng)計;C，A中植株地上(shoot)和地下(root)部分相對干重的稱量和統(tǒng)計。
【具體實施方式】
[0023]下面通過具體實施例，并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的具體說明。 [0024]本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。 下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0025] 實施例：
[0026] 一種提高水稻耐低磷脅迫的方法，通過將水稻細胞周期蛋白0sCYCP4; 4的編碼基 因水稻細胞周期基因0sCYCP4;4從目的水稻上敲除（具體步驟見試驗部分第4節(jié)），使得水稻 耐低憐脅迫能力提尚。
[0027]試驗：
[0028] 1、0sCYCP4;4在轉(zhuǎn)錄水平對低磷脅迫的響應(yīng)
[0029]野生型水稻正常供磷（200μΜ)和低磷（10μΜ)條件下液體培養(yǎng)21天，分別提取地上 和地下部分RNA樣品，逆轉(zhuǎn)錄后進行實時定量PCR。結(jié)果顯示0sCYCP4;4基因在地上和地下部 分的表達均受低磷脅迫誘導(dǎo)（圖1A); 0sCYCP4; 4實時定量PCR引物：
[0030] P1:5'GCAGCACTCAGCATCAGTTAGC 3'（SEQ ID N0.4)
[0031] P2:5'TGTGCTAGGAGCAAATGCTTTG 3'（SEQ ID N0.5)。
[0032] 2、0sCYCP4;4在翻譯水平對低磷脅迫的響應(yīng)
[0033] 根據(jù)NCBI網(wǎng)站提供的水稻基因組全序列，我們克隆了0sCYCP4;4的全長基因組序 列SEQ ID N0.2，包括3000bp啟動子，5 '非翻譯區(qū)，外顯子和內(nèi)含子。設(shè)計帶有BamH和ΚρηΙ酶 切位點和保護堿基的擴增引物：
[0034] Ρ3：5；CGCGGATCCCAGTTGCAAGTCCAAGCAAA 3'（SEQ ID Ν0.6)，
[0035] P4：
[0036] 5'CGGGGTACCCGCAGCTAACTGATGCTGA 3'（SEQ ID NO.7)。
[0037] 提取水稻基因組DNA，取50ng DNA作為模板在50μ1體系中進行目的片段的擴增。擴 增體系為：DNA模板ΙμL，引物Ρ3( 10μΜ)0.2μ1，引物Ρ4( 10μΜ)0.2μ1，2 X K0D緩沖液（購自 TOYOBO公司）25μ1，dNTP (2.5mM) 2μ1，KOD酶(購自 TOYOBO公司）2μ1 加水至50μ1。擴增條件為： 94°C預(yù)變性5min，然后以94°C變性lmin，62°C復(fù)性lmin，72°C延伸4min，進行28個循環(huán)，最后 72°C延伸lOmin。通過凝膠電泳回收擴增片段，通過酶切連接將目的片段融合入由 PCAMBIA1300改造而來pCAMBIA1300-GUS(在pCAMBIA1300后面加入⑶S序列和終止子Nos)載 體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆后進行測序獲得重組克隆P QsCYCP4; 4: