專利名稱：具有抗骨質(zhì)疏松作用的雌激素－生長激素釋放肽綴合物的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生長激素釋放肽及其合成，雌激素-生長激素釋放肽綴合物及其合成方法，以及這些綴合物及其藥用鹽作為抗骨質(zhì)疏松藥物的應用和含有這些綴合物及其藥用鹽的藥物組合物。
促生長激素釋放肽是一類人工合成的小分子多肽，可以增強體內(nèi)生長激素的分泌脈沖，間接或直接促進骨轉(zhuǎn)換(Svensson J，Ohlson C.，etal.，Treatmentwith the oral growth hormone secretagogue MK-677 increases markers of boneformation and bone resorption in obese young males，J.Bone Miner Res，1998，113，1158)。糖皮質(zhì)激素由于對其它激素所作用的受體和受體后信息傳遞物質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用而使其它激素，例如多肽激素增效。這種作用被定義為允許作用(Ingle KT，Endocrinology，1942，31，419)并被用于綴合激素設計，即用于多肽與甾體通過共價鍵連接的激素的設計(王超、彭師奇、張賢莆、邱學才，甾體一多肽綴合激素的合成及免疫抑制活性，1998，33，111；朱巖、邱學才、王超、彭師奇，氫化可的松可加強京都酚及類似物的針痛效應，藥學學報，1993，28，166)。
TyrGlyGlyPheAA (II)在式(I)和(II)中，AA為LeuOH，LeuOCH3，LeuNH2，MetOH，MetOCH3，MetNH2，GlyOH，GlyOCH3及GlyNH2。
根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供了通式(III)的雌二醇-17-β-O-AA-Phe-Gly-Gly-Tyr的綴合物，其中AA為LeuOH，LeuOCH3，LeuNH2，MetOH，MetOCH3，MetNH2，GlyOH，GlyOCH3及GlyNH2。
根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，提供了上述通式(III)的綴合物的合成方法，包括將逐步接肽得到的通式(II)保護中間體的羧端游離，偶聯(lián)到雌二醇的17-β-羥基上，用HF或氫解法脫保護。
根據(jù)本發(fā)明的第四個方面，提供了通式(IV)的雌二醇-17-β-O-丁二酰基-Tyr-Gly-Gly-Phe-AA的綴合物，其中AA為LeuOH，LeuOCH3，LeuNH2，MetOH，MetOCH3，MetNH2，GlyOH，GlyOCH3及GlyNH2。
根據(jù)本發(fā)明的第五個方面，提供了通式(IV)的綴合物的合成方法，包括將逐步接肽得到的保護中間體的N端脫保護制備N端游離的保護寡肽中間體，將雌二醇的17-β-羥基與丁二酸酐反應制備丁二酸單酯中間體，將兩種中間體偶聯(lián)，必要時寡肽部分的羧端皂化，最后用HF或氫化法脫保護。
根據(jù)本發(fā)明的第六個方面，提供了通式(V)的雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr-Gly-Gly-Phe-AA的綴合物，其中AA為LeuOH，LeuOCH3，LeuNH2，MetOH，MetOCH3，MetNH2，GlyOH，GlyOCH3及GlyNH2。
根據(jù)本發(fā)明的第七個方面，提供了通式(V)綴合物的合成方法，包括按逐步接肽法制備的保護寡肽中間體N端脫保護制備N端游離的保護寡肽中間體，將雌酮與溴乙酸乙酯反應制備雌酮-3-氧甲基羧酸中間體，將兩種中間體偶聯(lián)，必要時寡肽部分的羧端皂化，最后用HF或氫化法脫保護。
根據(jù)本發(fā)明的第八個方面，提供了通式(VI)的17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-Tyr-Gly-Gly-Phe-AA綴合物，其中AA為LeuOH，LeuOCH3，LeuNH2，MetOH，MetOCH3，MetNH2，GlyOH，GlyOCH3及GlyNH2。
根據(jù)本發(fā)明的第九個方面，提供了通式(VI)的綴合物的合成方法，包括按照本發(fā)明第七個方面的操作制備雌酮—保護寡肽中間體，必要時寡肽部分的羧端皂化，用硼氫化鈉將酮基還原，最后用HF或氫化法脫保護。
需要說明的是，在說明書中，Boc代表叔丁氧羰基，Bzl代表芐基，Phe代表苯丙氨酸，Gly代表甘氨酸，Tyr代表酪氨酸，Leu代表亮氨酸，Met代表蛋氨酸，Me代表甲基，Bu代表丁基，Et代表乙基，DCC代表N，N-二環(huán)己基碳二亞胺。
以下是本發(fā)明的生長激素釋放肽的合成路線BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheOH+AA→BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheAA或HF其中AA如上所定義。通式(III)的綴合物的合成路線如下
通式(IV)的綴合物的合成路線為 本發(fā)明通式(V)和(VI)的合成路線如下
在上述合成路線圖中，其中AA如上所定義。
本發(fā)明的通式(I)-(VI)的化合物能夠形成藥學可接受的鹽，例如與各種酸，如鹽酸和酸性氨基酸，或各種堿，如氫氧化鈉和堿性氨基酸形成鹽。
本發(fā)明通式(1)-(VI)的化合物還能夠以藥用組合物的形式使用，該組合物另外含有藥學可接受的載體以及其它成分，如著色劑、甜味劑等。載體可以是通常用于制藥領域的那些。本發(fā)明化合物在組合物中的含量例如可以是0.001-10wt％。本發(fā)明的化合物可以制成固體制劑，如片劑、膠囊、顆粒制劑等，還可制成液體制劑，如口服液等，也可制成注射劑。
本發(fā)明使用已過性成熟期體重為20g左右的雄性昆明種小鼠建立骨質(zhì)疏松模型，評價了本發(fā)明的化合物對骨質(zhì)疏松的預防和治療作用，結(jié)果表明本發(fā)明的化合物可明顯預防和治療小鼠骨質(zhì)疏松癥。為了解釋本發(fā)明，下面給出一系列實施例。這些實例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進行具體描述，不應當理解為對本發(fā)明的限制。
實施例1 HCl·MetOCH3的制備在冰鹽浴冷卻和攪拌下往20ml甲醇中滴加1.17ml(20.1mmol)氯化亞砜，同時產(chǎn)生大量氯化氫氣體。往所得的溶液分次加入1.00g(6.7mmol)Met。反應混合物在冰鹽浴下攪拌1小時，然后升溫至室溫。攪拌60小時后TLC顯示原料點消失，減壓濃縮除去甲醇，殘留物反復用無水乙醚研磨，得到標題化合物1.23g(85％)，為無色固體，mp128～131℃。
實施例2 MetNH2的制備1.00g(5.02mmol)HCl·MetOCH3先用2ml甲醇溶解，然后與15mlNH3/CH3OH飽和溶液混合。反應混合物于室溫下密閉攪拌30天，期間經(jīng)常補加NH3/CH3OH飽和溶液。TLC顯示原料點消失，減壓濃縮，殘留物用無水乙醚研磨，得到標題化合物0.71g(95.5％)，為無色固體，mp141～146℃。
實施例3 HCl·LeuOCH3的制備1.00g(7.69mmol)Leu用20ml氯化氫/甲醇(6mol/L)溶解，得到的溶液室溫攪拌72小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物減壓濃縮，殘留物用無水乙醚反復研磨，得到標題化合物1.25g(90％)，為無色固體，mp127～128℃。
實施例4 LeuNH2的制備按照實施例2的操作，由1.00g(6.90mmol)LeuOCH3，制得0.76g(85％)標題化合物，為無色固體，mp118～122℃。
實施例5 HCl·GlyOCH3的制備按照實施例3的操作，由1.00g(13.33mmol)Gly制得1.09g(93％)標題化合物，為無色固體，mp148～151℃。
實施例6 GlyNH2的制備按照實施例2的操作，由1.00g(11.24mmol)GlyOCH3制得0.67g(81％)標題化合物，為無色固體，mp72～75℃。
實施例7 HCl·PheOCH3的制備按照實施例3的操作，由1.00g(6.06mmol)Phe制得1.03g(95％)標題化合物，為無色固體，mp130～134℃。
實施例8 BocGlyPheOMe的制備35.0mg(0.20mmol)BocGlyOH與27.0mg(0.20mmol)HOBt用2ml無水四氫呋喃于冰浴下溶解。往溶液中加49.4mg(0.24mmol)DCC，冰浴下攪拌30分鐘后，加入43.0mg(0.20mmol)PheOCH3，并用N-甲基嗎啉調(diào)pH至8。反應混合物室溫攪拌12小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物濾除DCU，濾液減壓濃縮至干，殘留物依次用飽和碳酸氫鈉水溶液洗、飽和氯化鈉水溶液洗、5％硫酸氫鉀水溶液洗、飽和氯化鈉水溶液洗、飽和碳酸氫鈉水溶液洗以及飽和氯化鈉水溶液洗，分出的有機層用無水Na2SO4干燥、過濾，濾液減壓濃縮至干(這些操作統(tǒng)稱常規(guī)后處理)。得到65.9mg(98％)標題化合物，為黃色油狀物。
實施例9 HCl·GlyPheOCH3的制備67.2mg(0.20mmol)BocGlyPheOCH3與5ml氯化氫/乙酸乙酯溶液(4mol/L)混合后于室溫攪拌40分鐘，TLC顯示原料點消失。反應混合物減壓濃縮至干，殘留物加入無水乙醚，混合均勻后再減壓濃縮至干。該操作反復數(shù)次，除盡游離的氯化氫。殘留物用無水乙醚研磨，得標題化合物，為無色固體，按理論收率計算用于下步反應。
實施例10 BocGlyGlyPheOCH3的制備35.0mg(0.20mmol)BocGly和27.0mg(0.20mmol)HOBt用2ml無水四氫呋喃溶解。冰浴下往溶液中加49.4mg(0.24mmol)DCC，反應混合物攪拌30分鐘，待用。將實施例9制得的HCl·GlyPheOCH3用5ml無水四氫呋喃溶解，得到的溶液加到冰浴攪拌的反應混合物中，用N-甲基嗎啉調(diào)pH至8。反應混合物室溫攪拌12小時，TLC顯示原料點消失。按常規(guī)后處理，得到的油狀物用石油醚研磨，得67.4mg(85.8％)標題化合物，為無色固體，mp113～115℃。
實施例11 HCl·GlyGlyPheOCH3的制備按實施例9的操作，由78.6mg(0.20mmol)BocGlyGlyPheOCH3與氯化氫/乙酸乙酯溶液反應3小時，制得標題化合物，按理論收率計算用于下步反應。
實施例12 BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheOCH3的制備按實施例10的操作，由88.1mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)和實施例11的產(chǎn)物反應，制得109.8mg(76.9％)標題化合物，為無色固體，mp127～130℃，[α]20D＝+22°(C＝1，CHCI3/MeOH，15∶1)。
實施例13 BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheOH的制備142.8mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheOCH3用15ml甲醇溶解后，冰浴下往里滴加3mlNaOH水溶液(2mol/L)。反應混合物于0℃攪拌5小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物用稀鹽酸(2mol/L)調(diào)pH值至7，減壓濃縮除去甲醇，殘留物于冰浴下用稀鹽酸(2mol/L)調(diào)pH到至1.0。抽濾，收集的固體用水洗，得122.8mg(87.75)標題化合物，為無色固體，mp136～138℃，[α]20D＝+20°(C＝0.4，CHCl3/MeOH，15∶1)。FAB-MS(M/e)，723[M+Na]+，700[M-BOC]+。
實施例14 BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheGlyOCH3的制備按實施例10的操作，由140mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)Gly Gly Phe OH，27.0mg(0.20mmol)HOBt，15ml無水四氫呋喃，49.4mg(0.24mmol)DCC，25.0mg(0.20mmol)HCl.GlyOCH3，制得78.5mg(50.9％)標題化合物，mp124～126℃，[α]D20＝+0.83°(C＝2.4，CHCl3/MeOH，15∶1)。FAB-MS(m/e)772[M+H]+，672[M-BOC]+。
實施例15 BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheGlyOH的制備按照實施例13的操作，由154.2mg(0.20mmol) BocTyr(Cl2Bzl)GlyGly-Phe Gly OCH3，10ml甲醇和4ml NaOH水溶液(2mol/L)制得138.7mg(91.6％)標題化合物，mp136～140℃，[α]20D＝+1.5°(C＝1.3，CHCl3/MeOH，15∶1)。TOF-MS(m/e)780[M+Na]+，796[M+K]+。
實施例16 TyrGlyGlyPheGlyOH的制備151.4mg(0.20mmol)Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheGlyOH用8ml甲酸/甲醇(4.4％)溶液溶解，加8mgPd/C(10％)，室溫氫解24小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物過濾。濾液減壓濃縮殘留物用乙酸乙酯反復洗滌，得到側(cè)鏈脫保護C端甲酯化的產(chǎn)物，TyrGlyGlyPheGlyOCH3為黃色固體，TOF-MS(m/e)513[M+H]+，535[M+Na]+，551[M+K]+。該化合物按實施例13的操作進行皂化，得到90.8mg(91.0％)標題化合物，為無色固體，mp170～174℃，[α]20D＝+10°(C＝0.4，H2O)。TOF-MS(m/e)522[M+Na]+，實施例17 Boc-Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheGlyNH2的制備按實施例10的操作，由140mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheOH，27.0mg(0.20mmol)HOBt，10ml無水四氫呋喃，49.4mg(0.24mmol)DCC和14.8mg(0.20mmol)GlyNH2室溫反應24小時，用柱層析分離，得47.6mg(31.5％)標題化合物，為無色固體，mp149～152℃；[α]20D＝-12°(C＝0.5，CHCl3/CH3OH，15∶1)。FAB-MS(m/e)757[M+H]+。
實施例18 TyrGlyGlyPheGlyNH2的制備按實施例16中氫解的操作，由151.2(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheGlyNH2制得94.4mg(94.6％)標題化合物，為無色固體，mp128～130℃；[α]20D＝+60°(C＝3.0，H2O)。TOF-MS(m/e)499[M+H]+，521[M+Na]+，537[M+K]+。
實施例19 BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuOCH3的制備按照實施例10的操作，由140.0mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheOH，27.0mg(0.20mmol)HOBt，10ml無水四氫呋喃，49.4mg(0.24mmol)DCC和36.2mg(0.20mmol)HCl.LeuOCH3室溫反應16小時，得121.0mg(73.2％)標題化合物，為無色固體，mp126～128℃；[α]20D＝+1.67°(C＝1.2，CHCl3/CH3OH)，15∶1)；TOF-MS(m/e)828[M+H]+。
實施例20 BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuOH的制備按照實施例13的操作，由165.4mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuOCH3與3mlNaOH水溶液(2mol/L)0℃反應1.5小時，得到143.6mg(88.3％)標題化合物，120～123℃；[α]20D＝-3.3°(C＝1.2，CHCl3/CH3OH)，15∶1)；FAB-MS(m/e)835[M+Na]+。
實施例21 TyrGlyGlyPheLeuOH的制備步驟1(a)162.6mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuOH，先用15ml甲醇溶解，再與8mgPd/C(5％)混合，反應混合物于室溫下氫解24小時，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物反復用乙酸乙酯洗，得到35.4mg(27.0％)N端BOC保護的標題化合物，為無色固體，mp120～123℃；[α]20D＝-3.3°(C＝1.2，CHCl3/CH3OH)，15∶1)；FAB-MS(m/e)692[M+K]+。
(b)131.0mg(0.20mmol)(a)步驟制得的產(chǎn)物用5ml氯化氫/乙酸乙酯(4mol/L)溶解，室溫攪拌1小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物減壓濃縮，殘留物用無水乙醚研磨得到127.1mg(95％)標題化合物，為無色固體，mp130～133℃；[α]20D＝+5.0°(C＝0.4，H2O)；TOF-MS(m/e)556[M+H]+。
步驟2按照實施例16的操作，由162.6mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuOH制得103mg(90％)標題化合物，mp131～133℃；[α]20D＝+5.1°(C＝0.4，H2O)；TOF-MS(m/e)556[M+H]+。
實施例22 BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuNH2的制備140.0mg(0.20mmol)Boc-Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheOH和27mg(0.20mmol)HOBt用適量無水四氫呋喃溶解，在冰浴下加入49.4mg(0.24mmol)DCC，同時攪拌。30分鐘之后加入26.0mg(0.20mmol)LeuNH2，并用N-甲基嗎啉調(diào)pH至8.0，室溫攪拌15小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)后處理，得91.3mg(56.2％)標題化合物，mp138～142℃；[α]20D＝-16.4°(C＝1.1，CHCl3/CH3OH)，15∶1)；TOF-MS(m/e)836[M+Na]+，852[M+K]+。
實施例23 BocTyrGlyGlyPheLeuNH2的制備163.0mg(0.20mmol)BocTYr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuNH2用15ml甲醇溶解后與8mg鈀-碳(5％)混合，室溫下氫解24小時。反應混合物過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用乙酸乙酯反復洗滌，回收未反應的原料，得26.7mg(20％)標題化合物，mp157～159℃；[α]20D＝+5.0°(C＝0.4，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；FAB-MS(m/e)655[M+H]+，693[M+K]+。
實施例24 TyrGlyGlyPheLeuNH2的制備132mg(0.20mmol)BocTyrGlyGlyPheLeuNH2用5ml氯化氫/乙酸乙酯(4mol/L)溶解，室溫攪拌1小時，有大量沉淀生成，TLC顯示原料點消失，室溫減壓濃縮至干，得到黃色粉末用蒸餾水溶解，過濾，濾液冷凍干燥，得到55.3mg(50％)標題化合物，為白色固體，mp123～126℃；[α]20D＝+12°(C＝1，H2O)；TOF-MS(m/e)592[M+K]+。
實施例25 BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheMetOMe的制備按實施例22的操作，用39.8mg(0.20mmol)HCl·MetOMe代替Leu-NH2，得到103.6mg(61.3％)標題化合物，mp123～125℃；[α]20D＝-2.9°(C＝1.4，CHCl3∶CH3OH，15∶1)FAB-MS(m/e)868[M+Na]+，884[M+K]+。
實施例26 BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheMetOH的制備169.0mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheMetOMe溶于15ml甲醇，往該溶液中滴加3mlNaOH溶液(2mol/L)，0℃攪拌90分鐘，TLC顯示原料點消失。反應混合物用2mol/L鹽酸中和(pH＝7)，減壓濃縮，除去甲醇后再用2mol/L鹽酸酸化至PH＝1，過濾收集生成的白色沉淀，得到143.1mg(86.1％)標題化合物，mp138-141℃，[α]20D＝+2.5°(C＝0.8，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)854[M+Na]+，870[M+K]+。
實施例27 TyrGlyGlyPheMetOH的制備166.2mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheMetOH與1ml苯甲醚及1ml二甲硫醚混合之后在HF反應裝置中與5ml液態(tài)HF于0℃處理1小時，減壓除去HF之后，固體用水溶解，用Sephadex G10柱分離，5％乙酸洗脫，洗脫冷凍干燥，得到33.2mg(29％)標題化合物，mp174～177℃；TOF-MS(m/e)575[M+H]+。
實施例28 BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheMetNH2的制備按照例25的操作，用29.6mg(0.20mmol)MetNH2代替MetOCH3，得到59.9mg(36.1％)標題化合物，mp142～145℃；[α]20D＝-2.5°(C＝0.8，CHCl3:CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)855[M+Na]+，871[M+K]+。
實施例29 TyrGlyGlyPheMetNH2的制備按照實施例27的操作，由166.4mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheMetNH2制得57.2mg(50.3％)標題化合物，mp142～145℃；[α]20D＝+14.3°(C＝0.35，H2O)；TOF-MS(m/e)573[M+H]+。
實施例30 3-O-亞甲羰氧乙基雌酮的制備0.15ml(0.30mmol)乙醇鈉的乙醇溶液，54.1mg(0.20mmol)雌酮及10ml無水四氫呋喃混合之后逐漸升溫并攪拌，加入0.081ml(0.59mmol)溴代乙酸乙酯后反應混合物回流，并不斷補加溴代乙酸乙酯，回流30小時，TLC顯示原料點基本消失。減壓濃縮除去溶劑，殘留物用氯仿/甲醇溶解，過濾，濾液用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，殘留物用柱層析純化(氯仿洗脫)，得到59.2mg(83％)標題化合物，mp83～85℃。
實施例31 3-O-亞甲羧基雌酮的制備往71.3mg(0.20mmol)3-O-乙氧羰甲基雌酮與8ml甲醇的溶液中滴加2mlNaOH溶液(2mol/L)，反應混合物變渾濁，自然升溫至室溫，攪拌1小時后TLC顯示原料點消失。反應混合物用2mol/L鹽酸中和至pH＝7。減壓濃縮，去除甲醇后，再用2mol/L鹽酸酸化至pH＝1。過濾收集白色固體，水洗，干燥，得61.7mg(93.9％)標題化合物，mp201～203℃。
實施例32 HCl·Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuNH2的制備162.4mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuNH2溶于5ml無水氯化氫/乙酸乙酯(4mol/L)溶液，室溫攪拌1小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物減壓濃縮至干，殘留物用無水乙醚研磨，得到標題化合物。
實施例33 雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuNH2的制備65.7mg(0.20mmol)3-O-亞甲羧基雌酮，27.0mg(0.20mmol)HOBt，以及5ml無水四氫呋喃配成的溶液冷至0℃，加入49.4mg(0.24mmol)DCC，攪拌30分鐘。往里加入實施例30中制得的HCl·Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuNH2與5ml無水四氫呋喃的溶液，用N-甲基嗎啉調(diào)pH至8。反應混合物室溫攪拌36小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)處理，得到173.4mg(85.0％)標題化合物，為白色固體。mp136～139℃；[α]20D＝+38°(C＝1，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)1046[M+Na]+，1062[M+K]+。
實施例34 雌酮-3-氧亞甲羰基-TyrGlyGlyPheLeuNH2的制備204.5mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuNH2用10ml4.4％甲酸-甲醇溶液溶解后加入10mg10％鈀碳。反應混合物通氫氣氫解24小時，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用制備TLC分離(CHCl3∶CH3OH∶HAc，15∶1∶0.4展開)，得到51mg(29.5％)標題化合物，mp138～141℃，[α]20D＝+40°(C＝0.2，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)887[M+Na]+，903[M+K]+。
實施例35 17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuNH2的制備204.5mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuNH2，用30ml氯仿-甲醇(1∶15)溶解，冰浴下往里滴加10ml硼氫化鈉水溶液(0.25mol/L)，0℃反應10分鐘，室溫反應15分鐘，TLC顯示原料點消失。反應混合物用鹽酸水溶液(2mol/L)淬火至不再產(chǎn)生氣體，有白色固體沉淀。反應混合物過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用乙酸乙酯萃取。萃取液用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用氯仿-無水乙醚析晶，得到96.2mg(47.0％)標題化合物，mp133～135℃；[α]20D＝+6.7°(C＝0.3，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)1024[M+Na]+。
實施例36 17-β-3-氧亞甲羰基-TyrGlyGlyPheLeuNH2的制備按照實施例33的操作，由200mg(0.20mmol)雌二醇-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuNH2，制得89.0mg(51％)標題化合物，mp128～131℃；[α]20D＝12.9°(C＝0.46，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)889[M+Na]+，905[M+Na]+。
實施例37 HCl·Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheLeuOMe的制備按照實施例24的操作，由165.4mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuOMe制得標題化合物。
實施例38 雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheLeuOMe的制備按照實施例32的操作，用實施例37制得的HCl·Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheLeuOMe代替HCl·Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheLeuNH2，制得132.4mg(63.8％)標題化合物，mp112～115℃；[α]20D＝+25°(C＝0.4，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)1039[M+H]+，1061[M+Na]+，1077[M+K]+。
實施例39 雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheLeuOH制備
207.5mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheLeuOMe溶于30ml甲醇，冰浴下滴加3ml氫氧化鈉水溶液(2mol/L)，0℃反應2小時，有白色固體析出。反應混合物用鹽酸水溶液(2mol/L)中和后減壓，濃縮，殘留物再用鹽酸水溶液(2mol/L)酸化至pH＝1，過濾，收集沉淀，水洗，粗品用柱層析純化(氯仿∶甲醇洗脫)，得103.8mg(50.7％)標題化合物，mp128～132℃；[α]20D＝+15°(C＝1.6，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)1025[M+H]+，1047[M+Na]+，1064[M+K]+。
實施例40 雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr-GlyGlyPheLeuOH的制備按照實施例34的操作，雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheLeuOH代替雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheLeuNH2，得到51.9mg(30％)標題化合物，mp122～125℃；[α]20D＝+57.2°(C＝0.22，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)888[M+Na]+，904[M+K]+。
實施例41 17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheLeuOH的制備按照實施例34的操作，用雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheLeuOH代替雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheLeuNH2，得187.5mg(91.6％)標題化合物，mp151～153℃；[α]20D＝+13.3°(C＝0.75，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)1040[M+H]+，1062[M+Na]+，1077[M+K]+。
實施例42 17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-TyrGlyGlyPheLeuOH的制備按照實施例33的操作，用17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuOH代替雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuNH2，得到50.2mg(29％)標題化合物，mp122～125℃[α]20D＝+40°(C＝0.15，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)868[M+H]+，890[M+Na]+，906[M+K]+實施例43 HCl·Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheMetNH2的制備按照實施例24的操作，由166.0mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheMetNH2制得標題化合物。
實施例44 雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheMetNH2的制備按照實施例32的操作，用HCl·Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheMetNH2代替HCl·Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheLeuNH2，得到141.1mg(67.8％)標題化合物，mp150～152℃；[α]20D＝+48.3°(C＝1.2，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)1064[M+Na]+，1080[M+K]+。
實施例45 雌酮-3-氧亞甲羰基-TyrGlyGlyPheMetNH2制備按照實施例27的操作，由208.1mg(0.20mmol)雌酮-3-氧甲亞羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheMetNH2，3ml苯甲醚及3ml二甲硫醚，制得34.6mg(19.6％)標題化合物，mp129～132℃；[α]20D＝+20°(C＝0.3，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)881[M+]。
實施例46 17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheMetNH2的制備按照實施例34的操作，用雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheMetNH2代替雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheLeuNH2，制得156.0mg(74.9％)標題化合物，mp123～126℃；[α]20D＝+24.0°(C＝0.5；CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)1066[M+Na]+，1082[M+K]+。
實施例47 17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-Tyr-GlyGlyPheMetNH2的制備按照實施例22的操作，由208.6mg(0.20mmol)17-β-雌-二醇-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheMetNH2，3ml苯甲醚及3ml二甲硫醚，制得35.4(20.2％)標題化合物，mp108～110℃；TOF-MS(m/e)923[M+K]+。
實施例48 HCl·Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheMetOMe的制備。
按照例24的操作，由169.0mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheMetOMe制得標題化合物。
實施例49 雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheMetOMe的制備按照實施例33的操作，用實施例47制得的HCl·Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheMetOMe代替HCl·Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheNH2，制得160.6mg(76.0％)標題化合物，mp110～114℃；[α]20D＝+28.6°(C＝0.3，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)1095[M+K]+。
實施例50 雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheMetOH的制備按照實施例26的操作，由211.1mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheMetOMe制得122.3mg(58.7％)標題化合物，mp128～132℃[α]20D＝+40°(C＝0.5，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)1043[M+H]+，1065[M+Na]+，1082[M+K]+。
實施例51 雌酮-3-氧亞甲羰基-TyrGlyGlyPheMetOH的制備按照實施例27的操作，由208.3mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheMetOH，3ml苯甲醚及3ml二甲硫醚。制得69.4mg(39.3％)標題化合物，mp109～113℃[α]20D＝+6.7°(C＝0.5，CHCl3∶CH3OH，15∶1；TOF-MS(m/e)884[M+H]+。
實施例52 17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheMetOH的制備按照實施例34的操作，用204.5mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheMetOH代替雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuNH2，制得204.3mg(98％)標題化合物，mp126～128℃；[α]20D＝+20.0°(C＝0.4，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)1043[M+H]+，1065[M+Na]+，1081[M+K]+。
實施例53 17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-TyrGlyGlyPheMetOH的制備按照實施例27的操作，由208.4mg(0.20mmol)17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheMetOH，3ml苯甲醚及3ml二甲硫醚制得44.2mg(25％)標題化合物，mp128～130℃，TOF-MS(m/e)885[M+H]+。
實施例54 HCl·Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheGlyNH2的制備按照實施例24的操作，由152.2mg(0.20mmol)Boc-Tyr(Cl2Bzl)-Gly-GlyPheGlyNH2制得標題化合物。
實施例55 雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-Gly-GlyPheGlyNH2的制備按照實施例33的操作，用實施例54制得的HCl·Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheGlyNH2代替HCl·Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheLeuNH2，制得56.6mg(29.3％)標題化合物，mp153～156℃，[α]20D＝+28.0°(C＝0.1，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)990[M+Na]+，1056[M+K]+。
實施例56 雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr-Gly-GlyPheGlyNH2的制備按照實施例27的操作，由195.4mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheGlyNH2制得25.9mg(16％)標題化合物，mp157～160℃，[α]20D＝+40.0°(C＝0.2，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)808[M+]，831[M+Na]+，847[M+K]+。
實施例57 17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-Gly-GlyPheGlyNH2的制備按照實施例35的操作，用193.3mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-Gly-GlyPheGlyNH2代替雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-Gly-GlyPheLeuNH2，制得34.9mg(18％)標題化合物，mp129～131℃，[α]20D＝+46.6°(C＝0.2，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)992[M+Na]+，1078[M+K]+。
實施例58 HCl·Tyr(Cl2Bzl)-Gly-GlyPheGly-OMe的制備按照實施例24的操作，由154.2mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)-Gly-GlyPheGly-OMe制得標題化合物。
實施例59 雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheGlyOMe的制備按照實施例32的操作，用實施例58制得的HCl·Tyr(Cl2Bzl)-Gly-GlyPheGly-OMe代替HCl·Tyr(Cl2Bzl)-Gly-GlyPheLeuNH2制得123.5mg(62.9％)標題化合物，mp101～104℃，[α]20D＝+12.0°(C＝0.5，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)984[M+H]+，1006[M+Na]+，1022[M+K]+。
實施例60 雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheGlyOH的制備按照實施例26的操作，由193.5mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheGlyOMe制得116.1mg(60％)標題化合物，mp130～133℃，[α]20D＝+20°(C＝0.3，CHCl3∶CH3OH，15∶1)TOF-MS(m/e)969[M+H]+，991[M+Na]+，1007[M+K]+。
實施例61 雌酮-3-氧亞甲羰基-TyrGlyGlyPheGlyOMe的制備按照實施例34的操作，由193.6mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheGlyOMe的制備制得157.4mg(95.4％)標題化合物，mp130～133℃，TOF-MS(m/e)824[M+H]+，847[M+Na]+，862[M+K]+。
實施例62 雌酮-3-氧亞甲羰基-TyrGlyGlyPheGlyOH的制備按照實施例26的操作，由164.7mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亞甲羰基-TyrGlyGlyPheGlyOMe制得110.1mg(68.0％)標題化合物，mp164～166℃，[α]20D＝+35.5°(C＝0.4，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)832[M+Na]+，848[M+K]+。
實施例63 17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheGlyOH的制備按照實施例34的操作，由193.5mg(0.20mmol)雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheGlyOH制得145.1mg(74.9％)標題化合物，mp110～112℃，[α]20D＝+24.0°(C＝0.5，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)992[M+Na]+，1008[M+K]+。
實施例64 17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-TyrGlyGlyPheGlyOMe的制備按照實施例34的操作，由193.8mg(0.20mmol)17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheGlyOMe制得49.5mg(29.9％)標題化合物，mp112～114℃，TOF-MS(m/e)826[M+H]+，848[M+Na]+，864[M+K]+。
實施例65 17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-TyrGlyGlyPheGlyOH的制備按照實施例26的操作，由165.1mg(0.20mmol)17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-TyrGlyGlyPheGlyOMe制得132.3mg(81.5％)標題化合物，mp140-142℃，[α]20D＝+15.0°(C＝0.4，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)813[M+H]+，835[M+Na]+，851[M+K]+。
實施例66 雌二醇-17-β-丁二酸單酯80.1mg(0.8mmol)丁二酸酐，2.54mg(0.02mmol)4-二甲氨基吡啶以及15ml無水二氯甲烷的混合物回流30分鐘至完全溶解，往溶液中加入54.5mg(0.2mmol)17-β-雌二醇，再回流30分鐘，TLC顯示原料點消失，過濾，濾液減壓濃縮至干，殘留物用柱層析純化(乙酸乙酯∶石油醚)洗脫，得71.9mg(65.7％)標題化合物，mp148～150℃，1HNMR(CDCl3)δ＝12.192(S，1H，COOH)，8.993(S，1H，3-OH)，7.040(d，1H，1-H)，6.500(d，1H，2-H)，6.427(S，1H，4-H)，4.504(t，1H，17-H)，0.657(S，3H，18-CH3)；TAB-MS(m/e)372[M+]。
實施例67 雌二醇-17-β-O-丁二酰基-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheLeuNH2的制備按照實施例33的操作，由74.5mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-丁二酸單酯與149.7mg(0.20mmol)HCl·Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPhe-LeuNH2制得129.9(60.9％)標題化合物，mp156～159℃，[α]20D＝-28°(C＝0.2，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)1068[M+H]+，1090[M+Na]+，1106[M+K]+。
實施例68 雌二醇-17-β-O-丁二?；?Tyr-GlyGlyPheLeuNH2的制備按照實施例34的操作，由213.4mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-丁二酰-Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPhe-LeuNH2制得70.9mg(39.1％)標題化合物，mp130～132℃，[α]20D＝+16°(C＝0.25，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)932[M+Na]+。
實施例69 雌醇-17-β-O-丁二?；?Tyr(Cl2Bzl)-GlyGlyPheGlyNH2的制備按照實施例33操作，由74.5mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-丁二酸單酯與138.5mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-HCl-Tyr(Cl2Bzl)-Gly-GlyPheGlyNH2制得標題化合物，mp120～122℃，[α]20D＝+34.3°(C＝0.7，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)1033[M+Na]+。
實施例70 雌二醇-17-β-O-丁二?；?TyrGlyGlyPheGlyNH2的制備按照實施例34的操作，由202.0mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-O-丁二?；?Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheGlyNH2制得20.5mg(12％)標題化合物，mp132～136℃，[α]20D＝-80°(C＝0.3，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)854[M+H]+，877[M+Na]+，892[M+K]+。
實施例71 雌二醇-17-β-LeuPheGlyGlyTyr(Cl2Bzl)Boc的制備162.6mg(0.20mmol)Boc-Tyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheLeuOH，35.8mg((0.13mmol)17-β-雌二醇，18.3mg(0.14mmol)4-二甲氨基吡啶與20ml無水二氯甲烷的溶液于0℃下加入32.7mg(0.16mmol)DCC，室溫反應20小時，TLC顯示原料點消失。反應混合物按常規(guī)處理，得到109.7mg(51.4％)標題化合物，mp138～141℃，[α]20D＝+11.4°(C＝0.7，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)190[M+Na]+。
實施例72 雌二醇-17-β-O-LeuPheGlyGlyTyrBoc的制備按照實施例34的操作，由212.6mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-LeuPheGlyGlyTyr(Cl2Bzl)Boc肽酯制得91.0mg(50％)標題化合物，TOF-MS(m/e)933[M+Na]+。
實施例73 雌二醇-17-β-O-LeuPheGlyGlyTyr·HCl的制備按照實施例24的操作，由182mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-O-LeuPheGlyGlyTyrBoc制得150mg(92％)標題化合物，mp163～165℃，[α]20D＝+66.7°(C＝0.3，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)810[M+H]+，833[M+Na]+，848[M+K]+。
實施例74 雌二醇-17-β-GlyPheGlyGlyTyr(Cl2Bzl)Boc肽酯的制備按照實施例70的操作，由162.6mg(0.20mmol)BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheGlyOH制得63.7mg(31.5％)標題化合物，mp140～142℃，1011[M+]。
實施例75 雌二醇-17-β-GlyPheGlyGlyTyr(Cl2Bzl)Boc肽酯的制備按照實施例33的操作，由202.2mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-GlyPheGlyGlyTyr(Cl2Bzl)Boc肽酯制得75.2mg(44.5％)標題化合物，mp120～122℃，[α]20D＝+23.6°(C＝1.1，CHCl3∶CH3OH，15∶1)；TOF-MS(m/e)877[M+Na]+。
實施例76 雌二醇-17-β-O-GlyPheGlyGlyTyr·HCl的制備按照實施例24的操作，由170.6mg(0.20mmol)雌二醇-17-β-O-GlyPheGlyGlyTyr(Cl2Bzl)Boc肽酯，制得143.5mg(95％)標題化合物，mp98～100℃，TOF-MS(m/e)778[M+Na]+。
實施例77 本發(fā)明化合物的抗骨質(zhì)疏松活性①實驗動物體重為20±2g已過性成熟期的雄性昆明種小鼠，隨機分組，正常對照組飼正常鼠料(含鈣1.76％，含磷1.01％)，飲自來水，每天皮下注射空白溶劑(含吐溫-801.83‰及苯甲醇9‰的注射用水)0.2ml；其余各組飼低鈣鼠料(含鈣0.1％，含磷0.4％)，飲去離子水，其中模型對照組每3天肌肉注射一次氫化潑尼松(6.3mg/kg)，給藥治療組除每天皮下注射一次本發(fā)明的化合物(18μg/kg)外，每3天肌肉注射一次氫化潑尼松(6.3mg/kg)。
②樣本采集四周后，稱體重(表1)，摘除眼球取血，血液靜置30分鐘后3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，得到血清。小鼠處死后取左側(cè)股骨，用氯仿/甲醇(2∶1)浸泡2次脫脂，每次浸泡3小時。
③股骨干重脫脂后的股骨置120℃烘箱中烘烤6小時，冷卻后稱重，結(jié)果列入表1。
④股骨灰重已測干重的股骨置800℃馬福爐中煅燒6小時，冷卻后稱重，結(jié)果列入表1。
表1小鼠體重、股骨干重和股骨灰重
n＝10，1)與正常對照組比P＜0.05；2)與模型對照組比，P＜0.05；3)與雌二醇及雌酮組比，P＜0.05。本表中的數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的化合物大都顯示了比雌二醇和雌酮更優(yōu)秀的抗骨質(zhì)疏松作用。
⑤血鈣按鄰甲酚酞絡合酮法，在721型紫外-可見分光光度計上測定對照管和測定管于570nm處的吸收度，利用鈣標準曲線確定鈣離子濃度。對照管中含4ml鈣顯色劑(由OPCP試液，二乙胺試液和甲醇按1.5∶1.5∶1組成)和50ul對照組小鼠的血清，測定管中含4ml鈣顯色劑和50ul給藥組小鼠的血清。結(jié)果列入表3。
⑥骨鈣采用與血鈣測定相同的方法。對此管中含4ml鈣顯色劑和50ml超純水，測定管中含4ml鈣顯色劑和50p，1骨灰酸解液(灰化的股骨用0.5ml6mol/L鹽酸溶解后，用超純水稀釋至5ml，取上0.05ml再用超純水稀釋至1ml即得)。結(jié)果列入表2。
⑦骨磷用721型紫外-可見分光光度計在660nm處測定吸收度，空白管中含0.20ml超純水，4.80ml亞鐵-三氯乙酸試劑和0.63ml鉬酸銨試劑，標準管中含0.20ml磷標準液，4.80ml亞鐵-三氯乙酸試劑和0.63ml鉬酸銨試劑，測定管中含0.20ml骨灰酸解液，48ml亞鐵-三氯乙酸試劑和0.63ml鉬酸銨試劑。結(jié)果列入表2。
表2 小鼠骨鈣和骨磷含量
n＝10，1)與正常對照組比P＜0.05；2)與模型對照組比，P＜0.05；3)與雌二醇及雌酮組比，P＜0.05。本表中的數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的化合物大都顯示了比雌二醇和雌酮更優(yōu)秀的抗骨質(zhì)疏松作用。
表3 小鼠血清鈣和血清堿性磷酸酶活性
n＝10，1)與正常對照組比P＜0.05；2)與模型對照組比，P＜0.05；3)與雌二醇及雌酮組比，P＜0.05。本表中的數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的化合物大都顯示了比雌二醇和雌酮更優(yōu)秀的抗骨質(zhì)疏松作用。
權(quán)利要求
1.通式(I)的BocTyr(Cl2Bzl)GlyGlyPheAA保護寡肽和通式(II)的Tyr-Gly-Gly-Phe-AA寡肽，其中AA為LeuOH，LeuOCH3，LeuNH2，MetOH，MetOCH3，MetNH2，GlyOH，GlyOCH3或GlyNH2。
2.通式(I)的保護寡肽和(II)的寡肽的合成方法，是用逐步接肽合成方法來進行。
3.下面通式的雌激素-肽綴合物及其藥用鹽雌二醇-17-β-O-AA-Phe-Gly-Gly-Tyr(III)雌二醇-17-β-O-丁二酰基-Tyr-Gly-Gly-Phe-AA(IV)雌酮-3-氧亞甲羰基-Tyr-Gly-Gly-Phe-AA(V)17-β-雌二醇-3-氧亞甲羰基-Tyr-Gly-Gly-Phe-AA(VI)其中在上述通式(III)-(VI)中，AA為LeuOH，LeuOCH3，LeuNH2，MetOH，MetOCH3，MetNH2，GlyOH，GlyOCH3或GlyNH2。
4.權(quán)利要求3中通式(III)的綴合物的合成方法，包括將逐步接肽得到的保護中間體通式(II)的保護寡肽的羧端游離，偶聯(lián)到17-β-羥基上，用HF或氫解法脫保護。
5.權(quán)利要求3中通式(IV)綴合物的合成方法，包括將逐步接肽得到的保護中間體通式(II)的保護寡肽的N端脫保護制備N端游離的保護寡肽中間體，將雌二醇的17-β-羥基與丁二酸酐反應制備丁二酸單酯中間體，將兩種中間體偶聯(lián)，必要時寡肽部分的羧端皂化，最后用HF或氫化法脫保護。
6.權(quán)利要求3中通式(V)綴合物的合成方法，包括按逐步接肽法制備的通式(II)的保護寡肽中間體的N端脫保護制備N端游離的保護寡肽中間體，將雌酮與溴乙酸反應制備雌酮-3-氧甲基羧酸中間體，將兩種中間體偶聯(lián)，必要時寡肽部分的羧端皂化，最后用HF或氫化法脫保護。
7.權(quán)利要求3中通式(VI)的綴合物的合成方法，包括按逐步接肽法制備的通式(II)的保護寡肽中間體的N端脫保護制備N端游離的保護寡肽中間體，將雌酮與溴乙酸反應制備雌酮-3-氧甲基羧酸中間體，將兩種中間體偶聯(lián)，制備雌酮—保護寡肽中間體，必要時寡肽部分的羧端皂化，用硼氫化鈉將酮基還原，最后用HF或氫化法脫保護。
8.權(quán)力要求1的保護寡肽和寡肽及其鹽在醫(yī)學中，尤其在制備預防或治療骨質(zhì)疏松的藥物中的應用。
9.權(quán)利要求3的通式(III)-(VI)綴合物及其鹽在醫(yī)學中，尤其在制備預防或治療骨質(zhì)疏松的藥物中的應用。
10.一種藥物組合物，其特征在于含有本發(fā)明通式(I)-(VI)的化合物及其鹽的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及雌激素－生長激素釋放肽綴合物及其制備方法,該方法包括采用逐步接肽法合成具有促生長激素分泌活性的寡肽;將獲得的保護寡肽與雌二醇的17位β羥基綴合,與17－β－雌二醇的3位羥基綴合,與雌酮的3位羥基綴合。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的化合物在制備治療或預防骨質(zhì)疏松的藥物中的應用。
文檔編號C07K7/06GK1348961SQ0113476
公開日2002年5月15日 申請日期2001年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月12日
發(fā)明者彭師奇, 王超, 趙明, 崔巍娜 申請人:北京中天凡太醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司