專(zhuān)利名稱(chēng)：一種新型酯酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種從海底泥中提取的新型酯酶及其表達(dá)載 體、重組酯酶及重組酯酶在降解擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥是繼有機(jī)氯、有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥后根據(jù)天然除蟲(chóng)菊素 的結(jié)構(gòu)人工合成的一類(lèi)仿生殺蟲(chóng)劑，其出現(xiàn)代表殺蟲(chóng)劑工業(yè)進(jìn)入了超高效殺蟲(chóng)劑時(shí)代。擬 除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的殺蟲(chóng)機(jī)理主要是影響昆蟲(chóng)的神經(jīng)系統(tǒng)，殺蟲(chóng)活性強(qiáng)，殺蟲(chóng)效力一般比有 機(jī)磷殺蟲(chóng)劑大100倍以上，且速效性好同時(shí)用量少、低殘留，被廣泛用于糧食、蔬菜和果樹(shù) 等多種作物。長(zhǎng)期接觸擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥即使是低劑量也會(huì)引起慢性疾病，有些類(lèi)型還有致 畸、致癌作用。而且菊酯類(lèi)農(nóng)藥對(duì)水生動(dòng)物的毒性較大，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和《聯(lián)邦食品安全 法》已對(duì)其多種農(nóng)藥作出了進(jìn)出口限制。隨著人們生活水平的提高、環(huán)護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)以及殘 留農(nóng)藥分析技術(shù)的進(jìn)步，人們迫切的需要無(wú)農(nóng)藥殘留污染的安全食品。因此，尋找一種有效 方法消除或降低在農(nóng)作物、食品和環(huán)境基質(zhì)中擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留已成為當(dāng)前迫切需要 解決的問(wèn)題。目前，有關(guān)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的降解主要有物理、化學(xué)和生物三種方法。由于生物 法較物理和化學(xué)法處理殘留農(nóng)藥具有經(jīng)濟(jì)、高效、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)今的主要研究 熱點(diǎn)。利用微生物降解殘留農(nóng)藥大多數(shù)是依靠胞內(nèi)酶的酶解作用，降解酶去除殘留農(nóng)藥降 解具有作用底物濃度低、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)和安全無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，但由于野生菌株大多產(chǎn)酶能 力有限、發(fā)酵周期長(zhǎng)、純化復(fù)雜。因此，克隆農(nóng)藥降解酶基因，并利用工程菌作生物反應(yīng)器來(lái) 生產(chǎn)農(nóng)藥降解酶是將來(lái)主要的研究方向。目前已從可培養(yǎng)微生物中克隆到多種農(nóng)藥降解酶 基因，然而這些降解酶基因在工程菌中表達(dá)時(shí)存在不可溶表達(dá)或表達(dá)條件要求苛刻問(wèn)題， 而且重組降解酶的低溫酶活性和穩(wěn)定性無(wú)法滿足實(shí)際應(yīng)用要求，不能達(dá)到快速有效降解殘 留農(nóng)藥的目的。為了解決這些問(wèn)題，迫切需要從自然界中尋找更有潛力的菊酯類(lèi)農(nóng)藥降解 酶。宏基因組學(xué)(Metagenomics)是以特定生態(tài)環(huán)境中微生物群體基因組的總和作為 研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，通過(guò)宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建及基因克隆、 異源表達(dá)等基本研究策略，篩選出有用的新基因及其產(chǎn)物，近年來(lái)隨著微生物學(xué)和現(xiàn)代生 命科學(xué)的迅猛發(fā)展而興起的一門(mén)新興學(xué)科。宏基因組學(xué)技術(shù)在挖掘和利用未培養(yǎng)微生物資 源和篩選新穎生物活性物質(zhì)方面表現(xiàn)出巨大的潛力，為生命科學(xué)提供了強(qiáng)有力的新方法， 已成為當(dāng)前國(guó)際上微生物學(xué)研究的前沿領(lǐng)域和熱點(diǎn)。至今國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)通過(guò)該技術(shù)克隆 到如淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、酯酶等新基因，這些酶具有新穎的酶學(xué)特性及工業(yè)應(yīng)用 潛力。因此，采用該方法使充分利用環(huán)境中蘊(yùn)藏的大量寶貴基因資源成為可能。到目前為 止，國(guó)內(nèi)外尚未有利用宏基因組技術(shù)從海底泥中發(fā)現(xiàn)新型廣譜高效降解擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥 降解酶的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種新型酯酶的DNA。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述新型酯酶的宏基因組學(xué)克隆方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供含有上述新型酯酶的DNA的表達(dá)載體。本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供利用上述表達(dá)載體構(gòu)建的重組酯酶及其制備方法。本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供上述重組酯酶在降解擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留中 的應(yīng)用。本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種新型酯酶的DNA，它的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本發(fā)明提供的上述新型酯酶，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種新型酯酶的宏基因組學(xué) 克隆方法，提取海底泥的總DNA并純化，將純化后的總DNA經(jīng)BamHI酶切，連接pUC118載體， 電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α高效感受態(tài)建立宏基因組文庫(kù)，通過(guò)點(diǎn)平板和滴加底物顯色法快 速篩選得到陽(yáng)性克隆子，經(jīng)測(cè)序和BLAST比較并設(shè)計(jì)引物，從而克隆到目的片段。本發(fā)明的第三個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種含有上述新型酯酶的 DNA的表達(dá)載體。本發(fā)明的第四個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種重組酯酶的制備方法， 包括用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組酯酶。上述重組酯酶的制備方法中，寄主細(xì)胞是大腸桿菌。上述重組酯酶的制備方法，其具體過(guò)程為包括用上述表達(dá)載體的目的片段經(jīng) BamHI, HindIII雙酶切，與pET_28a(+)載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘 導(dǎo)，得到高效可溶性表達(dá)。所述的IPTG終濃度為0. 1-1. 3mM，誘導(dǎo)溫度為18_37°C。本發(fā)明提供的重組酯酶，包括用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng) 物中獲得重組酯酶的步驟的方法制備。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所述重組酯酶在降 解擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果①.本發(fā)明從海底泥樣品構(gòu)建好的宏基因組文庫(kù)中得到一個(gè)新的酯酶的DNA序 列，通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)其功能研究，發(fā)現(xiàn)該序列在大腸桿菌中高效可溶表達(dá)，經(jīng)蛋白純化 及SDS-PAGE電泳，得到一條單一的蛋白條帶，初步確定分子量約為31. 2KDa。②.本發(fā)明將SEQ ID NO. 1所示的DNA序列克隆到原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿 菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)對(duì)陽(yáng)性克隆子的誘導(dǎo)表達(dá)得到重組蛋白，研究其酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果如下(1)在大腸桿菌表達(dá)體系中，該重組蛋白具有高效可溶性表達(dá)。(2)用對(duì)硝基苯酚乙酸酯為底物，測(cè)得重組蛋白的最適反應(yīng)溫度為40°C，在溫度 低于60°C非常穩(wěn)定，60°C保溫2h后，相對(duì)酶活性保持在80%以上，在20°C和10°C條件下， 分別為最高酶活性的76%和37%，表明該酶具有熱穩(wěn)定和冷適應(yīng)性；最適反應(yīng)pH為7. 0， 在pH 5. 5-9.0，酶的相對(duì)活力保持在80%以上，說(shuō)明其有較寬的pH酶解范圍；測(cè)定金屬離子和生化試劑對(duì)酶活力影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，ImM Al3+對(duì)重組酯酶F816的酶活力有明顯提高作用； 1% (w/v)的TritonX-100和Tween-80對(duì)其酶活力均有不同程度的提高作用；Hg2+、Ag+和 SDS則明顯的抑制酶活力，其它離子和生化試劑對(duì)酶活性沒(méi)有明顯的影響。③.本發(fā)明通過(guò)測(cè)定其酶學(xué)性質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)lmg/L的氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊 酯和溴氰菊酯有強(qiáng)降解作用，測(cè)定重組蛋白降解氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊 酯，結(jié)果表明其降解率均超過(guò)90%，因此在去除果蔬擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留方面有廣闊的 應(yīng)用前景。


圖1為實(shí)施例1中的SDS-PAGE電泳圖；其中，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量maker，1為重組蛋白粗提物，2為純化的重組蛋白；圖2為重組蛋白降解底物對(duì)硝基苯酚乙酸酯的最適溫度和熱穩(wěn)定性結(jié)果折線圖；其中1為最適溫度折線圖，2為熱穩(wěn)定性折線圖；圖3為重組蛋白降解底物對(duì)硝基苯酚乙酸酯的最適pH和pH穩(wěn)定性結(jié)果折線圖；其中1為最適pH折線圖，2為pH穩(wěn)定性折線圖；圖4為氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解氣相色譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實(shí)施例1宏基因組文庫(kù)的建立和陽(yáng)性克隆子的獲得、基因克隆與表達(dá)1、總DNA的提取稱(chēng)取6g 樣品，加入 13. 5mL DNA 提取緩沖液(0. IM Tris,0. IM EDTA-Na,0. IM Na3PO4,1. 5M NaCl，CTAB，pH值8. 0)，劇烈振蕩 3_5min，加入 200 μ L溶菌酶(100mg/ml)， 反復(fù)顛倒5-6次，37°C水浴30min，加入1. 5ml 20% SDS，65°C水浴Ih (期間每隔15min上 下顛倒幾次)，8000r/min離心5min，取上清液，用等體積氯仿抽提2次，16000r/min離心 IOmin,取上清，加入0. 6倍體積的異丙醇，室溫放置2h，20000r/min離心20min，棄上清，沉 淀加5mL預(yù)冷的70%乙醇，20000r/min離心lOmin，收集DNA沉淀，風(fēng)干，用適量TE緩沖液 溶解。2、試劑盒法純化DNA 按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。3、宏基因組電泳檢測(cè)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA的純度和質(zhì)量。4、酶切總DNA 用限制性內(nèi)切酶BamHI部分酶切總DNA，回收2_8kb的酶切片段，方 法同試劑盒法純化DNA。5、酶切片段的電泳檢測(cè)方法同宏基因組電泳檢測(cè)。6、酶切片段的鏈接將回收得到的酶切片段和pUC118/BamHI (BAP)載體連接過(guò) 夜，向連接產(chǎn)物中加入0. 6倍體積的異丙醇，室溫沉淀1. 5h，14000r/min離心20min，棄上清 并向沉淀中加入70%無(wú)水乙醇洗滌2次，風(fēng)干并加入適量dd H2O重溶。7、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化吸取5yL的連接產(chǎn)物加入到IOOyL的大腸桿菌DH5a高效感受態(tài)中，2500V/ cm(Eppdorf2510 電擊儀)電擊 1 次，46°C熱激 6min，37°C，180rpm 搖床培養(yǎng) 45_60min，吸取30-40μ L涂布于LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。根據(jù)平板上菌落數(shù)目將剩余的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布 含氨芐青霉素(100 μ g/ml)、IPTG(ImM)和X_gal (24 μ g/ml)的LB平板。由此構(gòu)建了一個(gè) 庫(kù)容量達(dá)15000個(gè)轉(zhuǎn)化子、多樣性好的宏基因組文庫(kù)。8、文庫(kù)篩選和陽(yáng)性克隆子的鑒定將文庫(kù)中所有的白板單菌落點(diǎn)種至兩塊含氨芐青霉素(100yg/ml)、IPTG(ImM) 的LB固體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24-48h，選擇其中一塊平板并將X-cap(80y g/ml)滴至菌落 表面及周?chē)?7°C放置30min后觀察顏色反應(yīng)。產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)的即為陽(yáng)性克隆。通過(guò)篩選 得到一株陽(yáng)性克隆子。從另一塊平板中將陽(yáng)性克隆子挑出并接種至IOmL含氨芐青霉素(100 μ g/ml)的 LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜，取2mL菌體進(jìn)行質(zhì)粒提取，對(duì)插入片段測(cè) 序，將測(cè)定的序列經(jīng)過(guò)NCBI的BLASTn軟件分析比較，發(fā)現(xiàn)該DNA由825個(gè)堿基組成，其核酸 序列如SEQ ID NO. 1所示，該DNA編碼的多肽，含274個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ IDN0. 3 所示，將其命名為F816。其中SEQ ID NO. 2為SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 3的對(duì)照?qǐng)D。9、基因片段的克隆根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)引物F1和F2，引物兩端引入能插入pET_28a(+)載體的 HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)，引物序列如下Fl 5' -CGCGGATCC ATG AGT GAG CTG ACA TCA ATC TCC GF2 5' -CCCAAGCTT TCA GGG GGC CAG CAA CTC利用兩條引物，以質(zhì)粒pUC118-F816為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR體系如下
溶液體積(μ )
模板(IOOng)1
dNTPMix (2.5 mM)4
引物 Fl(IOpM)1 引物 F2(10pM)權(quán)利要求
一種新型酯酶的DNA，其特征是它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一種新型酯酶，其特征是它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
3.權(quán)利要求1或2所述的新型酯酶的宏基因組學(xué)克隆方法，其特征是提取海底泥的 總DNA并純化，將純化后的總DNA經(jīng)BamHI酶切，連接pUCl 18載體，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 高效感受態(tài)建立宏基因組文庫(kù)，通過(guò)點(diǎn)平板和滴加底物顯色法快速篩選得到陽(yáng)性克隆子， 經(jīng)測(cè)序和BLAST比較并設(shè)計(jì)引物，從而克隆到目的片段。
4.一種包含權(quán)利要求1所述的新型酯酶的DNA的表達(dá)載體。
5.一種重組酯酶的制備方法，其特征是包括用權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主 細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組酯酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組酯酶的制備方法，其特征是其中寄主細(xì)胞是大腸桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組酯酶的制備方法，其特征是其具體過(guò)程為包括用權(quán)利 要求4所述的表達(dá)載體的目的片段經(jīng)BamHI、HindIII雙酶切，與pET_28a(+)載體連接，轉(zhuǎn) 化至大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，得到高效可溶性表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組酯酶的制備方法，其特征是所述的IPTG終濃度為 0. 1-1. 3mM，誘導(dǎo)溫度為 18-37°C。
9.一種重組酯酶，其特征是包括用權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞，培養(yǎng) 轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組酯酶的步驟的方法制備。
10.權(quán)利要求9所述的重組酯酶在降解擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新型酯酶的DNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。它的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。還公開(kāi)了含上述新型酯酶DNA的表達(dá)載體和重組酯酶及重組酯酶在降解擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用，該新型酯酶及重組酯酶在大腸桿菌表達(dá)體系中具有高效的可溶性表達(dá)，且該重組酯酶對(duì)氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等具有高效降解作用。
文檔編號(hào)A62D101/04GK101985627SQ20101054720
公開(kāi)日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月17日
發(fā)明者劉孝龍, 劉玉煥, 梁衛(wèi)驅(qū), 范新炯 申請(qǐng)人:中山大學(xué)