專利名稱：一種豬圓環(huán)病毒2型重組亞單位疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物制藥領域，涉及一種豬圓環(huán)病毒2型重組亞單位疫苗，同時還涉及一種該疫苗的制備方法，同時還涉及一種構建人工基因YSORF及融合蛋白rYSORF。
背景技術：
豬圓環(huán)病毒病(PCV)是由豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)引起的豬傳染性疾病，是繼豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)之后新發(fā)現的又一重要疫病。自1997年Clark等首次分離到豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)以來，該病已給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。目前，如何有效防控PCV已成為全球養(yǎng)豬業(yè)關注的焦點。迄今，全球有4種商品化PCV2疫苗相繼問世，其中梅里亞動物保健公司研發(fā) 的PCV2疫苗(Circovac )為全病毒滅活苗，適用于母豬免疫。由于PCV2難培養(yǎng)、生長慢，考慮到病毒培養(yǎng)成本高、周期長，人們又摸索出了一些新的方法來制備PCV2仔豬用疫苗,主要包括兩種類型一類是亞單位疫苗,如勃林格殷格翰動物保健公司的PCV2疫苗(CircoFlex⑩)和英特威/先靈葆雅動物保健公司的PCV2疫苗(Circumvent ),大量田間試驗表明該類疫苗可為仔豬提供良好的免疫保護；另一類是嵌合病毒滅活苗，用PCV2的0RF2片段置換不致病的PCVl中的0RF2片段，即獲得了 PCV1-PCV2嵌合病毒，具有與PCV2類似的免疫原性。近年來，以上PCV2疫苗已在部分國家和地區(qū)進行了注冊，并在該病的防治過程中發(fā)揮了重要的作用。然而，目前我國尚無注冊及國產的PCV2商品化疫苗，臨床上急需針對PCV2的安全、保護力高的疫苗?；蚬こ桃呙缛鏒NA疫苗、亞單位疫苗及病毒活載體疫苗等將是研制PCV2疫苗的主要方向。豬2型圓環(huán)病毒含有兩個主要的開放閱讀框0RF1和0RF2，其中ORFl與病毒復制有關，免疫原性和保護力弱；0RF2為PCV2的主要結構蛋白基因，編碼病毒的衣殼蛋白，可自我裝配成病毒樣粒子，是病毒的主要免疫原性蛋白，并且McNeilly等(McNeilly Fetal., Archires of Virology, 2001)研究證實0RF2中含有可中和病毒的中和抗原表位,是亞單位疫苗研制的主要候選基因。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型重組亞單位疫苗。本發(fā)明的目的還在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型重組亞單位疫苗的制備方法。為了實現上述目的，本發(fā)明的技術方案采用了一種豬圓環(huán)病毒的2型重組亞單位疫苗，所述的亞單位疫苗主要由豬圓環(huán)病毒2型融合蛋白rYSORF和佛氏不完全佐劑組成。所述的融合蛋白rYSORF中加入的佛氏佐劑是佛氏不完全佐劑，先將純化后的融合蛋白調至lmg/ml，按佛氏不完全佐劑與融合蛋白的體積比為1:1在攪拌狀態(tài)下加入。同時，本發(fā)明的技術方案還采用了一種豬圓環(huán)病毒2型重組亞單位疫苗的制備方法，所采用的技術方案包括下述步驟I)構建人工基因YSORF:
選取豬圓環(huán)病毒2型ORFl和0RF2蛋白免疫優(yōu)勢區(qū)，利用生物信息學優(yōu)化密碼子，形成人工基因序列，命名為YSORF ;設計引物，利用重疊PCR(SOE)技術拼接YS0RF，該序列包含柔性肽(G3S)5，連接ORFl和0RF2蛋白免疫優(yōu)勢區(qū)；然后利用生物信息學軟件Vector NTI對該序列進行密碼子優(yōu)化，獲得人工基因YSORF序列；2)構建重組表達載體rYSORF ；3)融合蛋白rYSORF的誘導表達；
·
在TB液體培養(yǎng)基中誘導表達，優(yōu)化表達條件促進融合蛋白在上清中表達；4)分離純化大腸桿菌表達的豬圓環(huán)病毒2型重組蛋白；5)利用純化的豬圓環(huán)病毒2型融合蛋白，輔以適量的佛氏不完全佐劑，制備成豬圓環(huán)病毒2型重組亞單位疫苗。所述步驟3)中融合蛋白rYSORF表達條件的優(yōu)化是將含有人工基因YSORF的工程菌按1/500接種液體TB培養(yǎng)基，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)至0D600 ^ I. O時，加入誘導劑IPTG至O. 05mM和表面活性劑SDS至O. 05%，40°C誘導培養(yǎng)6小時，獲得可溶性融合蛋白rYSORF。所述的構建人工基因YSORF序列包含序列表中SEQ IDN0. I、SEQIDN0. 2和SEQIDN0. 3，且分別位于人工基因YSORF序列的上游、中部和下游。所述的融合蛋白rYSORF序列包含序列表中的SEQ IDN0. 4、SEQ IDN0. 5和SEQIDN0. 6，且位于融合蛋白rYSORF序列氨基端、中部和羧基端。本發(fā)明將ORFl和0RF2蛋白免疫優(yōu)勢區(qū)融合在一起，顯著提高了重組PCV2亞單位疫苗的免疫效果；為了提高融合蛋白的表達效率和可溶性，采用SOE PCR技術對全基因序列進行了密碼子優(yōu)化，同時在誘導表達時加入適量的表面活性劑SDS，改變大腸桿菌膜結構，促進表達融合蛋白的分泌；為了最大限度的降低融合蛋白表達后抗原表位被掩蓋的頻率，在2個免疫優(yōu)勢區(qū)之間增加“氨基酸連接臂” [-GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS-，(G3S) 5]，促進融合蛋白的可溶性表達，使獲得的融合蛋白形成正確折疊，完全展示各自的抗原表位。本發(fā)明是利用SOEing-PCR的方法和生物信息學軟件獲得人工基因，同時在兩個不同ORFl基因和0RF2基因之間連接柔性肽進行基因的融合表達。利用人工優(yōu)化改造的基因提高了重組質粒在大腸桿菌中分泌表達量，減少了包涵體的形成，因而也省去了蛋白的變性和復性步驟，降低了生產成本。對仔豬的免疫保護效カ試驗I試驗仔豬30頭試驗用仔豬為10 — 14日齡，來至新鄭某豬場，試驗前進行豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、豬藍耳病病毒和豬細小病毒等主要病原進行檢測，確認為病原陰性。2仔豬免疫及攻毒試驗將30頭試驗用仔豬分為3組，每組10頭。其中，第I組給予Iml亞單位疫苗進行免疫，2周后加強免疫I次；第2組為攻毒對照，不進行免疫；第3組為陰性對照，単獨飼養(yǎng)。再次免疫3周后對第I和第2組進行攻毒試驗，觀察記錄攻毒過程，3周后剖殺所有試驗仔豬，觀察各組織器官的病理變化，同時結合臨床癥狀和病原PCR檢測判斷各仔豬發(fā)病情況。在I免前、攻毒前和剖殺前收集所有仔豬血樣并進行ELISA檢測，分析抗體產生情況。3試驗結果及結論試驗結果見表2和表3。第I組試驗仔豬在I免前血清中無抗體產生，在給予亞單位疫苗后10頭供試仔豬均產生了 PCV2特異性抗體，攻毒后，其中9仔豬健康狀況良好，無典型臨床癥狀和病理變化，有I頭仔豬發(fā)病，病原PCR檢測陽性；而第2組試驗仔豬在攻毒前血清抗體陽性率為0，即所有仔豬血清中均沒有PCV2特異性抗體，攻毒后發(fā)現所有仔豬均出現不同程度的臨床癥狀，剖檢及病原PCR檢測結果證實仔豬發(fā)??；而第3組為陰性對照組，單獨飼養(yǎng)，在整個試驗過程，10頭仔豬均未出現特異性抗體，也沒有明顯的臨床癥狀。表I供試仔豬PCV2特異性抗體分析結果
mrJ豬_環(huán)病毐抗體Wl牲率(％)
tai:f----—............；-；.......X.......
I免_攻辦_ fflj殺ΜIO100100 2OO100
3OOO表2供試仔豬PCV2特異性抗體分析結果
fR序免疫原接神割. 仔豬數攻+i!i屯株發(fā)病失數保護率
PCV2-SH
1亞f1.位疫丨 I ml/頭10I働
株
2攻# 對照O10O10100
3酬性對照O10O00由此可以得出結論，本發(fā)明制備的PCV2重組亞單位疫苗對仔豬有90 %的保護率，若進一步優(yōu)化接種劑量、佐劑類型等條件，其免疫保護效力會更高，可以用于豬場對抗PCV2,以保護豬群。發(fā)明效果I.融合蛋白的表達效率采用SOEing PCR技術對全基因序列進行密碼子優(yōu)化，利用大腸桿菌進行表達，表達產物經SDS-PAGE證實，rYSORF獲得了大量表達，與預期的大小一致，表達量占菌體蛋白的50%以上；2.融合蛋白的可溶性在誘導時添加適量的表面活性劑SDS，改變了大腸桿菌的膜結構，促進融合蛋白向胞外分泌，降低了形成包含體的可能；3.氨基酸連接臂的作用在兩個免疫優(yōu)勢區(qū)之間增加氨基酸連接臂可以有效的提高融合蛋白的可溶性，促進融合蛋白形成正確的空間構象；4.重組亞單位疫苗的免疫保護效果試驗證實施用本發(fā)明所述融合蛋白刺激產生的免疫應答明顯強于單獨施用0RF2蛋白時激發(fā)的免疫應答，顯然ORFl和0RF2免疫優(yōu)勢區(qū)之間產生了免疫協(xié)同作用，融合蛋白的保護作用明顯增強；5.重組亞單位疫苗的安全性通過對供試動物的臨床試驗，可以確定本發(fā)明所述亞單位疫苗對試驗動物是安全的、可靠的，不會造成試驗動物的不良反應。本發(fā)明所需要解決的技術問題是提供一種通過將ORFl和0RF2蛋白免疫優(yōu)勢區(qū)合理連接，以彌補只有0RF2蛋白免疫強度弱，提高PCV2重組亞單位疫苗的免疫效果；通過增加氨基酸連接臂，使獲得的ORFl和0RF2蛋白的免疫優(yōu)勢區(qū)能夠獨立形成空間結構，充分展示各自獨立的抗原表位；通過密碼子優(yōu)化，提高融合蛋白表達量的豬PCV2重組亞單位疫苗的制備方法。


圖I人工合成基因YSORF設計流程圖；圖2PCR擴增基因YSORF產物；泳道M DNA相對分子質量標準；泳道I :陰性對照；泳道2 =YSORF基因PCR擴增產物；
圖3pET28a_YS0RF 表達產物的 SDS-PAGE 分析；泳道M :相對分子質量蛋白質marker ；泳道I :未經誘導的菌液；泳道2 經IPTG誘導的菌液；圖4pET28a_YS0RF表達產物破碎上清經His親和層析純化SDS-PAGE分析；泳道I :超聲破碎上清；泳道2:上樣流穿液；泳道3 PB Buffer BI (5mM Imidazole)洗雜純化產物；泳道4 :PB Buffer B2 (IOmM Imidazole)洗雜純化產物；泳道5 PB Buffer B3 (20mM Imidazole)洗雜純化產物；泳道6 PB Buffer B4 (40mM Imidazole)洗雜純化產物；泳道7 PB Buffer B5 (60mM Imidazole)洗雜純化產物；泳道8 PB Buffer B6 (80mM Imidazole)洗雜純化產物；泳道9 PB Buffer B7 (IOOmM Imidazole)洗脫純化產物；泳道10 PB Buffer B8 (200mM Imidazole)洗脫純化產物；泳道11 PB Buffer B9 (500mM Imidazole)洗脫純化產物；泳道12 :相對分子質量蛋白質marker。
具體實施例方式實施例Iー種豬圓環(huán)病毒2型重組亞單位疫苗，主要由豬圓環(huán)病毒2型融合蛋白rYSORF和佛氏不完全佐劑組成，所述的融合蛋白rYSORF中加入的佛氏佐劑是佛氏不完全佐劑，先將純化后的融合蛋白調至lmg/ml，按佛氏不完全佐劑與融合蛋白的體積比為1:1在攪拌狀態(tài)下加入。實施例2ー種豬圓環(huán)病毒2型重組亞單位疫苗的制備方法，所述方法的具體步驟如下SOEing PCR 合成人工基因 YSORF據文獻報道，PCV2病毒基因組的主要有兩個開放閱讀框0RF1和0RF2。其中，ORFl編碼與復制相關的蛋白，具較弱的免疫保護性，其免疫優(yōu)勢區(qū)在180 220aa附近；而01^2編碼病毒的主要結構蛋白，是PCV2主要免疫保護性蛋白，其免疫優(yōu)勢區(qū)在60 210aa。將ORFl和0RF2蛋白免疫優(yōu)勢區(qū)截取出來，并以柔性肽(G4S)5連接2個免疫優(yōu)勢區(qū)形成融合蛋白rYSORF的氨基酸序列，然后利用生物信息學軟件Vector NTI對該序列進行密碼子優(yōu)化，獲得人工基因YSORF序列，同時在序列5’端加入BamH I，3’端加入終止密碼子TAA和Xho I。以上述序列為模板設計引物，每條引物長約59bp，且相鄰兩條引物之間有16bp的重疊(引物序列見表1)，按設計流程(圖I)采用SOEing PCR方法合成人工基因YS0RF，PCR 循環(huán)條件為94°C預變性 5min ;94°C 30sec,50°C 30sec，72°C 30sec 10 個循環(huán)，94°C30sec，55°C 30sec，72°C 30sec 25 個循環(huán)；72°C延伸 7min，PCR產物經 I. 2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄，結果見圖2。將按上述PCR產物進行切膠回收，回收純化的DNA片段進行T/A克隆，將人工合成的基因YSORF片段連接到T/A克隆載體pMD-18獲得pMD-18-YSORF，轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆子并進行測序驗證，由上海生工完成，測序正確的克隆子用于載體的構建。 表I人工合成基因YSORF所需的引物
權利要求
1.一種豬圓環(huán)病毒的2型重組亞單位疫苗，其特征在于所述的亞單位疫苗主要由豬圓環(huán)病毒2型融合蛋白rYSORF和佛氏佐劑組成。
2.根據權利要求I所述的豬圓環(huán)病毒的2型重組亞單位疫苗，其特征在于所述的融合蛋白rYSORF中加入的佛氏佐劑是佛氏不完全佐劑，先將純化后的融合蛋白調至lmg/ml，按佛氏不完全佐劑與融合蛋白的體積比為1:1在攪拌狀態(tài)下加入。
3.一種豬圓環(huán)病毒2型重組亞單位疫苗的制備方法，其特征在于包括下述步驟 O構建人工基因YSORF: 選取豬圓環(huán)病毒2型ORFl和0RF2蛋白免疫優(yōu)勢區(qū)，利用生物信息學優(yōu)化密碼子，形成人工基因序列，命名為YSORF ;設計引物，利用重疊PCR(SOE)技術拼接YS0RF，該序列包含柔性肽(G3S)5，連接ORFl和0RF2蛋白免疫優(yōu)勢區(qū)；然后利用生物信息學軟件Vector NTI對該序列進行密碼子優(yōu)化，獲得人工基因YSORF序列； 2)構建重組表達載體rYSORF； 3)融合蛋白rYSORF的誘導表達； 在TB液體培養(yǎng)基中誘導表達，優(yōu)化表達條件促進融合蛋白在上清中表達； 4)分離純化大腸桿菌表達的豬圓環(huán)病毒2型重組蛋白； 5)利用純化的豬圓環(huán)病毒2型融合蛋白，輔以佛氏不完全佐劑，制備成豬圓環(huán)病毒2型重組亞單位疫苗。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中融合蛋白rYSORF表達條件的優(yōu)化是將含有人工基因YSORF的工程菌按1/500接種液體TB培養(yǎng)基，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)至0D600 ^ I. O時，加入誘導劑IPTG至0. 05mM和表面活性劑SDS至0. 05%, 40°C誘導培養(yǎng)6小時，獲得可溶性融合蛋白rYSORF。
5.一種構建人工基因YS0RF，其特征在于所述基因YSORF序列包含序列表中SEQIDN0. I、SEQ IDN0. 2和SEQ IDN0. 3，且分別位于人工基因YSORF序列的上游、中部和下游。
6.一種融合蛋白rYSORF，其特征在于所述融合蛋白rYSORF序列包含序列表中的SEQIDN0. 4、SEQ IDN0. 5和SEQ IDN0. 6，且位于融合蛋白rYSORF序列氨基端、中部和羧基端。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種豬圓環(huán)病毒的2型重組亞單位疫苗及其制備方法，將豬圓環(huán)病毒2型ORF1和ORF2基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)進行合理組合，利用生物信息學和SOEing PCR技術優(yōu)化密碼子，獲取人工基因序列YSORF，構建到原核表達載體，利用大腸桿菌表達重組融合蛋白，經適度純化后與佐劑混合制備出含有ORF1和ORF2蛋白片段的亞單位疫苗。本發(fā)明創(chuàng)造性地以柔性肽將豬圓環(huán)病毒2型ORF1和ORF2基因優(yōu)勢表位區(qū)串聯組合，既增加了表位數量，又有利于融合蛋白正確空間構象的形成；同時還對ORF1和ORF2的密碼子進行了優(yōu)化，增加融合蛋白的表達量，降低了生產成本。本發(fā)明生產的疫苗具有產量高、成本低、保護力強等優(yōu)點，適宜于大規(guī)模生產。
文檔編號C07K19/00GK102813918SQ201210286278
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月13日 優(yōu)先權日2012年8月13日
發(fā)明者吳紅云, 鄭鳴, 徐進, 李厚偉 申請人:鄭州后羿制藥有限公司