一種利用誘導(dǎo)脂質(zhì)體融合來(lái)制備雙載或多載脂質(zhì)體的技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種利用誘導(dǎo)脂質(zhì)體融合來(lái)制備雙載或多載脂質(zhì)體的技術(shù)。本發(fā)明利用誘導(dǎo)脂質(zhì)體融合來(lái)制備雙載或多載的脂質(zhì)體。而且本發(fā)明為制備雙載或多載的脂質(zhì)體提供了可行的解決方案，且所得的脂質(zhì)體依然能夠通過(guò)實(shí)現(xiàn)兩種或多種藥物組織和細(xì)胞水平的共定位，在體內(nèi)外實(shí)現(xiàn)兩種或多種藥物的協(xié)同作用，為臨床安全有效的聯(lián)合用藥提供了一種新的選擇。
【專利說(shuō)明】
一種利用誘導(dǎo)脂質(zhì)體融合來(lái)制備雙載或多載脂質(zhì)體的技術(shù)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及采用誘導(dǎo)脂質(zhì)體融合的方法來(lái)制備同時(shí)載帶雙藥 或多藥的脂質(zhì)體。
【背景技術(shù)】
[0002] 在疾病的治療中采用兩種或兩種以上的治療藥物是一個(gè)常見(jiàn)的現(xiàn)象，特別是對(duì)腫 瘤的治療，往往不可能采用一種藥物而治愈。如果兩藥或多藥之間有協(xié)同治療效果，特別是 協(xié)同機(jī)制需要共同定位于同一靶細(xì)胞或靶組織，那么將兩藥或多藥共載于同一納米載體內(nèi) (簡(jiǎn)稱共載載體)則很有可能較單純的聯(lián)合給藥更有助于提高藥效。這主要是因?yàn)楣草d載體 可實(shí)現(xiàn)將藥物按照更接近于最佳配比的，并且近乎完全同時(shí)的遞送到靶細(xì)胞或靶組織。
[0003] 脂質(zhì)體是藥劑學(xué)領(lǐng)域中最重要的藥物遞送載體之一，是目前業(yè)界研究最廣泛的納 米載體之一，其作為腫瘤靶向載體的研究特別值得關(guān)注。目前已有單載的脂質(zhì)體產(chǎn)品上市 且在臨床廣泛的應(yīng)用如阿霉素脂質(zhì)體。也有雙載的脂質(zhì)體如CPX351(阿糖胞苷/柔紅霉素） 已經(jīng)結(jié)束II期臨床研究，效果良好，即將進(jìn)入III期臨床研究。因此可見(jiàn)，雙載或多載的脂質(zhì) 體是具有潛在應(yīng)用前景的新型遞藥系統(tǒng)。
[0004] 目前，為實(shí)現(xiàn)兩種藥物的共載，常用的方法是采用兩步的"離子梯度法"（即remote loading)，為形成脂質(zhì)雙層膜內(nèi)外的離子梯度，常常需要引入離子試劑（即ionophores)或 金屬離子如Mn2+，Cu2+，C 〇2+等等，這些方法往往步驟繁瑣，且處方組成復(fù)雜。在包載過(guò)程 中，往往由于不同的藥物同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)磷脂分子的結(jié)合位點(diǎn)，而導(dǎo)致藥物分子的包封率降低。除 此以外，對(duì)于不能用離子梯度法進(jìn)行載帶的藥物則會(huì)對(duì)該方法提出挑戰(zhàn)。
[0005] 脂質(zhì)雙層膜融合是自然界在細(xì)胞相關(guān)的活動(dòng)中已有的現(xiàn)象，如精子對(duì)卵子的融 合，病毒通過(guò)對(duì)宿主細(xì)胞膜的融合等等都是利用細(xì)胞膜的融合實(shí)現(xiàn)的。隨著人造生物膜的 出現(xiàn)，該現(xiàn)象又被用于細(xì)胞膜表面修飾，制備脂質(zhì)包裹的材料等等方面。脂質(zhì)雙層膜融合一 般而言不會(huì)自行發(fā)生，但在誘導(dǎo)劑如酸、堿、熱、離子或特定的蛋白等存在下就可順利進(jìn)行。 一般而言，該利用誘導(dǎo)脂質(zhì)體融合制備雙載或多載脂質(zhì)體的方法主要思路是，先制備各自 單載的脂質(zhì)體，再將兩種脂質(zhì)體混合，在一定誘導(dǎo)條件下，促使單載的脂質(zhì)體相互融合而形 成雙載甚至多載的脂質(zhì)體。本發(fā)明首次將脂質(zhì)雙層膜融合現(xiàn)象應(yīng)用到制備雙載或多載脂質(zhì) 體的領(lǐng)域，為制備該類脂質(zhì)體的制備提供新思路和新方法。并且該方法不僅可用于兩種或 兩種以上的藥物，也可以適用于順磁性MRI對(duì)比劑和藥物的組合，或者其他具有治療意義的 化合物組合等等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是分別制備載帶單藥的脂質(zhì)體。對(duì)此首先要考慮 后續(xù)所可能要選用的誘導(dǎo)融合的條件，因?yàn)椴煌恼T導(dǎo)融合條件所需要的磷脂材料并不相 同。
[0007] 對(duì)于采用以靜電相互作用作為誘導(dǎo)融合條件的，應(yīng)先制備兩種帶相反電荷的脂質(zhì) 體。即分別制備帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體和帶正電荷的脂質(zhì)體。
[0008] 對(duì)于采用陽(yáng)離子如氫離子(H+)、鈣離子(Ca2+)和鎂離子(Mg2+)和誘導(dǎo)融合的，應(yīng)先 制備帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體或是pH敏感的脂質(zhì)體。
[0009] 對(duì)于采用陰離子如檸檬酸、EDTA、磷酸根、硫酸根、醋酸等來(lái)誘導(dǎo)融合的，應(yīng)先制備 帶正電荷的脂質(zhì)體。
[0010] 對(duì)于采用聚陽(yáng)離子聚合物如聚賴氨酸、聚組氨酸等等來(lái)誘導(dǎo)融合的，應(yīng)先制備帶 負(fù)電荷的脂質(zhì)體。
[0011] 對(duì)于采用聚陰離子聚合物如聚谷氨酸、聚天冬氨酸等等來(lái)誘導(dǎo)融合的，應(yīng)先制備 帶正電荷的脂質(zhì)體。
[0012] 也可采用一些特殊的融合誘導(dǎo)劑來(lái)誘導(dǎo)脂質(zhì)體融合，這樣的誘導(dǎo)劑包括聚乙二 醇、磷脂酶、α-生育酚、聚胺、凝集素、質(zhì)粒DNA、RNA、siRNA及某些多肽和蛋白（如膜聯(lián)蛋白 VII、網(wǎng)格蛋白等等）。
[0013] 也可采用一些特殊的理化條件，如溫度、滲透壓等等。
[0014] 帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體可以采用的帶負(fù)電荷的脂質(zhì)材料來(lái)制備。其中可采用帶負(fù)電荷 的磷脂。磷脂由一個(gè)頭部和兩個(gè)尾部組成。頭部由磷酸與水溶性分子如膽堿、絲氨酸酯化形 成，可溶于水，向下延伸的兩條平行尾部是與油分子相似的脂肪酸鏈，每條鏈有10-24個(gè)碳 原子和0-6個(gè)雙鍵，不溶于水。通常由于頭部帶有負(fù)電荷的基團(tuán)而成為負(fù)電荷的脂質(zhì)，包括 各種來(lái)源的磷脂酰膽堿(卵磷脂）、氫化卵磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、磷脂酰糖 酐、磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血磷脂、二鯨蠟磷酸酯(DCP)等。還 可能包含荷負(fù)電的脂質(zhì)體材料如，膽固醇、PEG化磷脂等等。還可能包含荷負(fù)電的糖脂如單 半乳糖-和二乳糖-甘油二酯(MDGD，DGDG)。其中膽固醇也可以采用帶負(fù)電荷基團(tuán)的膽固醇 衍生物來(lái)代替，如膽固醇琥珀酸酯(CHEMS)從而得到荷負(fù)電的脂質(zhì)體。
[0015] 帶正電荷的脂質(zhì)體可以采用的陽(yáng)離子脂質(zhì)材料包括DC-CH0L(CAS :166023-21-8)、 硬質(zhì)酰胺等帶正電荷的脂質(zhì)衍生物。也包括帶正電荷的磷脂材料如，〇(^4?(0六5:132172-61-3)、D0TAP(CAS:144189-73-1)、DMTAP(CAS:197974-74-6)、16:0TAP(139984-36-4)、DDAB (CAS:3700-67-2)、D0BAQ(CAS:1360461-69-30)、D0DAP(CAS:127512-29-2)、16:0TAP(CAS: 72719-84-7)、18 : 0TAP(220609-41-6)、12 : 0EPC(EPC為乙酰化磷脂酰膽堿的簡(jiǎn)稱，CAS: 474945-22-7)、14:0EPC(CAS:186492-53-5)、14:1EPC(CAS:1246304-44-8)、16:0EPC(CAS: 328250-18-6)、18:0EPC(CAS:328268-13-9)、18:1EPC(CAS:474945-24-9)、16:0-18:1EPC (CAS:328250-19-7)、D0TMA(CAS:104872-42-6)、MVL5(CAS:464926-03-2)、D0SPA(CAS: 168479-02-5)、DMRIE(CAS:153312-64-2)、DLinDMA(CAS:871258-12-7)、DMPE(CAS:998-07- 2) 、18:1co9TAP(CAS:104162-48-3)、D0DAP(CAS:127512-29-2)、D0BAQ(CAS:1360461-69- 3) 、14:0DAP(CAS:72719-84-7)、16:0DAP(CAS:96326-74-8)、18:0DAP(CAS:121315-93-3)等 等。
[0016] 上述合成陽(yáng)離子磷脂命名原則是：
[0017] 1，均是按照磷酸酯的種類進(jìn)行分類如三甲酰胺丙烷縮寫為TAP;
[0018] 2,兩條脂肪酸鏈一致的：如:二油酰三甲酰胺丙烷，縮寫為D0TAP;
[0019] 3,脂肪酸的表示方法為:脂肪酸(Cm:Zcox)，rn表示碳原子個(gè)數(shù)，Z表示不飽和雙鍵的 數(shù)量，ω χ表示雙鍵位置。
[0020] ⑴飽和脂肪酸 013-(012)11-〇)0!1，111 = 11+2,2 = 0。如肉豆蔻酸((：14:0)，棕櫚酸((：16: 〇)，硬脂酸(C18:0)
[0021] ⑵不飽和脂肪酸CH3-(CH2)x-CH = CH-(CH2)y-⑶0Η，Ζ為非0常數(shù)。如油酸（C18:l ω9)，芥酸(C22:lco 9)
[0022] pH敏感的脂質(zhì)體分為PE-脂質(zhì)體和PC-脂質(zhì)體，也包括PS構(gòu)成的脂質(zhì)體。這些脂質(zhì) 體低pH融合作用有時(shí)需要輔助介質(zhì)如多聚組氨酸、植物血凝素等等。常用的pH敏感脂質(zhì)成 分包括:DPSG、D0SG、油酸(0A)、PHC或膽固醇衍生物CHEMS、N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)等等。 部分的pH敏感脂質(zhì)體的組成成分如下表：
[0023]表1 pH敏感脂質(zhì)體組成成分
[0024]
[0025] -般應(yīng)根據(jù)藥物的性質(zhì)選用合適的制備方法，常用的制備方法主要分為如下幾 類:一是以干燥的脂膜、脂類粉末為基礎(chǔ)的制備方法，包括薄膜分散法、有機(jī)溶劑凍干再水 化法、噴霧干燥法、逆向蒸發(fā)法、流化床包衣法、單相溶液凍干法、冷凍干燥法、以交叉過(guò)濾 法去除表面活性劑的方法制備脂質(zhì)體、擠出法等等。二是以乳劑為基礎(chǔ)的方法。包括反相蒸 發(fā)法、二次乳化法等等。三是以混合膠團(tuán)為基礎(chǔ)的脂質(zhì)體制備技術(shù)，其中包括磷脂可以和某 些表面活性劑如膽鹽形成混合膠團(tuán)，當(dāng)采用交叉流透析等手段逐步除去膽鹽后，剩余的磷 脂就會(huì)聚集形成脂質(zhì)體。形成的脂質(zhì)體的大小和表面活性劑的種類、磷脂/表面活性劑的質(zhì) 量比、混合膠團(tuán)的濃度，以及透析的條件都有關(guān)系。如去污劑分散法。四是以乙醇/磷脂/水 三相混合物為基礎(chǔ)的脂質(zhì)體制備方法，如注入法、交叉流注射技術(shù)、Alza公司的技術(shù)等等； 其中Alza公司的技術(shù)主要包括調(diào)整乙醇、磷脂、水3種組分的比例，使其落到脂質(zhì)體區(qū)，形成 不均勻的脂質(zhì)體，之后再使用擠出、均質(zhì)等手段將其處理成小顆粒的脂質(zhì)體。五是主動(dòng)載藥 制備方法，如離子梯度法、pH梯度法、硫酸銨梯度法、醋酸鈣梯度法等等。主動(dòng)載藥技術(shù)與被 動(dòng)載藥技術(shù)的差異就在于脂質(zhì)體的形成和藥物的裝載不在同一個(gè)步驟中完成。其制備工 藝通常包括如下步驟:①制備空白脂質(zhì)體;②通過(guò)透析、柱層析等手段創(chuàng)造特定的脂質(zhì)體膜 內(nèi)外梯度;③在合適的條件下，將已形成梯度的空白脂質(zhì)體和待包封的藥物孵育，以便完成 藥物的裝載。六是機(jī)械分散法，如超聲波分散法、手搖法等等。七是鈣融合法。該法利用由酸 性磷脂組成的小囊泡，在鈣存在條件下發(fā)生聚集，相繼融合。八是氣泡方法。該方法是為了 避免有機(jī)溶劑、去污劑、高切應(yīng)力對(duì)所包裹物質(zhì)組分的破壞，1994年由Tal sma等報(bào)道了一種 惰性氣體通入脂質(zhì)懸液，通過(guò)產(chǎn)生氣泡制備脂質(zhì)體的方法。
[0026] 本發(fā)明所解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是尋找恰當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)兩種或幾種單載脂質(zhì)體發(fā)生 融合的條件。并以所得雙載或多載脂質(zhì)體的融合率、兩種或幾種藥物的包封率、融合中的泄 漏率、融合后脂質(zhì)體的理化性質(zhì)等綜合指標(biāo)為篩選因素對(duì)融合條件進(jìn)行優(yōu)化。
[0027] 在脂質(zhì)體融合進(jìn)行之前，首先分別各自單載的脂質(zhì)體的多種制劑學(xué)指標(biāo)進(jìn)行全面 詳細(xì)地考察，這些因素主要包括藥物包封率、脂質(zhì)體中藥物濃度、脂質(zhì)體中總脂質(zhì)含量、藥 物載藥量、脂質(zhì)體粒徑及分布等等。上述指標(biāo)也作為篩選融合條件的參考因素。
[0028] 定量測(cè)定無(wú)機(jī)磷酸鹽的方法包括Fiske和Subbarow分析法、HPLC法、31P-NMR光譜 法、薄層色譜分析等等。其中F i s ke和Subbar ow分析法同時(shí)具備簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確和高度重現(xiàn)性的 特點(diǎn)，使之成為測(cè)定磷脂儲(chǔ)備液或LUV制劑中磷脂濃度的基本方法。該分析方法的原理是： 高氯酸能使磷釋放，并將其氧化成為磷酸根離子，所形成的有色復(fù)合物可用分光光度法定 量。HPLC采用紫外吸收檢測(cè)器，分析方法簡(jiǎn)單，使用范圍廣泛，并且可同時(shí)將大豆磷脂中的 PC、PE、PI、PA和LPC定量。對(duì)于31P-NMR光譜法，采用CS-EDTA處理后的卵磷脂溶液，圖譜譜線 變窄，信號(hào)彼此分離。常規(guī)分析中，磷脂試樣的量為15_20mg，最低檢測(cè)量為0.05%。此方法 與脂肪酸的分布無(wú)關(guān)，而僅與頭部磷所處的化學(xué)環(huán)境相關(guān)，試樣中除磷以外的雜質(zhì)均不會(huì) 影響結(jié)果。用TLC法分離磷脂的各組分，優(yōu)點(diǎn)在于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，分離條件易掌握，可 采用顯色劑如二氧化錳、茚三酮和羅丹明等對(duì)磷脂進(jìn)行顯色，且結(jié)果直觀。
[0029] 對(duì)于帶相反電荷的脂質(zhì)體進(jìn)行融合時(shí)，一般以靜電相互作用和熱誘導(dǎo)相結(jié)合的誘 導(dǎo)融合條件進(jìn)行。兩種或幾種單載脂質(zhì)體融合時(shí)所采用的比例的計(jì)算，用脂質(zhì)含量的比例 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。兩種或幾種單載脂質(zhì)體中藥物的混合比例，應(yīng)該根據(jù)實(shí)際配伍藥物最佳療效 所需的比例進(jìn)行。融合后脂質(zhì)體的粒徑、zeta電位、包封率等理化性質(zhì)均會(huì)發(fā)生變化。誘導(dǎo) 所需的融合溫度、融合時(shí)間及融合的介質(zhì)等條件均以得到最佳的融合脂質(zhì)體為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩 選。
[0030] 在脂質(zhì)體融合的前后，我們可采用一些分析方法，來(lái)監(jiān)測(cè)脂質(zhì)體膜成分的混合或 內(nèi)水相內(nèi)容物的合并。因?yàn)橹|(zhì)體融合的方式分為部分融合和完全融合。眾所周知，脂質(zhì)體 是由單層或多層的磷脂雙分子層構(gòu)成。融合時(shí)若融合地很徹底，即脂質(zhì)雙層膜均發(fā)生了融 合，則脂質(zhì)體的內(nèi)水相混合起來(lái)，這種融合即為完全融合。融合時(shí)如果僅有外層的脂質(zhì)發(fā)生 融合，內(nèi)層脂質(zhì)并未融合，且內(nèi)水相并沒(méi)有完全混合的方式，稱為部分融合。故為區(qū)分并全 面地評(píng)估脂質(zhì)體融合的方式，應(yīng)采取多種監(jiān)測(cè)方式。主要是既要采用易于插膜的熒光探針， 又要采用水溶性的熒光探針。幾種分析方法可以互為補(bǔ)充來(lái)對(duì)脂質(zhì)體融合的過(guò)程進(jìn)行全面 的評(píng)價(jià)。
[0031] 常用的脂質(zhì)體融合的熒光分析法包括鋱/二吡啶羧酸分析法，氨基萘三磺酸/對(duì)-二甲苯二溴化吡啶分析法，NBD/羅丹明共振能量轉(zhuǎn)移法等等。對(duì)于鋱/二吡啶羧酸分析法， 鋱(Tb)和二吡啶羧酸(DPA)相互作用生成熒光絡(luò)合物[Tb(DPA) 3]3'通過(guò)DPA向Tb遞送內(nèi)能 而產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度可增加4個(gè)數(shù)量級(jí)。反應(yīng)物最初包封在不同的磷脂囊泡群內(nèi)，膜融合 使熒光增強(qiáng)。介質(zhì)中含有低濃度的EDTA可阻止釋放到外部介質(zhì)中的內(nèi)容物發(fā)生上述作用。 對(duì)于氨基萘三磺酸/對(duì)-二甲苯二溴化吡啶(ANTS/DPX)分析法，DPA在pH5左右時(shí)的質(zhì)子化作 用會(huì)干擾Tb/DPA復(fù)合物的形成，在研究低pH-誘導(dǎo)的脂質(zhì)體融合時(shí)，要求建立新的不受低pH 顯著影響的分析方法。ANTS/DPX分析法是基于ANTS熒光被DPX碰撞淬滅的原理，二者最初包 封在不同的脂質(zhì)體群中。融合使ANTS與DPX在兩種脂質(zhì)體內(nèi)發(fā)生相互作用，ANTS熒光淬滅。 若脂質(zhì)體內(nèi)容物釋放到介質(zhì)內(nèi)而被稀釋，則實(shí)質(zhì)上不會(huì)發(fā)生熒光淬滅，因?yàn)檫@一過(guò)程需要 高濃度的DPX。當(dāng)某一熒光團(tuán)（即能量供體）的發(fā)射光譜與另一熒光團(tuán)（即能量受體）的激發(fā) 光譜重疊時(shí)，供體吸收光子產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)能量非輻射地轉(zhuǎn)移給受體，此過(guò)程稱為共振能量 轉(zhuǎn)移(FRET)。許多熒光團(tuán)對(duì)都曾用來(lái)監(jiān)測(cè)膜融合過(guò)程中脂質(zhì)的混合。這種方法基于如下原 理:膜融合導(dǎo)致直至混合，使供體/受體對(duì)從"標(biāo)記"脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到"非標(biāo)記"脂質(zhì)體，從而被 稀釋。此時(shí)能量轉(zhuǎn)移效率低。通常用低于總脂質(zhì)量lmol%的低濃度探針進(jìn)行FRET測(cè)定，以減 小膜擾動(dòng)的程度。一個(gè)常被使用的FRET對(duì)，N-(7-硝基芐基-2-氧雜-1，3-重氮-4-基)磷脂酰 乙醇胺(N-NBD-PE)和N-(麗絲胺羅丹明B磺?；?磷脂酰乙醇胺(N-Rh-PE)，這些探針在膜之 間沒(méi)有任何顯著的交換，且熒光團(tuán)連接再PE的頭基上，不會(huì)引起雙分子層排列的明顯擾動(dòng)。 使用FRET對(duì)時(shí)，關(guān)鍵是要確定在預(yù)期不發(fā)生融合，或脂質(zhì)體聚集但不融合的條件下，不發(fā)生 脂質(zhì)混合。某些條件下，在沒(méi)有內(nèi)容物混合時(shí)也可觀察到脂質(zhì)混合，即發(fā)生了上述的"部分 融合"，即相互作用的脂質(zhì)體外層的單分子層相互混合，而內(nèi)水相沒(méi)有發(fā)生任何直接的接 觸。
【具體實(shí)施方式】
[0032]以下通過(guò)對(duì)本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的描述說(shuō)明但不限制本發(fā)明。
[0033] 一、用誘導(dǎo)正-負(fù)電荷脂質(zhì)體融合的方法制備共載鹽酸米托蒽醌(ΜΤ0)和潑尼松龍 磷酸鈉(PLP)的脂質(zhì)體
[0034]米托蒽醌(ΜΤ0)為細(xì)胞周期非特異性化療藥物，活性高，抗癌譜廣。1987年FDA批準(zhǔn) ΜΤ0上市用于治療急性非淋巴性白血病，后又將多發(fā)性硬化癥、前列腺癌、原發(fā)性肝癌、晚期 乳腺癌、惡性淋巴癌和前列腺癌列為其適應(yīng)癥。ΜΤ0作用機(jī)制在于抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活 性、干擾RNA的合成、嵌入DNA和形成交叉鍵鏈并誘導(dǎo)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。目前我國(guó)上市的制劑 有鹽酸米托蒽醌注射液。游離ΜΤ0的使用常伴隨惡心、嘔吐、脫發(fā)、皮疹、嚴(yán)重骨髓抑制和心 臟毒性等不良反應(yīng)，以致其臨床應(yīng)用受到限制。因此，生物可降解、毒副作用低、治療效果好 的新型ΜΤ0給藥系統(tǒng)一直是研究的熱點(diǎn)。目前ΜΤ0新型給藥系統(tǒng)主要包括載ΜΤ0脂質(zhì)體及殼 聚糖修飾的載ΜΤ0脂質(zhì)體等。這些ΜΤ0給藥系統(tǒng)均可在一定程度上改變?chǔ)?的體內(nèi)分布以減 小游離ΜΤ0的毒副作用。
[0035]糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCs)是由腎上腺皮質(zhì)分泌的類固醇激素，且早就 被發(fā)現(xiàn)能夠抑制胸腺細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和白血病細(xì)胞的增殖，并能誘導(dǎo)這些細(xì)胞凋亡，因此， 潑尼松、潑尼松龍及地塞米松等GCs類藥物被臨床廣泛用于抗炎，治療自身免疫性疾病、淋 巴細(xì)胞性白血病和淋巴瘤。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，GCs還能抑制上皮細(xì)胞及多種上皮 來(lái)源的腫瘤細(xì)胞的增殖，其在腫瘤治療過(guò)程中發(fā)揮著日益重要作用，包括作為化療方案的 藥物之一以直接抗腫瘤、治療腫瘤的合并癥及緩解腫瘤治療相關(guān)不良反應(yīng)等。相關(guān)研究表 明，GCs抗癌作用機(jī)理主要包括：1、抑制bFGF、G-CSF及IL-1等促血管生成因子的合成，2、抑 制氧自由基作用，3、抑制水腫滲出蛋白和腫瘤相關(guān)炎癥介質(zhì)的分泌，如TAMs，4、破壞腫瘤生 長(zhǎng)基質(zhì)的形成，5、降低腫瘤細(xì)胞糖代謝率，抑制腫瘤細(xì)胞生成。為了增強(qiáng)GCs藥物的抗腫瘤 效果，目前采用的制劑學(xué)手段仍然是將GCs包載于脂質(zhì)體中，其中以載潑尼松龍(PLP)脂質(zhì) 體研究最多。臨床上有將ΜΤ0和PLP聯(lián)合用于前列腺癌、乳腺癌等腫瘤的研究報(bào)道，特別是在 前列腺癌的治療中療效確切。
[0036] 采用單因素對(duì)PLP-MT0-HM1:15進(jìn)行制備工藝優(yōu)化，以期達(dá)到：1、具有優(yōu)良的脂質(zhì) 體制劑學(xué)性質(zhì)，2、獲得較為緩慢的釋放速率，3、增強(qiáng)體內(nèi)外抗癌效果，4、減小游離ΜΤ0的體 內(nèi)毒性。以Flk-GFP轉(zhuǎn)基因綠色熒光斑馬魚為動(dòng)物模型考查L(zhǎng)HD7的在體新生血管抑制作用。 以bFGFR高表達(dá)的小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16F10和bFGFR低表達(dá)的小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26為 模型，考察PLP-MT0-HM1:15的選擇性細(xì)胞活力抑制作用和細(xì)胞攝取促進(jìn)作用。建立CT26和 B16F10皮下瘤模型，考查PLP-MT0-HM1:15的體內(nèi)抑瘤效果和安全性，并采用免疫組化技術(shù) 對(duì)其抑瘤機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究。
[0037] 腫瘤在沒(méi)有血管提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)的情況下生長(zhǎng)不會(huì)超過(guò)2mm3,因此，腫瘤新生血 管作為維持腫瘤細(xì)胞快速增殖的功能單元必須為腫瘤組織提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，以促進(jìn) 腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。腫瘤新生血管的形成是一個(gè)復(fù)雜的多因子和多信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的 結(jié)果，目前研究認(rèn)為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血小板衍 生生長(zhǎng)因子(PDGF)是最為關(guān)鍵的幾種促血管生長(zhǎng)因子。近年來(lái)以腫瘤新生血管為靶標(biāo)的治 療策略已發(fā)展成為當(dāng)今腫瘤領(lǐng)域研究的重要方向之一。
[0038] 肝素是一種重要的抗凝藥物，近來(lái)發(fā)現(xiàn)肝素還具有抗腫瘤、抗炎癥及抗病毒等生 物學(xué)作用，作用機(jī)制主要在于特異性抑制VEGF、bFGF、PDGF-i3及P-選擇素等促血管生成因 子，以實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、粘附、侵襲、迀移和轉(zhuǎn)移及抗新生血管生成的雙重作用。臨床 實(shí)驗(yàn)表明，低分子量肝素 (Low Molecular Weight Heparin，LMWH)聯(lián)合化療藥物治療中晚 期惡性腫瘤可提高腫瘤患者的生存率，然而LMWH抗凝作用導(dǎo)致的出血現(xiàn)象限制了其在抗腫 瘤方面的進(jìn)一步應(yīng)用。為了降低LMWH的抗凝作用并增強(qiáng)其抗腫瘤活性，目前采用的方式主 要是設(shè)計(jì)LMWH衍生物。Kyeongsoon Park等設(shè)計(jì)了LMWH-去氧膽酸自組裝膠束(LHD)并用其 包載阿霉素，結(jié)果表明LHD包載的阿霉素 (DHN20)可顯著增強(qiáng)LHD和游離阿霉素的體內(nèi)抗癌 效果。脂質(zhì)體可借助腫瘤血管特有的EPR效應(yīng)以增加納米顆粒在腫瘤血管處的滯留。普通 脂質(zhì)體存在EPR效應(yīng)不明顯、血漿清除率高及特異性較差等缺點(diǎn)；而表面修飾的主動(dòng)靶向脂 質(zhì)體則既可以高度靶向于特定的腫瘤細(xì)胞從而增加療效，又可以減少腫瘤藥物對(duì)正常細(xì)胞 的損害。本項(xiàng)目利用LMWH膽酸類衍生物L(fēng)HD修飾的脂質(zhì)體來(lái)提高脂質(zhì)體對(duì)腫瘤血管的靶向 性，同時(shí)起到抑制腫瘤新生血管的作用。
[0039] (1)載ΜΤ0長(zhǎng)循環(huán)陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備
[0040]按HSPC: D0TAP: Choi: DSPE-mPEG2000 = 9: 25:12:12(W/W)稱取一定量膜材置于梨 形瓶中，溶于適量無(wú)水乙醇，40°C水浴下減壓旋蒸lh除掉有機(jī)溶劑，得到空白脂膜。加入 300mmol · L-l(pH 4.0)的硫酸銨溶液，65°C旋轉(zhuǎn)水化60min，探頭超聲5min，室溫透析24h (透析介質(zhì)為，0.1M，pH 7.4)，得到空白脂質(zhì)體。采用硫酸銨梯度法，以ΜΤ0:脂材=3:50 (W/W)加入ΜΤ0儲(chǔ)備液，65°C水浴保溫30min，并通過(guò)sephadexG-25柱去除游離藥物，得到載 ΜΤ0的陽(yáng)離子脂質(zhì)體(ΜΤ0-ΥΜ)。對(duì)于載ΜΤ0的長(zhǎng)循環(huán)陰離子脂質(zhì)體(MT0-CM)，用HSPC代替 D0TAP，其余操作與ΜΤ0-ΥΜ相同。
[0041 ] ΜΤ0-ΥΜ在300mM硫酸銨(4.0)的包封率達(dá)96 %以上，這是由于ΜΤ0與D0X類似，只有 當(dāng)脂質(zhì)體有內(nèi)外水相pH差值>3時(shí)才能利用這種pH梯度作為驅(qū)動(dòng)力把ΜΤ0完全包載到脂質(zhì)體 內(nèi)水相層;另外，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，300mM硫酸銨(pH 4.0)作為ΜΤ0-ΥΜ的水化介質(zhì)，既利用了pH 梯度的這一驅(qū)動(dòng)力，還利用了內(nèi)水相硫酸銨能與ΜΤ0形成ΜΤ0-硫酸銨難溶性復(fù)合物這一驅(qū) 動(dòng)力，從而使ΜΤ0的主動(dòng)包載變得更加容易。
[0042] (2)載PLP長(zhǎng)循環(huán)陰離子脂質(zhì)體的制備
[0043] 按HSPC:Chol :DSPE-mPEG2000 = 3:1:2:1(W/W)稱取一定量膜材置于梨形瓶中，溶 于適量無(wú)水乙醇，40°C水浴下減壓旋蒸lh除掉有機(jī)溶劑，得到空白脂膜。以PLP:脂材= 1:10 (W/W)加入PLP超純水溶液，65 °C旋轉(zhuǎn)水化60min，探頭超聲5min，并通過(guò)sephadexG-25柱去 除游離藥物，得到載PLP的長(zhǎng)循環(huán)陰離子脂質(zhì)體(PLP-CM)。
[0044] (3)共載PLP和ΜΤ0融合脂質(zhì)體的制備
[0045] ?。?)中所得的ΜΤ0-ΥΜ與（2)中所得的PLP-CM，按藥物的藥物比例3 : 5 (W/W，ΜΤ0: PLP)，將兩種脂質(zhì)體混合均勻，加入40mM L-1檸檬酸，誘導(dǎo)融合2h，即得共載ΜΤ0和PLP融合 脂質(zhì)體(PLP-MT0-YM)。
[0046]對(duì)于制備ΜΤ0和PLP共載脂質(zhì)體，研究之初考慮采用最簡(jiǎn)單的共載方法，即將兩種 藥物溶液直接混合后去水化脂質(zhì)膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種藥物混合溶液中出現(xiàn)沉淀，其原因可能 是形成了 MT0-PLP難溶性復(fù)合物，故提示該法不可行。也嘗試先制備單載PLP的脂質(zhì)體，再用 梯度法載ΜΤ0,但是在制備梯度的透析過(guò)程中PLP就已經(jīng)大量泄漏，提示該法亦不可行。 [0047] (4) LHD7修飾的共載ΜΤ0和PLP長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的制備
[0048] 取上述所制得的PLP-MT0-YM，按LHD7:Lipids = l: 15(W/W)將LHD7和PLP-MT0-YM混 合均勻，25°C水浴孵育30min，即得LHD7修飾的共載ΜΤ0和PLP的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(PLP-MT0-ΗΜ1:15)〇
[0049] 對(duì)于LHD7修飾的載ΜΤ0的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(MT0-HM1:15)，將LHD7和ΜΤ0-ΥΜ混合均勻， 其余操作與PLP-MT0-HM1:15相同。
[0050] PLP-MT0-HM1:15的制備則采用簡(jiǎn)單、成熟的后插入法將兩親性靶向材料LHD7插入 到PLP-MT0-YM的磷脂雙分子結(jié)構(gòu)中，此方法既可使靶頭部分(LMWH)全部暴露在脂質(zhì)體外水 相，又不會(huì)引起藥物的泄露。
[0051] (5)兩種脂質(zhì)體的融合率
[0052] 為考察兩種脂質(zhì)體的融合程度，用鋱/吡啶-2,6_二羧酸鈉(TbC13/DPA)分析法進(jìn) 行研究。融合率的計(jì)算方法是，兩種脂質(zhì)體融合后的熒光強(qiáng)度值與用表面活性劑完全消解 兩種脂質(zhì)體的混合液后熒光值的比值。以表面活性劑（10%膽酸鈉)消解脂質(zhì)體后產(chǎn)生的熒 光強(qiáng)度(Fmax)為100%參比，考察不同條件下脂質(zhì)體融合率。[Tb(DPA)3]3-的熒光測(cè)定條件 為Em:277nm;Ex:545nm;Em Slix:5nm;Ex Slix:5nm〇
[0053] 首先篩選了幾種融合誘導(dǎo)劑對(duì)脂質(zhì)體融合率的影響，包括檸檬酸、EDTA和磷酸，結(jié) 果表明脂質(zhì)融合誘導(dǎo)作用大小為檸檬酸〉EDTA>磷酸。接著對(duì)檸檬酸的濃度和作用時(shí)間做出 進(jìn)一步篩選，圖1表明，不同濃度檸檬酸作用下，〇~2h內(nèi)脂質(zhì)體融合率隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增 加，2~3h內(nèi)融合率基本不發(fā)生變化;20~40mM檸檬酸范圍內(nèi)，在40mM時(shí)誘導(dǎo)融合的效率更 高，進(jìn)一步增加檸檬酸濃度并不能顯著增加融合率，因此最佳脂質(zhì)融合誘導(dǎo)條件為:40mM檸 檬酸為融合誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)融合2h。
[0054] (5)融合前后脂質(zhì)體的理化性質(zhì)
[0055] 按照前述方法制備兩種脂質(zhì)體及融合脂質(zhì)體，并測(cè)定各處方脂質(zhì)體的粒徑、PDI及 Zeta電位。如表1-1所示最佳制備工藝下所得脂質(zhì)體粒徑在100~125nm，PDI均〈0.2,粒徑分 布均勾，Zeta電位從-18mV到36mV不等。結(jié)果表明，融合后脂質(zhì)體的粒徑并不會(huì)明顯增加，反 而roi較融合前有所改善。
[0056] 表1-1脂質(zhì)體的粒徑和電位，.x _±.s:，n = 3
[0057]
[0058] (6)脂質(zhì)體的包封率
[0059] 分別測(cè)定ΜΤ0和PLP的包封率，測(cè)定結(jié)果如表1-2所示。最佳制備工藝下制備所得脂 質(zhì)體的包封率均大于95%，其中PLP-MT0-YM的ΜΤ0包封率為95.1% ;PLP包封率分別為 95.7%〇
[0060] 表1_2月旨質(zhì)體的包封率，.X ±s，n = 3
[0062] (7)脂質(zhì)體融合的電鏡照片
[0063]取脂質(zhì)體膠體溶液適量，超純水稀釋至脂質(zhì)濃度約為2mg · mL'2%磷鎢酸溶液負(fù) 染4min，滴至覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，室溫?fù)]干，置透射電鏡下觀察。TEM圖2可見(jiàn)，脂質(zhì)體均呈球 形，外觀圓整，大小均勾，粒徑均在l〇〇nm左右，與粒度測(cè)定儀測(cè)定粒徑結(jié)果基本一致。
[0064] (8)PLP-MT0-YM 的體外釋放
[0065]相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，正常血漿為中性環(huán)境，腫瘤組織為偏酸環(huán)境，腫瘤細(xì)胞胞漿及溶酶 體為酸性環(huán)境，因此，為模擬脂質(zhì)體在正常血漿、腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞內(nèi)的釋放情況，本實(shí) 驗(yàn)選擇三種不同pH值的磷酸鹽緩沖液(pH 5.0、6.8和7.4)作為PLP-MT0-HM1:15的體外釋放 介質(zhì)。
[0066]首先考察了藥物在釋放介質(zhì)中的穩(wěn)定性。稱取一定量的PLP和MT0三份，分別用上 述三種釋放介質(zhì)配制成MT0濃度約為10yg · mL-1的供試品溶液，置于37°C、100r · min-1恒溫 振蕩器中，測(cè)定他、811、2411、4811、9611、12011及14411時(shí)的樣品濃度并觀察色譜圖的峰型。以011 樣品濃度(Co)作為100%，按下列公式計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品濃度(Cn)的變化率以考查藥物在 釋放介質(zhì)中的穩(wěn)定性。如表1-3所示，MT0和PLP在釋放介質(zhì)中放置144h穩(wěn)定。
[0067] 變化率（％)=Cn/C〇X100%
[0068] 表1-3PLP和ΜΤ0在釋放介質(zhì)中的變化率，T 土 s，n = 3
[0071] 隨后進(jìn)了脂質(zhì)體中藥物的釋放。精密量取PLP-MT0-HM1:15膠體溶液0.5mL三份，分 別封裝于纖維素透析袋后立即放于盛有20mL上述不同PBS的具塞錐形瓶中，置于37°C、100r min- 1水平搖床進(jìn)行釋放。分別于卟、211、411、611、811、1211、2411、9611，12011及14411從錐形瓶取樣 1. OOmL，同時(shí)補(bǔ)加等溫roS 1. OOmL。按本節(jié)上述的方法測(cè)定樣品中PLP和ΜΤ0的濃度，計(jì)算 PLP-MT0-HM1:15的累積釋放率。
[0072] 累積釋放率（％ )=釋放到介質(zhì)中的總藥量/加入透析袋中的總藥量X 100%。
[0073] 圖4A可以看出PBS 7.4中，PLP-CM在24h時(shí)累積釋放(52.18±1.84)%，72h基本釋 放完全;ΜΤ0-ΥΜ在72h時(shí)累積釋放(53.56± 2.47) %，144h基本釋放完全，PLP-CM藥物釋放速 度大于]^1'0-￥]\^1^-01+]?1'0-腿1:15中？1^的釋放行為與？1^-01-致，]?1'0的釋放行為與]\〇'0-YM-致;PLP-MT0-HM1:15 中PLP在24h時(shí)累積釋放（38 · 35 ± 2 · 95) %，120h時(shí)PLP基本釋放完 全，其釋放速度小于PLP-CM; PLP-MT0-HM1:15中ΜΤ0在72h時(shí)累積釋放（71 · 11 ± 4 · 60) %， 120h時(shí)ΜΤ0基本釋放完全，其釋放速度大于ΜΤ0-ΥΜ。圖4B可以看出，PLP-MT0-HM1:15中PLP及 ΜΤ0的釋放速率均隨著釋放介質(zhì)pH值下降而依次增大;且當(dāng)pH為6.8時(shí)，兩者在72h均基本釋 放完全，pH下降至5.0時(shí)，48h均基本釋放完全。
[0074] 藥物在到達(dá)腫瘤細(xì)胞前后會(huì)暴露在不同pH值環(huán)境下，因此本文為模擬脂質(zhì)體在體 內(nèi)的釋放情況，分別選用類似正常血漿、腫瘤組織周圍、腫瘤細(xì)胞內(nèi)的三種不同pH值的PBS 作為體外釋放介質(zhì)。釋放結(jié)果顯示，各處方脂質(zhì)體在TOS 7.4中的半衰期均大于20h，表明脂 質(zhì)體均有一定長(zhǎng)循環(huán)作用;PLP-MT0-HM1:15的釋放速率隨釋放介質(zhì)的pH減小而增大，表明 其還具有一定pH敏感性。
[0075]由于ΜΤ0和PLP自身理化性質(zhì)及載藥原理不同，結(jié)果顯示PLP釋放較快，而ΜΤ0釋放 緩慢，故兩種藥物體外釋放速率本身有較大差異;PLP-CM+MT0-HM1:15物理相加組兩種藥物 的釋放行為與藥物單載組一致，表明兩種脂質(zhì)體簡(jiǎn)單混合后互不影響各自藥物的釋放行 為;將MT0和PLP共載于PLP-MT0-HM1:15后，兩種藥物的釋放行為與藥物單載組相比發(fā)生變 化，速率差明顯減小，其原因可能是共載脂質(zhì)體內(nèi)部MT0-PLP復(fù)合物的形成改變了兩種藥物 的釋放行為。
[0076] (9)PLP-MT0_HM1:15 的溶血實(shí)驗(yàn)
[0077] 心臟取血方式，取新鮮兔血10mL，置干凈燒杯中，用玻璃棒順同一方向輕輕攪拌 2min除去纖維蛋白。加入約10倍體積的生理鹽水，輕輕搖勾，3000r mirT1離心15min，棄去上 清液，底部紅細(xì)胞用生理鹽水按照同樣的方法洗滌6次，直到上清液為無(wú)色透明狀，將所得 的紅細(xì)胞用生理鹽水配成2%的混懸液，待用。
[0078] 取潔凈的試管7支，進(jìn)行編號(hào)，依次排列在試管架上，1號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照管，2號(hào)管為 陰性對(duì)照管，3~7號(hào)管為供試品管。按表1-4依次加入2%紅細(xì)胞懸液、生理鹽水、蒸餾水或 脂質(zhì)濃度約40mg mL-1的空白PLP-MT0-HM1:15膠體溶液，混勻后，立即置37±0.5°C的恒溫箱 中溫育3h，并記錄各支試管中溶血情況。溶血反應(yīng)結(jié)束后，3000r mirT1離心15min，用紫外分 光光度計(jì)測(cè)定各管上清液在54 lnm處的吸光度值，按下列公式計(jì)算受試品的溶血率。如表1 -4所示，PLP-MT0-HM1:15的溶血率均小于5%，符合中國(guó)藥典的要求，進(jìn)一步驗(yàn)證PLP-MT0-HM1:15不會(huì)引起明顯的溶血現(xiàn)象。
[0079] 溶血率（％ )=(樣品吸光度-陰性對(duì)照吸光度)/(陽(yáng)性對(duì)照吸光度-陰性對(duì)照吸光 度）X100%〇
[0080] 相關(guān)研究報(bào)道，陽(yáng)離子脂質(zhì)體有一定的溶血性，提示陽(yáng)離子脂質(zhì)體存在一定程度 的安全性問(wèn)題；但試驗(yàn)濃度下PLP-MT0-HM1:15溶血率均小于5%，沒(méi)有發(fā)生明顯的溶血現(xiàn) 象，符合中國(guó)藥典的要求;且小鼠尾靜脈注射脂質(zhì)濃度約80mg ml/VrO-YM試驗(yàn)表明小鼠生 理活動(dòng)正常，體內(nèi)未發(fā)生溶血現(xiàn)象。綜上所述PLP-MT0-HM1:15毒性在可接受范圍內(nèi)，可用于 后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
[0081 ] 表1-4溶血性實(shí)驗(yàn)分組及結(jié)果，T 土s,n = 3
[0082]
[0083] (lO)PLP-MTO-HMl: 15的存儲(chǔ)穩(wěn)定性
[0084] 脂質(zhì)體為磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，磷脂可能由于存儲(chǔ)條件不當(dāng)被氧化從而造成藥物的 泄漏，并影響制劑的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)以粒徑、PDI及包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察PLP-MT0-HM1:15存 儲(chǔ)于4 °C的穩(wěn)定性。圖5可看出PLP-MT0-HM1:15共載體4 °C放置28d，其粒徑、PDI、包封率均無(wú) 明顯變化。
[0085]脂質(zhì)體的磷脂易被氧化且屬于熱不穩(wěn)定性的膠體溶液體系，因此需考察PLP-MT0-HM1:15的4°C存儲(chǔ)穩(wěn)定性，以為后續(xù)研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PLP-MT0-HM1:15置 于4°C放置28d后，其粒徑、PDI及包封率均未發(fā)生顯著變化，這可能與脂質(zhì)體表面親水鏈段 PEG和LMWH共同增加了脂質(zhì)體外部的空間位阻有關(guān)。
[0086] (ll)PLP-MTO-HMl: 15細(xì)胞活力抑制作用
[0087] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16F10(CT26)細(xì)胞，以適當(dāng)濃度接種于96孔板中，每孔100μΙ^37 °C、5 % C〇2孵育24h后，分別加入系列濃度的MT0-CM、ΜΤ0-ΥΜ、ΜΤ0-ΗΜ: 15、PLP-CM+MT0-HM1: 15、PLP-MT0-HM1:15、MT0-HM1:15空白脂質(zhì)（blank-HMl: 15)、MT〇-YM空白脂質(zhì)（blank-YM)及 PLP-CM空白脂質(zhì)(blank-CM) 100yL，并空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照孔。繼續(xù)孵育24h后，每孔加 入20μΙ^度為5mg · mL-1的MTT，振蕩后繼續(xù)孵育4h。吸棄上清，加入DMSO 200yL，37°C恒溫震 搖lOmin，酶聯(lián)免疫測(cè)定儀測(cè)定A57〇,計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和IC 50:
[0088] 活力抑制率（％ ) = (1-實(shí)驗(yàn)孔/陰性對(duì)照孔）X 100%。
[0089] 如圖6所示，實(shí)驗(yàn)濃度下blank-CM及blank-YM組對(duì)CT26及B16F10存活率均在92% 以上，表明脂質(zhì)空白材料對(duì)以上細(xì)胞無(wú)明顯毒性;而blank-HMl: 15在濃度為10mg · ml/1及 20mg · mL-1 時(shí)，CT26存活率分別為（84.34±4.52)%和（76.56±3.07)%，顯著高于B16F10的 (77.68 ± 3.38) %和(51.63 ± 4.61) %。圖7所示，各處方脂質(zhì)體對(duì)CT26及B16F10兩種細(xì)胞的 活力抑制作用均呈濃度依耐性，且同濃度下抑制作用大小均依次為11'0-01僅1'0-￥1〈11'0-HM: 15~PLP-CM+MT0-HM1:15〈PLP-MT0-HM1:15。表 1-5可以看出，兩種細(xì)胞株中，PLP-MT0-HM1:15 的 IC5Q 顯著小于 ΜΤ0-ΥΜ，且顯著小于 PLP-CM+MT0-HM1:15;而 PLP-CM+MT0-HM1:15 和 MT0-HM1:15 的 IC5Q 無(wú)顯著性差異。同時(shí)還可看出，MT0-YM、MT0-HM1:15 及 PLP-CM+MT0-HM1:15 三者對(duì)CT26的活力抑制無(wú)顯著性差異；而MT0-HM1:15和PLP-CM+MT0-HM1:15對(duì)B16F10的活 力抑制顯著大于ΜΤ0-ΥΜ對(duì)其的活力抑制(Ρ〈0·05)。
[0090] 表卜5作用24h時(shí)各處方的IC5〇，！T±s，n = 3
[0091]
[0092] 注：@，與MT0-CM相比有顯著性差異，P〈0.05 ;*，與ΜΤ0-ΥΜ相比有顯著性差異，P〈 0.05; &，與PLP-CM+MT0-HM1:15相比有顯著性差異，P〈0.05。
[0093] (12)細(xì)胞活力抑制的時(shí)間依耐性
[0094] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16F10(CT26)細(xì)胞，以適當(dāng)濃度接種于96孔板中，每孔100μΙ^37 °C、5%C〇2孵育24h，分別加入MT〇-CM、MT〇-YM、MT〇-HM: 15、PLP-CM+MT0-HM1:15及PLP-MT0-HM1:15膠體溶液100yL，使ΜΤ0終濃度為0.5yg · ml/1，并設(shè)空白培養(yǎng)基為陰性對(duì)照孔，繼續(xù)孵 育24h，48h或72h后，按上述（11)的后續(xù)操作進(jìn)行。圖8可知，各處方脂質(zhì)體對(duì)CT26及B16F10 兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用均呈時(shí)間依耐性，且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MT0-CM和ΜΤ0-ΥΜ對(duì)CT26的抑制 率大于對(duì) B16F10 的抑制率;MT0-HM1:15、PLP-CM+MT0-HM1:15 和 PLP-MT0-HM1:15 對(duì) CT26 的抑 制率小于對(duì)B16F10的抑制率，該結(jié)果與（11)中的結(jié)果一致，證實(shí)了 LHD7修飾脂質(zhì)體對(duì) B16F10細(xì)胞的選擇性抑制。
[0095] (13) LHD7修飾的共載ΜΤ0和PLP脂質(zhì)體的體內(nèi)抑瘤
[0096] 本部分內(nèi)容建立CT26和B16F10兩種皮下瘤模型以研究PLP-MT0-HM1:15的體內(nèi)抑 瘤效果，并對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)安全性初步研究；同時(shí)采用免疫組化技術(shù)從分子水平探究PLP-MT0-HM1:15的體內(nèi)抑瘤作用機(jī)制。
[0097]挑選腫瘤體積為 100mm3的小鼠，隨機(jī)分為NS(A)、FM(B)、MT〇-CM(C)、MT〇-YM(D)、 MT0-HM1:60(E)、MT0-HM1:30(F)、MT0-HM1:15(G)、PLP-MT〇-YM(H)、PLP-CM+MT0-HM1:15(1) 及卩1^-]?1'〇-腿1 :15(1)，每組8只小鼠。給藥組按[0 611^.1^-1和（或汗1^1011^.1^-1單次 尾靜脈給藥，NS組注射等體積的生理鹽水，同時(shí)記為第1天。測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)、短徑繪制腫瘤生 長(zhǎng)曲線；稱量小鼠體重繪制體重變化曲線。待NS組平均瘤體積達(dá)4000mm 3左右，脫頸椎處死 各組小鼠，完整剝離腫瘤組織，稱重計(jì)算抑瘤率。
[0098]腫瘤體積(mm3)= 0 · 5 X 長(zhǎng)徑(mm) X 短徑(mm)2。
[0099] 抑瘤率（％ )=(對(duì)照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重X 100%。 [0100] 如圖9所示，NS組小鼠腫瘤體積增長(zhǎng)迅速，11天時(shí)瘤體達(dá)(4483.44±462.42)mm3; 給藥組瘤體增長(zhǎng)則有不同程度的減緩，11天時(shí)MT0-YM、MT0-HM1:60、MT0-HM1:15及PLP-MT0-HM1:15 組僅分別為（1877 · 73±205.47)mm3、（ 1203 · 86± 131.97)mm3、（ 1098 · 76± 127.09)mm3 和（724.38±63.98)mm3。給藥組的抑瘤作用 MT0-YM>MT0-HM1:30~PLP-CM+MT0-HM1:15>MT0-HM1:60>MT0-YM>MT0-CM>FM 組。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分 析，ΜΤ0-ΥΜ組的抑瘤率顯著大于MT0-CM組(P〈0.05);除FM、MT〇-CM組外，其余治療組的抑瘤 率均顯著大于ΜΤ0-ΥΜ組(P〈0 · 05) ;MT0-HM1:15組的抑瘤率顯著大于MT0-HM1:60(P〈0 · 05) 組；PLP-MT0-HM1:15組的抑瘤率顯著大于PLP-CM+MT0-HM1:15和MT0-HM1:15組（Ρ〈0·05); PLP-CM+MT0-HM1:15、PLP-MT0-YM、MT0-HM1:30 和 ΜΤ0-ΗΜ1:15 四組之間的抑瘤率無(wú)顯著性差 異。
[0101] CT26皮下瘤模型中，MT0-HM1:15組的抑瘤率大于MT0-HM1: 30組并顯著大于ΜΤ0-HM1:60和ΜΤ0-ΥΜ組的抑瘤率，說(shuō)明脂質(zhì)表面的LHD7密度越大，其抑瘤效果越明顯，這可能與 LHD7的親水LMWH端可以增加脂質(zhì)在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間以增強(qiáng)新生血管EPR效應(yīng)，從而增強(qiáng)抑 瘤效果相關(guān);PLP-CM+MT0-HM1:15組的抑瘤率與MT0-HM1:15組相當(dāng)，卻顯著小于PLP-MT0-HM1:15組的抑瘤率，說(shuō)明PLP-CM與MT0-HM1:15的物理混合對(duì)ΜΤ0的抑瘤效果增加不明顯，但 當(dāng)PLP與ΜΤ0共載于脂質(zhì)體后，PLP可顯著增加腫瘤細(xì)胞對(duì)ΜΤ0的敏感性。
[0102] (14)小鼠 B16F10皮下瘤的抑制
[0103]挑選腫瘤體積為 100mm3的小鼠，隨機(jī)分為NS(A)、FM(B)、PLP-CM(C)、MT〇-YM(D)、 MTO-HM1:15 (E)、PLP-CM+MTO-HM1:15 (F)及PLP-MT0-HM1:15 (G)組，每組8 只小鼠。如圖 10所 示，NS和PLP組小鼠腫瘤體積增長(zhǎng)迅速，9天時(shí)瘤體分別達(dá)（3600.65 ± 383.70 )mm3和 (3565.56± 397.42)mm3;給藥組瘤體增長(zhǎng)則有不同程度的減緩，9天時(shí)MT0-YM、MT0-HM1:15 及 PLP-MTO-HM1:15組僅分別為（1531 · 34± 188 · 56)mm3、（ 1088 · 32 ± 126 · 45)mm3和（349 · 81 土 47 · 79)mm3。給藥組的抑瘤作用依次為 PLP-MTO-HM1:15>PLP-CM+MT0-HM1:15~MT0-HM1:15> MT〇-YM>FM>PLP-CM。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，除PLP-CM組外，其余治療組的抑瘤率均顯著大于FM組(P〈 0.05) ;MT0-HM1:15、PLP-CM+MT0-HM1:15和PLP-MTO-HM1:15組的抑瘤率均顯著大于MTO-YM 組(P〈0.05) ;PLP-MT0-HM1:15組的抑瘤率顯著大于PLP-CM+MTO-HM1:15和MTO-HM1:15組(P〈 0.05) ;PLP-CM+MT0-HM1:15和MTO-HM1:15兩組間抑瘤率無(wú)顯著性差異。
[0104] 在B16F10皮下瘤模型中，PLP-CM組的腫瘤體積和質(zhì)量基本與NS組一致，該結(jié)果證 實(shí)PLP-CM的單獨(dú)使用對(duì)B16F10腫瘤基本無(wú)抑制作用;MT0-HM1:15組的抑瘤率顯著大于ΜΤ0-YM組的抑瘤率，這可能與LHD7可主動(dòng)靶向高表達(dá)bFGFR腫瘤細(xì)胞并抑制腫瘤新生血管生長(zhǎng) 相關(guān);MT0-HM1:15和PLP-CM+MT0-HM1:15組間抑瘤率無(wú)差異，且均顯著小于PLP-MT0-HM1:15 組的抑瘤率，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)將共載PLP和ΜΤ0于脂質(zhì)體的聯(lián)合給藥方式可顯著增強(qiáng)PLP 和ΜΤ0的抑瘤效果。以上結(jié)果共同表明，PLP與ΜΤ0的聯(lián)合給藥方案可以實(shí)現(xiàn)兩者的協(xié)同抗癌 效果。本項(xiàng)目制備的PLP-MT0-HM1:15將PLP和ΜΤ0共載于靶向脂質(zhì)體中，既可以避免兩種藥 物混合使用時(shí)體內(nèi)分布及藥動(dòng)學(xué)方面的差異，又可以提高藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性，同時(shí) 減少耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，從而更好地發(fā)揮兩種藥物的協(xié)同治療目的。
[0105] (15)PLP-MT0-HM1:15體內(nèi)抑瘤作用機(jī)制研究
[0106] ①腫瘤新生血管形成抑制作用
[0107] 腫瘤組織冰凍切片后進(jìn)行微血管CD31免疫熒光染色，以檢測(cè)腫瘤血管形成抑制作 用。具體操作如下：1)迅速取出腫瘤組織，0CT包埋劑浸沒(méi)，冰凍切片機(jī)切片，厚約δμπι?！剑┣?片組織室溫放置30min，4°C丙酮固定SOmiruO.lM PBS洗滌兩次，每次δπ?η?！剑┪M液體，37 °C下，正常山羊血清封閉組織60min。4)去除封閉液，滴加約50yL⑶31-抗4°C濕盒內(nèi)孵育 過(guò)夜。5)去除一抗，0.1M PBS洗滌兩次，每次δπ?η』)吸盡液體，加入50yL AF 488標(biāo)記的二 抗避光孵育60min。7)去除二抗，0.1M PBS洗滌兩次，每次5min。8)吸盡液體，滴一滴抗熒光 淬滅封片液于載玻片上，封片。9)顯微鏡下鏡檢?？乖ㄎ惶庯@線狀或點(diǎn)狀綠色熒光為陽(yáng)性 結(jié)果。
[0108] 圖11A所示，CT26模型中，NS組腫瘤組織微血管較給藥組密、粗且長(zhǎng)，給藥組微血管 密度PLP-MT0-HM1:15〈PLP-CM+MT0-HM1:15〈MT0-HM1:15〈PLP-MT0-YM~MT0-HM1: 30〈MT0-腿1:60〈11'0-￥1〈11'0-01，且經(jīng)1^07修飾后脂質(zhì)體組微血管密度顯著低于未經(jīng)1^07修飾后脂 質(zhì)體組(P〈0.05)。在圖11B所示B16F10模型中，各組腫瘤組織微血管密度PLP-MT0-HM1:15〈 PLP-CM+MT0-HM1:15〈MT0-HM1:15〈MT0-YM〈FM〈PLP-CM~NS，且含 MT0-HM1:15組微血管密度 顯著低于ΜΥ0-ΥΜ和FM組(P〈0.05)。
[0109] ⑶31免疫組化結(jié)果顯示，在CT26和B16F10兩種腫瘤模型中，經(jīng)LHD7修飾后脂質(zhì)體 的腫瘤微血管密度均顯著低于未經(jīng)LHD7修飾脂質(zhì)體組，這可能與LHD7強(qiáng)大的腫瘤新生血管 生成抑制作用相關(guān)。而本文單用PLP-CM對(duì)腫瘤和微血管生長(zhǎng)抑制作用卻不明顯，這可能與 本文單次給藥、給藥劑量小。
[0110] ②腫瘤細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用
[0111] 腫瘤組織冰凍切片米用TUNEL(IdT_mediated dpTP Hick-互nd labeling)法檢測(cè) 細(xì)胞凋亡。具體操作如下：1)迅速取出腫瘤組織，OCT包埋劑浸沒(méi)，冰凍切片機(jī)切片，厚約5μ m〇
[0112] 2)切片組織室溫放置30min，4%多聚甲醛固定20miru0.1M PBS洗滌兩次，每次 5min〇
[0113] 3)加入含0.1%Triton X-100的PBS，冰浴孵育2min，PBS洗滌兩次，每次Sminj)加 入20yg/mL蛋白酶K(不含DNAse和RNase)，37°C作用30min，PBS洗滌兩次，每次5miru5)制備 TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用2yL TdT+48yl FITC標(biāo)記的dUTP液混勻；而陰性對(duì)照組僅加50μ L FITC的dUTP液，陽(yáng)性對(duì)照組先加入100yL DNAse，25°C反應(yīng)lOmin，后面步驟同處理組。6) 加入50yL TUNEL反應(yīng)混合液，37°C，暗濕盒中避光孵育60min JBS洗滌兩次，每次δπ?η。？)抗 焚光淬滅封片液封片后焚光顯微鏡下觀察。
[0114] 圖12A所示，CT26模型中，NS組腫瘤組織基本無(wú)凋亡，給藥組調(diào)亡程度？!^，?-HM1:15>PLP-CM+MT0-HM1:15>MT〇-HMl: 15^MT〇-HMl: 30>PLP-MT〇-YM^MT〇-HMl: 60>MT〇-YM >MT〇-CM。圖12Β所示B16F10模型中，NS及PLP-CM組腫瘤組織基本無(wú)凋亡，其余組調(diào)亡程度 PLP-MT0-HM1:15>PLP-CM+MT0-HM1:15>MT〇-HMl:15>MT〇-YM>FM〇
[0115] TUNEL染色結(jié)果顯示，除PLP-CM組和NS組外，其余組均有不同程度的綠色熒光陽(yáng)性 結(jié)果，這可能與ΜΤ0對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用相關(guān)。MT0-HM1:15凋亡促進(jìn)作用大于ΜΤ0-ΥΜ凋 亡促進(jìn)作用，說(shuō)明LHD7可增強(qiáng)ΜΤ0的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。PLP-CM+MT0-HM1:15和PLP-MT0-HM1:15凋亡促進(jìn)作用大于MT0-HM1:15,說(shuō)明PLP可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)ΜΤ0的敏感性。
[0116] (16)PLP-MT0-HM1:15體內(nèi)安全性初步研究
[0117] 體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的同時(shí)每天稱量小鼠體重，繪制各組小鼠體重變化曲線；藥效學(xué) 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)眼眶取檢測(cè)各組小鼠血生化指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)條件下，兩種腫瘤模型的NS組及脂質(zhì)體 組小鼠體重均無(wú)明顯下降或稍有增大，而FM組小鼠體重隨時(shí)間的延長(zhǎng)而減輕，且從實(shí)驗(yàn)第 4天起明顯少于其他組(P〈0.05)。
[0118] 與ΜΤ0-樣，ΜΤ0由于嚴(yán)重的骨髓抑制和心臟毒性，其臨床運(yùn)用受到嚴(yán)重限制。脂質(zhì) 體是目前降低藥物毒性、改善藥物釋放行為、增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性最為常見(jiàn)的制劑學(xué)手段之一， 被認(rèn)為是較為理想的藥物載體。國(guó)內(nèi)外均有研究表明，將ΜΤ0、ΜΤ0等抗癌藥物制備成脂質(zhì)體 既可以改變藥物在體內(nèi)的分布和循環(huán)時(shí)間又可以提高療效并降低游離藥物的毒性。
[0119] FM組小鼠體重明顯下降，脂質(zhì)體組小鼠體重均無(wú)明顯下降，表明游離ΜΤ0有較大的 毒副作用，而脂質(zhì)體作為優(yōu)良的藥物載體可明顯減少有游離ΜΤ0的毒副作用。
[0120]二、用誘導(dǎo)正-負(fù)電荷脂質(zhì)體融合的方法制備共載鹽酸阿霉素(D0X)和潑尼松龍磷 酸鈉(PLP)的脂質(zhì)體
[0121]阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，對(duì)RNA的抑制作用最強(qiáng)，抗 瘤譜較廣，對(duì)多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有殺 滅作用。主要適用于急性白血病，對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病及粒細(xì)胞白血病均有效，一般作為 第二線藥物，即在首選藥物耐藥時(shí)可考慮應(yīng)用此藥。惡性淋巴瘤，可作為交替使用的首選藥 物。乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌等其他各種癌癥都有一定療效，多與其他抗癌藥聯(lián)合使用。 主要的毒性反應(yīng)有，白細(xì)胞和血小板減少，約60 %~80%的病人可發(fā)生；100 %的病人有不 同程度的毛發(fā)脫落，停藥后可以恢復(fù)生長(zhǎng);心臟毒性，表現(xiàn)為心律失常，ST-T改變，多出現(xiàn)在 停藥后的1~6個(gè)月，及早應(yīng)用維生素 B6和輔酶Q10可減低其對(duì)心臟的毒性;惡心、食欲減退； 藥物溢出血管外可引起組織潰瘍及壞死。另外，用藥后尿液可出現(xiàn)紅色。
[0122] (1)載D0X長(zhǎng)循環(huán)陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備
[0123] 按HSPC: DOTAP: Choi: DSPE-mPEG2000 = 9: 25:12:12(W/W)稱取一定量膜材置于梨 形瓶中，溶于適量無(wú)水乙醇，40°C水浴下減壓旋蒸lh除掉有機(jī)溶劑，得到空白脂膜。加入 300mmol · L-l(pH 4.0)的硫酸銨溶液，65°C旋轉(zhuǎn)水化60min，探頭超聲5min，室溫透析24h (透析介質(zhì)為，0.1M，pH 7.4)，得到空白脂質(zhì)體。采用硫酸銨梯度法，以D0X:脂材=3:50 (W/W)加入ΜΤ0儲(chǔ)備液，65°C水浴保溫30min，并通過(guò)sephadexG-25柱去除游離藥物，得到載 D0X的陽(yáng)離子脂質(zhì)體（D0X-YM)。對(duì)于載D0X的長(zhǎng)循環(huán)陰離子脂質(zhì)體（D0X-CM)，用HSPC代替 D0TAP，其余操作與D0X-YM相同。
[0124] (2)載PLP長(zhǎng)循環(huán)陰離子脂質(zhì)體的制備
[0125] 按HSPC: Choi:DSPE-mPEG2000 = 3:1: 2:1 (W/W)稱取一定量膜材置于梨形瓶中，溶 于適量無(wú)水乙醇，40°C水浴下減壓旋蒸lh除掉有機(jī)溶劑，得到空白脂膜。以PLP:脂材= 1:10 (W/W)加入PLP超純水溶液，65 °C旋轉(zhuǎn)水化60min，探頭超聲5min，并通過(guò)sephadexG-25柱去 除游離藥物，得到載PLP的長(zhǎng)循環(huán)陰離子脂質(zhì)體(PLP-CM)。
[0126] (3)共載D0X和PLP融合脂質(zhì)體的制備
[0127] ?。?)中所得的D0X-YM與（2)中所得的PLP-CM，按藥物的藥物比例3 : 5 (W/W，D0X: PLP)，將兩種脂質(zhì)體混合均勻，加入40mM L-1檸檬酸，誘導(dǎo)融合2h，即得共載D0X和PLP融合 脂質(zhì)體(PLP-D0X-YM)。
[0128] 對(duì)于制備D0X和PLP共載脂質(zhì)體，研究之初考慮采用最簡(jiǎn)單的共載方法，即將兩種 藥物溶液直接混合后去水化脂質(zhì)膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種藥物混合溶液中出現(xiàn)沉淀，其原因可能 是形成了D0X-PLP難溶性復(fù)合物，故提示該法不可行。也嘗試先制備單載PLP的脂質(zhì)體，再用 梯度法載D0X，但是在制備梯度的透析過(guò)程中PLP就已經(jīng)大量泄漏，提示該法亦不可行。
[0129] (4)LHD7修飾的共載ΜΤ0和PLP長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的制備
[0130] 取上述所制得的PLP-D0X-YM，按LHD7:Lipids = l: 15(W/W)將LHD7和PLP-D0X-YM混 合均勻，25°C水浴孵育30min，即得LHD7修飾的共載D0X和PLP的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體（PLP-D0X-ΗΜ1:15)〇
[0131] 對(duì)于LHD7修飾的載D0X的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(D0X-HM1:15)，將LHD7和D0X-YM混合均勻， 其余操作與PLP-D0X-HM1:15相同。
[0132] PLP-D0X-HM1:15的制備則采用簡(jiǎn)單、成熟的后插入法將兩親性靶向材料LHD7插入 到PLP-D0X-YM的磷脂雙分子結(jié)構(gòu)中，此方法既可使靶頭部分(LMWH)全部暴露在脂質(zhì)體外水 相，又不會(huì)引起藥物的泄露。
[0133] (4)融合前后脂質(zhì)體的理化性質(zhì)
[0134] 按照前述方法制備兩種脂質(zhì)體及融合脂質(zhì)體，并測(cè)定各處方脂質(zhì)體的粒徑、PDI及 Zeta電位。如表2-1所示最佳制備工藝下所得脂質(zhì)體粒徑在97~121ηηι，Η)Ι均〈0.3,粒徑分 布均勾，Zeta電位從-18mV到37mV不等。結(jié)果表明，融合后脂質(zhì)體的粒徑并不會(huì)明顯增加，反 而roi較融合前有所改善。
[0135] 表2-1脂質(zhì)體的粒徑和電位，X. ±_s,.n = 3
[0136]
[0137] (6)脂質(zhì)體的包封率
[0138] 分別測(cè)定D0X和PLP的包封率，測(cè)定結(jié)果如表2-2所示。最佳制備工藝下制備所得脂 質(zhì)體的包封率均>95%，其中PLP-D0X-YM的D0X包封率為97% ;PLP包封率為94%。
[0139] 表2-2脂質(zhì)體的包封率，T±s，n = 3
[0141] 三、用誘導(dǎo)正-負(fù)電荷脂質(zhì)體融合的方法制備共載鹽酸多柔比星(DNR)和潑尼松龍 磷酸鈉(PLP)的脂質(zhì)體
[0142] 本品為第一代蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素。其作用機(jī)制酷似阿霉素。作為一種周期非特 異性化療藥，柔紅霉素的抗瘤譜遠(yuǎn)較阿霉素為窄，對(duì)實(shí)體瘤療效大不如阿霉素和表阿霉素。 該品主要用于各種類型的急性白血病(包括粒細(xì)胞性、淋巴細(xì)胞性和單核細(xì)胞性以及粒-單 核細(xì)胞性）、紅白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、惡性淋巴瘤，也可用于神經(jīng)母細(xì)胞病、尤因肉 瘤和腎母細(xì)胞瘤等。
[0143] (1)載DNR長(zhǎng)循環(huán)陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備
[0144] 按HSPC: DOTAP: Choi: DSPE-mPEG2000 = 9: 25:12:12(W/W)稱取一定量膜材置于梨 形瓶中，溶于適量無(wú)水乙醇，40°C水浴下減壓旋蒸lh除掉有機(jī)溶劑，得到空白脂膜。加入 300mmol · L-l(pH 4.0)的硫酸銨溶液，65°C旋轉(zhuǎn)水化60min，探頭超聲5min，室溫透析24h (透析介質(zhì)為，0.1M，pH 7.4)，得到空白脂質(zhì)體。采用硫酸銨梯度法，以D0X:脂材=3:50 (W/W)加入ΜΤ0儲(chǔ)備液，65°C水浴保溫30min，并通過(guò)sephadexG-25柱去除游離藥物，得到載 DNR的陽(yáng)離子脂質(zhì)體(DNR-YM)。對(duì)于載DNR的長(zhǎng)循環(huán)陰離子脂質(zhì)體(DNR-CM)，用HSPC代替 DOTAP，其余操作與DNR-YM相同。
[0145] (2)載PLP長(zhǎng)循環(huán)陰離子脂質(zhì)體的制備
[0146] 按HSPC: Cho 1: DSPE-mPEG2000 = 3:1: 2:1 (W/W)稱取一定量膜材置于梨形瓶中，溶 于適量無(wú)水乙醇，40°C水浴下減壓旋蒸lh除掉有機(jī)溶劑，得到空白脂膜。以PLP:脂材= 1:10 (W/W)加入PLP超純水溶液，65 °C旋轉(zhuǎn)水化60min，探頭超聲5min，并通過(guò)sephadexG-25柱去 除游離藥物，得到載PLP的長(zhǎng)循環(huán)陰離子脂質(zhì)體(PLP-CM)。
[0147] (3)共載DNR和PLP融合脂質(zhì)體的制備
[0148] ?。?)中所得的D0X-YM與（2)中所得的PLP-CM，按藥物的藥物比例3 : 5 (W/W，DNR: PLP)，將兩種脂質(zhì)體混合均勻，加入40mM L-1檸檬酸，誘導(dǎo)融合2h，即得共載DNR和PLP融合 脂質(zhì)體(PLP-DNR-YM)。
[0149] 對(duì)于制備DNR和PLP共載脂質(zhì)體，研究之初考慮采用最簡(jiǎn)單的共載方法，即將兩種 藥物溶液直接混合后去水化脂質(zhì)膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種藥物混合溶液中出現(xiàn)沉淀，其原因可能 是形成了DNR-PLP難溶性復(fù)合物，故提示該法不可行。也嘗試先制備單載PLP的脂質(zhì)體，再用 梯度法載DNR，但是在制備梯度的透析過(guò)程中PLP就已經(jīng)大量泄漏，提示該法亦不可行。
[0150] (4) LHD7修飾的共載ΜΤ0和PLP長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的制備
[0151] 取上述所制得的 PLP-DNR-YM，按 LHD7: Lipids = 1:15(W/W)將 LHD7 和 PLP-DNR-YM 混 合均勻，25°C水浴孵育30min，即得LHD7修飾的共載DNR和PLP的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(PLP-DNR-ΗΜ1:15)〇
[0152] 對(duì)于LHD7修飾的載DNR的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(DNR-HM1:15)，將LHD7和DNR-YM混合均勻， 其余操作與PLP-DNR-HM1:15相同。
[0153] PLP-DNR-HM1:15的制備則采用簡(jiǎn)單、成熟的后插入法將兩親性靶向材料LHD7插入 到PLP-DNR-YM的磷脂雙分子結(jié)構(gòu)中，此方法既可使靶頭部分(LMWH)全部暴露在脂質(zhì)體外水 相，又不會(huì)引起藥物的泄露。
[0154] (4)融合前后脂質(zhì)體的理化性質(zhì)
[0155] 按照前述方法制備兩種脂質(zhì)體及融合脂質(zhì)體，并測(cè)定各處方脂質(zhì)體的粒徑、PDI及 Zeta電位。如表3-1所示最佳制備工藝下所得脂質(zhì)體粒徑在100~125nm，PDI均〈0.2,粒徑分 布均勾，Zeta電位從-16mV到36mV不等。結(jié)果表明，融合后脂質(zhì)體的粒徑并不會(huì)明顯增加，反 而roi較融合前有所改善。
[0156] 表3-1脂質(zhì)體的粒徑和電位，X. 土s,n = 3
[0157]
[0158] (6)脂質(zhì)體的包封率
[0159]分別測(cè)定DNR和PLP的包封率，測(cè)定結(jié)果如表3-2所示。最佳制備工藝下制備所得脂 質(zhì)體的包封率均>95%，其中PLP-DNR-YM的DNR包封率為95% ;PLP包封率為94%。
[0160]表3-2脂質(zhì)體的包封率，T±s，n = 3

【附圖說(shuō)明】：
[0163] 圖1檸檬酸對(duì)脂質(zhì)體融合率的影響。
[0164] 圖 2中A~C分別為 PLP-CM、MT〇-YM、PLP-MT〇-YM的 TEM 圖。
[0165] 圖3中A為制備PLP-MT0-YM融合脂質(zhì)體的動(dòng)態(tài)TEM圖，其中（i) :PLP-CM與ΜΤ0-ΥΜ相 隔較遠(yuǎn)，（i i): PLP-CM與ΜΤ0-ΥΜ逐漸靠近，（i i i): PLP-CM與ΜΤ0-ΥΜ開(kāi)始融合，（iv): PLP-CM與 ΜΤ0-ΥΜ融合完全至界面消失。
[0166] 圖4脂質(zhì)體的體外釋放曲線，其中A:各處方脂質(zhì)體在PBS 7.4中的釋放，B:PLP-MT0-HM1:15在不同pH值PBS中的釋放。
[0167] 圖5 PLP-MT0-HM1:15的存儲(chǔ)穩(wěn)定性，A:包封率變化，B:粒徑和Η)Ι變化。
[0168] 圖6空白材料對(duì)細(xì)胞的活力抑制，A:CT26，B:B16F10。
[0169] 圖7脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞活力抑制的濃度依賴性，A: CT26，B: B16F10。
[0170] 圖8細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的時(shí)間依耐性，A:CT26，B:B16F10。
[0171] 圖9 CT26皮下瘤的生長(zhǎng)曲線。
[0172] 圖10 B16F10皮下瘤的生長(zhǎng)曲線。
[0173] 圖11腫瘤新生血管抑制作用，A:CT26,其A~J分別代表NS、FM、MT〇-CM、MT〇-YM、 MT0-HM1:60、MT0-HM1:30、MT0-HM1:15、PLP-MT0-YM、PLP-CM+MT0-HM1:15及PLP-MT0-HM1:15 組；B:B16F10，a~g分別代表 NS、FM、PLP-CM、MT0-YM、MT0-HM1:15、PLP-CM+MT0-HM1:15& PLP-MT0-HM1:15組。
[0174] 圖12腫瘤細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用，A:CT26,其中A~J分別代表代表吧^1、11'0-01、11'0_ YM、MT0-HM1:60、MT0-HM1:30、MT0-HM1:15、PLP-MT0-YM、PLP-CM+MT0-HM1:15及PLP-MT0-腿1:15組 ；8:816?10,3~8分別代表吧小]\^1^-〇1、]?1'0-￥]\1、]?1'0-腿1:15、？1^-〇1+]?1'0-腿1: 15及PLP-MT0-HM1:15組。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 利用誘導(dǎo)脂質(zhì)體融合來(lái)制備雙載或多載脂質(zhì)體的技術(shù)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于:所述的誘導(dǎo)脂質(zhì)體融合的方法包括:誘導(dǎo) 正-負(fù)電荷脂質(zhì)體融合、陽(yáng)離子如氫離子(H+)、鈣離子(Ca 2+)、鎂離子(Mg2+)等誘導(dǎo)普通脂質(zhì) 體或pH敏感脂質(zhì)體融合；陰離子如檸檬酸、EDTA、磷酸根、硫酸根、醋酸等來(lái)誘導(dǎo)融合;聚陽(yáng) 離子聚合物如聚賴氨酸、聚組氨酸等等來(lái)誘導(dǎo)融合;聚陰離子聚合物如聚谷氨酸、聚天冬氨 酸等等來(lái)誘導(dǎo)融合;特殊的融合誘導(dǎo)劑來(lái)誘導(dǎo)脂質(zhì)體融合，這樣的誘導(dǎo)劑包括聚乙二醇、磷 脂酶、α-生育酚、聚胺、凝集素、質(zhì)粒DNA、RNA、siRNA及某些多肽和蛋白（如膜聯(lián)蛋白VII、網(wǎng) 格蛋白等等）;一些特殊的理化條件，如溫度、滲透壓等等，中的至少一種。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于:所述的帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體可以采用的帶負(fù) 電荷的脂質(zhì)材料來(lái)制備，通常由于頭部帶有負(fù)電荷的基團(tuán)而成為負(fù)電荷的脂質(zhì)，包括各種 來(lái)源的磷脂酰膽堿(卵磷脂）、氫化卵磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、磷脂酰糖酐、磷 脂酰絲氨酸、鞘磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血磷脂、二鯨蠟磷酸酯(DCP)等。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于:所述的帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體也可能采用荷負(fù) 電的糖脂如單半乳糖-和二乳糖-甘油二酯(MDGD，DGDG)。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于:所述的帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體也可以采用帶負(fù) 電荷基團(tuán)的膽固醇衍生物來(lái)代替，如膽固醇琥珀酸酯(CHEMS)從而得到荷負(fù)電的脂質(zhì)體。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于:帶正電荷的脂質(zhì)體可以采用的陽(yáng)離子脂質(zhì) 材料包括所述的DC-CHOL(CAS: 166023-21-8)、硬質(zhì)酰胺等帶正電荷的脂質(zhì)衍生物。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于：帶正電荷的脂質(zhì)體也可以包括帶正電荷的 磷脂材料如，〇(1^?(〇厶5:132172-61-3)、0(1^?(〇厶5:144189-73-1)、01^^?(〇厶5:197974-74-6)、16:0 TAP(139984-36-4)、DDAB(CAS: 3700-67-2)、D0BAQ(CAS:1360461-69-30)、 D0DAP(CAS:127512-29-2)、16:0 TAP(CAS: 72719-84-7)、18:0 TAP(220609-41-6)、12:0 EPC(EPC為乙?；字Ｄ憠A的簡(jiǎn)稱，CAS: 474945-22-7)、14:0 EPC(CAS: 186492-53-5)、 14:1EPC(CAS:1246304-44_8)、16:0EPC(CAS:328250-18-6)、18:0EPC(CAS:328268-13-9)、18:1 EPC(CAS: 474945-24-9)、16:0-18:1 EPC(CAS: 328250-19-7)、D0TMA(CAS: 104872-42-6)、MVL5(CAS: 464926-03-2)、D0SPA(CAS: 168479-02-5)、DMRIE(CAS: 153312-64-2)、DLinDMA(CAS: 871258-12-7)、DMPE(CAS: 998-07-2)、18:1co9TAP(CAS: 104162-48-3)、D0DAP(CAS: 127512-29-2)、DOBAQ(CAS: 1360461-69-3)、14:0DAP(CAS: 72719-84-7)、16:0 DAP(CAS: 96326-74-8)、18:0 DAP(CAS: 121315-93-3)等等。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于:pH敏感的脂質(zhì)體分為PE-脂質(zhì)體和PC-脂質(zhì) 體，也包括PS構(gòu)成的脂質(zhì)體。9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于:pH敏感的脂質(zhì)體的pH融合作用有時(shí)需要輔 助介質(zhì)如多聚組氨酸、植物血凝素等等。10. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于：pH敏感脂質(zhì)成分包括:DPSG、DOSG、油酸 (OA)、PHC或膽固醇衍生物CHEMS、N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)等等。
【文檔編號(hào)】A61K31/573GK105832670SQ201510994777
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2015年12月28日
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請(qǐng)人】四川大學(xué)