一種載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程材料技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種載一氧化氮的羧化殼聚糖?聚乙烯亞胺水凝膠及其制備方法和應(yīng)用。該方法包括以下步驟：往羧化殼聚糖的水溶液中加入1?(3?二甲氨基丙基)?3?乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N?羥基琥珀酰亞胺攪拌溶解，再加入聚乙烯亞胺，攪拌反應(yīng)，得到羧化殼聚糖?聚乙烯亞胺水凝膠；將其懸浮于甲醇鈉/甲醇溶液中，通入一氧化氮加壓反應(yīng)，得到載一氧化氮的羧化殼聚糖?聚乙烯亞胺水凝膠。本發(fā)明利用水溶性羧化殼聚糖與聚乙烯亞胺發(fā)生酰胺反應(yīng)，引入仲胺基團(tuán)形成水凝膠再裝置NO，實現(xiàn)NO的高裝載量，并可自動緩慢釋放NO，解決了現(xiàn)有載體材料細(xì)胞毒性大、生物相容性差、NO負(fù)載量低、突釋現(xiàn)象嚴(yán)重等問題。
【專利說明】
一種載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程材料技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種載一氧化氮(NO)的羧化殼聚糖(CPCTS)-聚乙烯亞胺(PEI)水凝膠及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]自青霉素被發(fā)明利用以來，以青霉素為代表的抗生素挽救了無數(shù)傷員患者的生命，抗生素對細(xì)菌、真菌、病毒甚至是腫瘤都可起到抑制或殺滅作用，然而近年來對抗生素的濫用已經(jīng)到了無以復(fù)加的地步。隨著抗生素的濫用不僅使人體產(chǎn)生多種不良反應(yīng)，還導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生了廣泛的耐藥性，久而久之導(dǎo)致無抗生素可以對已經(jīng)有很強(qiáng)抗藥性的細(xì)菌或病毒產(chǎn)生作用(我國抗生素濫用現(xiàn)狀及其對策2014 09B-0175-03)。研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮(NO)是內(nèi)皮細(xì)胞釋放的舒張因子，它不但作為生物體中重要的信號分子參與調(diào)節(jié)生物體的各種生理病理過程，而且還是抵御細(xì)菌、病毒、腫瘤細(xì)胞等病原體的有效武器，能殺死多種病原體從而保護(hù)人的機(jī)體健康。因此制備可負(fù)載一氧化氮(NO)的材料是目前生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域研究的熱點。
[0003]Wink DA等研究發(fā)現(xiàn)親水性的一氧化氮(NO)供體從聚合物中滲出，在血液中形成致癌性N-亞硝胺物質(zhì)(The multifaceted roles of nitric oxide in cancercarcinogenesis, 1998.19:711-721)，負(fù)載一氧化氮(NO)的材料在人體內(nèi)不可降解。以二胺為基底N-偶氮稀二醇類物質(zhì)也會從聚合物基體中滲出，從而生成致癌性物質(zhì)(Preparat1nand characterizat1n of hydrophobic polymeric films that are thromboresistantvia nitric oxide release.B1materials.2000,21:9-21)，其生物相容性和細(xì)胞毒性成為其應(yīng)用到人體最大的阻礙。高群等人研究發(fā)現(xiàn)用氨基酸改性殼聚糖負(fù)載一氧化氮(NO)，其一氧化氮(NO)供體在PBS液中的累計釋放量最高可達(dá)到31 Onmo I /mg (新型親核NO供體的合成及性能研究)，其累計釋放量太低，從而導(dǎo)致其抗菌效果不佳。
[0004]因此，制備生物相容性好、在體內(nèi)可降解、抗菌效果佳及可持續(xù)釋放的一氧化氮(NO)供體便成為當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域亟待解決的重要課題。迄今為止，通過羧化殼聚糖(CPCTS)-聚乙烯亞胺(PEI)形成水凝膠載一氧化氮(NO)的制備方法、抗菌方法及其應(yīng)用尚未見報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種載一氧化氮(NO)的羧化殼聚糖(CPCTS)-聚乙烯亞胺(PEI)水凝膠。該水凝膠具有優(yōu)良的溶脹性、透過性、生物相容性以及載藥不失活等特性，且釋放速率可以通過調(diào)整交聯(lián)度和水凝膠的化學(xué)組成實現(xiàn)。
[0006]本發(fā)明另一目的在于提供一種上述載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠的制備方法。
[0007]本發(fā)明再一目的在于提供上述載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠作為生物醫(yī)學(xué)工程材料，在抗菌、抗病毒和防治腫瘤中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn):
[0009]一種載一氧化氮(NO)的羧化殼聚糖(CPCTS)-聚乙烯亞胺(PEI)水凝膠的制備方法，包括以下步驟:
[0010]往羧化殼聚糖的水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)攪拌溶解，再加入聚乙烯亞胺，攪拌反應(yīng)，得到羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠；將羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠懸浮于甲醇鈉/甲醇(CH3ONa/CH3OH)溶液中，通入一氧化氮加壓反應(yīng)，得到載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠(CPCTS-PE1-N0)。
[0011]所用羧化殼聚糖、聚乙烯亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為(I?2): (I?2):(1.2?2):(1.2?2)。
[0012]所述羧化殼聚糖的分子量優(yōu)選為150000?200000。
[0013]所述羧化殼聚糖可購買得到，或通過以下方法制備得到:將殼聚糖與酸酐反應(yīng)制得N-取代衍生物，即C2位羧甲基化的羧化殼聚糖。
[0014]所述聚乙烯亞胺的分子量優(yōu)選為1800?20000。
[0015]所述聚乙烯亞胺(PEI)的加入量為每10mL水中加入2?3克計。
[0016]所述攪拌反應(yīng)的時間優(yōu)選為24?36h，攪拌轉(zhuǎn)速優(yōu)選為600?800rpm。
[0017]所述反應(yīng)物羧化殼聚糖、聚乙烯亞氨、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺總質(zhì)量與所用水溶液體積的比例為5?15g/1 OOmL。
[0018]所述攪拌反應(yīng)后，優(yōu)選通過透析、凍干，得到純化后的產(chǎn)物。所述透析的時間優(yōu)選為3?5d，所述凍干的時間優(yōu)選為3?5d。
[0019]所述CH3ONa/CH3OH溶液中，CH3ONa的加入量為每10mLCH3OH中加入4?6克計。
[0020]所述CH3ONa/CH3OH溶液的用量以摩爾比Na+/NHg (3?5)計。
[0021]所述CPCTS-PEI水凝膠的質(zhì)量與CH3ONa/CH3OH溶液體積的比例為5?I Og/1 OOmL。
[0022]所述通入一氧化氮加壓反應(yīng)優(yōu)選指通入氮氣使反應(yīng)容器內(nèi)壓力為600?SOOKPa。所述通入一氧化氮前優(yōu)選先通氮氣后抽真空。
[0023]所述通入一氧化氮反應(yīng)的時間優(yōu)選為6?8天。
[0024]所述通入一氧化氮反應(yīng)后，優(yōu)選通入氮氣吹走未反應(yīng)的NO，然后優(yōu)選進(jìn)行過濾、洗滌、真空干燥獲得純化的產(chǎn)物。
[0025]所述的洗滌指所得固體用無水甲醇和乙醚各洗滌2?3次。
[0026]本發(fā)明還提供一種上述方法制備得到的載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠。
[0027]本發(fā)明通過對殼聚糖C2位進(jìn)行羧化，得到水溶性羧化殼聚糖，并與聚乙烯亞胺(PEI)發(fā)生酰胺反應(yīng)，引入仲胺基團(tuán)-NH，形成水凝膠;親核試劑點-NH與一氧化氮(NO)在600?800KPa條件下發(fā)生反應(yīng)形成[Ν(0)Ν0]-，從而實現(xiàn)NO的高裝載量。同時，[N(O)NO]-在PBS(pH = 7.4)溶液中自發(fā)釋放一氧化氮(NO)氣體，不需要電子轉(zhuǎn)移、輔助因子和酶的參與。因此本發(fā)明的載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠可實現(xiàn)NO的高負(fù)載，并可自動釋放NO;采用大分子量的羧化殼聚糖和聚乙烯亞胺，一方面大分子量的PEI提高了 NO的負(fù)載量，另一方面大分子量的羧化殼聚糖與PEI交聯(lián)后，所得凝膠彈性更好、物理性質(zhì)更加穩(wěn)定，且由于其水凝膠特性，具有緩釋效果，而現(xiàn)有使用的載體材料并無使用凝膠的先例，且現(xiàn)有載體與本發(fā)明載體相比，細(xì)胞毒性大、生物相容性差、NO負(fù)載量低、突釋現(xiàn)象嚴(yán)重。因此本發(fā)明的載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠在生物醫(yī)學(xué)工程材料領(lǐng)域，特別是在抗菌、抗病毒和防治腫瘤中具有巨大的潛在應(yīng)用價值。
[0028]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及有益效果:
[0029](I)羧化殼聚糖是最重要的殼聚糖衍生物之一，水溶性高，具有優(yōu)良的乳化性、吸濕保濕性、成膜性和生物相容性等特點；
[0030](2)羧化殼聚糖同時具備有效抑制細(xì)菌和真菌的生長和繁殖的能力，對常見的口腔致病菌、皮膚癬菌、傷口感染菌等具有顯著的抑制效果，并具有促進(jìn)傷口愈合和消炎、止血等功能；
[0031](3)超支化的聚乙烯亞胺(PEI)含有大量的仲胺基團(tuán)-NH，作為親核位點可以和一氧化氣(NO)發(fā)生反應(yīng)，提尚一氧化氣(NO)的負(fù)載量；
[0032](4)羧化殼聚糖與聚乙烯亞胺發(fā)生酰胺反應(yīng)形成水凝膠，具有優(yōu)良的溶脹性、透過性、生物相容性以及載藥不失活等特性；
[0033](5)該水凝膠能維持負(fù)載在水凝膠中的藥物，且釋放速率可以通過調(diào)整交聯(lián)度和水凝膠的化學(xué)組成實現(xiàn)；
[0034](6)該材料顯示正電性，有利于與細(xì)胞的親和；
[0035](7)改變羧化殼聚糖(CPCTS)與聚乙烯亞胺(PEI)的投料比，可以控制水凝膠的疏松結(jié)構(gòu)，應(yīng)用廣泛；
[0036](8)羧化殼聚糖凝膠體系是一種理想的緩釋材料；
[0037](9)本發(fā)明材料成分簡單、原料易得、生物相容性好，有望在生物醫(yī)學(xué)工程材料領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
【附圖說明】
[0038]圖1為實施例2制備得到的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠的紅外譜圖。
[0039]圖2為實施例1和2制備得到的CPCTS-PE1-N0與Griess試劑的顯色反應(yīng)圖。
[0040]圖3為實施例1制備得到的CPCTS-PE1-N0在PBS(pH7.4)緩沖液中釋放實驗結(jié)果圖。[0041 ]圖4為實施例2制備得到的CPCTS-PE1-N0與大腸桿菌共培養(yǎng)24小時后的抗菌實驗圖。
【具體實施方式】
[0042]下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0043]下列實施例中所用的試劑均可從商業(yè)渠道購買得到。
[0044]實施例1:羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備
[0045](I)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺(CPCTS-PEI)水凝膠的制備
[0046]稱取羧化殼聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)攪拌溶解，轉(zhuǎn)入圓底燒瓶，同時加入聚乙稀亞胺(PEI)，然后密封進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過程中磁力攪拌，轉(zhuǎn)速為600?800rpm，反應(yīng)時間24?36小時，pH7.0;透析3?5天、凍干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝膠產(chǎn)物。
[0047]所述羧化殼聚糖(CPCTS)、聚乙烯亞胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為2:1:1.2:1.2;所述聚乙烯亞胺(PEI)的加入量為每10mL超純水中加入2?3克計;所述反應(yīng)物總質(zhì)量和水溶液體積的比例為5g/100mL。
[0048](2)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備
[0049]將步驟(I)制備得到的CPCTS-PEI懸浮于CH3ONa/CH3OH溶液中，置于高壓反應(yīng)釜中，先通氮氣后抽真空，再通入NO氣體，反應(yīng)7天、過濾、洗滌、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0產(chǎn)物。
[0050]所述CH3ONa/CH3OH溶液的體積為30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝膠的質(zhì)量和CH3ONa/CH3OH溶液體積的比例為5g/100mL;所述的高壓反應(yīng)釜反應(yīng)為先通氮氣后抽真空，除去體系中的氧氣，再通入NO氣體，維持壓力600?800KPa，室溫條件下反應(yīng)7?8天，反應(yīng)完成后，先通入氮氣吹去未反應(yīng)的NO氣體;所述的洗滌是所得固體用無水甲醇和乙醚各洗滌2?3次。
[0051 ] 結(jié)果分析:CPCTS和PEI制備得CPCTS-PEI ,2956cm—1處的NH伸縮振動峰與PEI相同和1556cm—1處的NH彎曲振動峰與PEI相同，1666cm—1和1392cm—1處出現(xiàn)新的酰胺峰，圖1紅外譜圖證實CPCTS接上PEI基團(tuán)。
[0052]實施例2:羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備
[0053](I)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺(CPCTS-PEI)水凝膠的制備
[0054]稱取羧化殼聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)攪拌溶解，轉(zhuǎn)入圓底燒瓶，同時加入聚乙稀亞胺(PEI)，然后密封進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過程中磁力攪拌，轉(zhuǎn)速為600?800rpm，反應(yīng)時間24?36h，pH7.0;透析3?5天、凍干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝膠產(chǎn)物。
[0055]所述羧化殼聚糖(CPCTS)、聚乙烯亞胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為2:1:1.2:1.2;所述聚乙烯亞胺(PEI)的加入量為每10mL超純水中加入2?3克計;所述反應(yīng)物總質(zhì)量和水溶液體積的比例為10g/100mL。
[0056](2)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備
[0057]將步驟(I)制備得到的CPCTS-PEI懸浮于CH3ONa/CH3OH溶液中，置于高壓反應(yīng)釜中，先通氮氣后抽真空，再通入NO氣體，反應(yīng)7天、過濾、洗滌、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0產(chǎn)物。
[0058]所述CH3ONa/CH3OH溶液的體積為30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝膠的質(zhì)量和CH3ONa/CH3OH溶液體積的比例為10g/100mL;所述的高壓反應(yīng)釜反應(yīng)為先通氮氣后抽真空，除去體系中的氧氣，再通入NO氣體，維持壓力600?800KPa，室溫條件下反應(yīng)7?8天，反應(yīng)完成后，先通入氮氣吹去未反應(yīng)的NO氣體;所述的洗滌是所得固體用無水甲醇和乙醚各洗滌2?3次。
[0059]實施例3:羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備[0060 ] (I)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺(CPCTS-PEI)水凝膠的制備
[0061]稱取羧化殼聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)攪拌溶解，轉(zhuǎn)入圓底燒瓶，同時加入聚乙稀亞胺(PEI)，然后密封進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過程中磁力攪拌，轉(zhuǎn)速為600?800rpm，反應(yīng)時間24?36h，pH7.0;透析3?5天、凍干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝膠產(chǎn)物。
[0062]所述羧化殼聚糖(CPCTS)、聚乙烯亞胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為2:1:1.2:1.2;所述聚乙烯亞胺(PEI)的加入量為每10mL超純水中加入2?3克計;所述反應(yīng)物總質(zhì)量和水溶液體積的比例為15g/100mL。
[0063](2)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備
[0064]將步驟(I)制備得到的CPCTS-PEI懸浮于CH3ONa/CH3OH溶液中，置于高壓反應(yīng)釜中，先通氮氣后抽真空，再通入NO氣體，反應(yīng)7天、過濾、洗滌、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0產(chǎn)物。
[0065]所述CH3ONa/CH3OH溶液的體積為30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝膠的質(zhì)量和CH3ONa/CH3OH溶液體積的比例為15g/100mL;所述的高壓反應(yīng)釜反應(yīng)為先通氮氣后抽真空，除去體系中的氧氣，再通入NO氣體，維持壓力600?800KPa，室溫條件下反應(yīng)7?8天，反應(yīng)完成后，先通入氮氣吹去未反應(yīng)的NO氣體;所述的洗滌是所得固體用無水甲醇和乙醚各洗滌2?3次。
[0066]實施例4:羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備
[0067](I)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺(CPCTS-PEI)水凝膠的制備
[0068]稱取羧化殼聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)攪拌溶解，轉(zhuǎn)入圓底燒瓶，同時加入聚乙稀亞胺(PEI)，然后密封進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過程中磁力攪拌，轉(zhuǎn)速為600?800rpm，反應(yīng)時間24?36h，pH7.0;透析3?5天、凍干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝膠產(chǎn)物。
[0069]所述羧化殼聚糖(CPCTS)、聚乙烯亞胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為1:1:1.2:1.2;所述聚乙烯亞胺(PEI)的加入量為每10mL超純水中加入2?3克計;所述反應(yīng)物總質(zhì)量和水溶液體積的比例為5g/100mL。
[0070](2)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備
[0071 ] 將步驟(I)制備得到的CPCTS-PEI懸浮于CH3ONa/CH3OH溶液中，置于高壓反應(yīng)釜中，先通氮氣后抽真空，再通入NO氣體，反應(yīng)7天、過濾、洗滌、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0產(chǎn)物。
[0072]所述CH3ONa/CH3OH溶液的體積為30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝膠的質(zhì)量和CH3ONa/CH3OH溶液體積的比例為10g/100mL;所述的高壓反應(yīng)釜反應(yīng)為先通氮氣后抽真空，除去體系中的氧氣，再通入NO氣體，維持壓力600?800KPa，室溫條件下反應(yīng)7?8天，反應(yīng)完成后，先通入氮氣吹去未反應(yīng)的NO氣體;所述的洗滌是所得固體用無水甲醇和乙醚各洗滌2?3次。
[0073]實施例5:羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備
[0074](I)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺(CPCTS-PEI)水凝膠的制備
[0075]稱取羧化殼聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)攪拌溶解，轉(zhuǎn)入圓底燒瓶，同時加入聚乙稀亞胺(PEI)，然后密封進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過程中磁力攪拌，轉(zhuǎn)速為600?800rpm，反應(yīng)時間24?36h，pH7.0;透析3?5天、凍干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝膠產(chǎn)物。
[0076]所述羧化殼聚糖(CPCTS)、聚乙烯亞胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為1:1:1.2:1.2;所述聚乙烯亞胺(PEI)的加入量為每10mL超純水中加入2?3克計;所述反應(yīng)物總質(zhì)量和水溶液體積的比例為10g/100mL。
[0077](2)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備
[0078]將步驟(I)制備得到的CPCTS-PEI懸浮于CH3ONa/CH3OH溶液中，置于高壓反應(yīng)釜中，先通氮氣后抽真空，再通入NO氣體，反應(yīng)7天、過濾、洗滌、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0產(chǎn)物。
[0079]所述CH3ONa/CH3OH溶液的體積為30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝膠的質(zhì)量和CH3ONa/CH3OH溶液體積的比例為8g/100mL;所述的高壓反應(yīng)釜反應(yīng)為先通氮氣后抽真空，除去體系中的氧氣，再通入NO氣體，維持壓力600?800KPa，室溫條件下反應(yīng)7?8天，反應(yīng)完成后，先通入氮氣吹去未反應(yīng)的NO氣體;所述的洗滌是所得固體用無水甲醇和乙醚各洗滌2?3次。
[0080]實施例6:羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備[0081 ] (I)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺(CPCTS-PEI)水凝膠的制備
[0082]稱取羧化殼聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)攪拌溶解，轉(zhuǎn)入圓底燒瓶，同時加入聚乙稀亞胺(PEI)，然后密封進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過程中磁力攪拌，轉(zhuǎn)速為600?800rpm，反應(yīng)時間24?36h，pH7.0;透析3?5天、凍干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝膠產(chǎn)物。
[0083]所述羧化殼聚糖(CPCTS)、聚乙烯亞胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為1:1:1.2:1.2;所述聚乙烯亞胺(PEI)的加入量為每10mL超純水中加入2?3克計;所述反應(yīng)物總質(zhì)量和水溶液體積的比例為15g/100mL。
[0084](2)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備
[0085]將步驟(I)制備得到的CPCTS-PEI懸浮于CH3ONa/CH3OH溶液中，置于高壓反應(yīng)釜中，先通氮氣后抽真空，再通入NO氣體，反應(yīng)7天、過濾、洗滌、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0產(chǎn)物。
[0086]所述CH3ONa/CH3OH溶液的體積為30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝膠的質(zhì)量和CH3ONa/CH3OH溶液體積的比例為5g/100mL;所述的高壓反應(yīng)釜反應(yīng)為先通氮氣后抽真空，除去體系中的氧氣，再通入NO氣體，維持壓力600?800KPa，室溫條件下反應(yīng)7?8天，反應(yīng)完成后，先通入氮氣吹去未反應(yīng)的NO氣體;所述的洗滌是所得固體用無水甲醇和乙醚各洗滌2?3次。
[0087]實施例7:羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備
[0088](I)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺(CPCTS-PEI)水凝膠的制備
[0089]稱取羧化殼聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)攪拌溶解，轉(zhuǎn)入圓底燒瓶，同時加入聚乙稀亞胺(PEI)，然后密封進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過程中磁力攪拌，轉(zhuǎn)速為600?800rpm，反應(yīng)時間24?36h，pH7.0;透析3?5天、凍干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝膠產(chǎn)物。
[0090]所述羧化殼聚糖(CPCTS)、聚乙烯亞胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為1:2:1.2:1.2;所述聚乙烯亞胺(PEI)的加入量為每10mL超純水中加入2?3克計;所述反應(yīng)物總質(zhì)量和水溶液體積的比例為5g/100mL。[0091 ] (2)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備
[0092]將步驟(I)制備得到的CPCTS-PEI懸浮于30?60mL溶液中，置于高壓反應(yīng)釜中，先通氮氣后抽真空，再通入NO氣體，反應(yīng)7天、過濾、洗滌、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0產(chǎn)物。
[0093]所述CH3ONa/CH3OH溶液的體積為30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝膠的質(zhì)量和CH3ONa/CH3OH溶液體積的比例為8g/100mL;所述的高壓反應(yīng)釜反應(yīng)為先通氮氣后抽真空，除去體系中的氧氣，再通入NO氣體，維持壓力600?800KPa，室溫條件下反應(yīng)7?8天，反應(yīng)完成后，先通入氮氣吹去未反應(yīng)的NO氣體;所述的洗滌是所得固體用無水甲醇和乙醚各洗滌2?3次。
[0094]實施例8:羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備
[0095](I)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺(CPCTS-PEI)水凝膠的制備
[0096]稱取羧化殼聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)攪拌溶解，轉(zhuǎn)入圓底燒瓶，同時加入聚乙稀亞胺(PEI)，然后密封進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過程中磁力攪拌，轉(zhuǎn)速為600?800rpm，反應(yīng)時間24?36h，pH7.0;透析3?5天、凍干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝膠產(chǎn)物。
[0097]所述羧化殼聚糖(CPCTS)、聚乙烯亞胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為1:2:1.2:1.2;所述聚乙烯亞胺(PEI)的加入量為每10mL超純水中加入2?3克計;所述反應(yīng)物總質(zhì)量和水溶液體積的比例為10g/100mL。
[0098](2)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備
[0099]將步驟(I)制備得到的CPCTS-PEI懸浮于CH3ONa/CH3OH溶液中，置于高壓反應(yīng)釜中，先通氮氣后抽真空，再通入NO氣體，反應(yīng)7天、過濾、洗滌、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0產(chǎn)物。
[0100]所述CH3ONa/CH3OH溶液的體積為30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝膠的質(zhì)量和CH3ONa/CH3OH溶液體積的比例為5g/100mL;所述的高壓反應(yīng)釜反應(yīng)為先通氮氣后抽真空，除去體系中的氧氣，再通入NO氣體，維持壓力600?800KPa，室溫條件下反應(yīng)7?8天，反應(yīng)完成后，先通入氮氣吹去未反應(yīng)的NO氣體;所述的洗滌是所得固體用無水甲醇和乙醚各洗滌2?3次。
[0101 ]實施例9:羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備
[0102](I)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺(CPCTS-PEI)水凝膠的制備
[0103]稱取羧化殼聚糖(CPCTS)加入水使其溶解，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)攪拌溶解，轉(zhuǎn)入圓底燒瓶，同時加入聚乙稀亞胺(PEI)，然后密封進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過程中磁力攪拌，轉(zhuǎn)速為600?800rpm，反應(yīng)時間24?36h，pH7.0;透析3?5天、凍干3?5天，得到CPCTS-PEI水凝膠產(chǎn)物。
[0104]所述羧化殼聚糖(CPCTS)、聚乙烯亞胺(PEI)、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCI)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為1:2:1.2:1.2;所述聚乙烯亞胺(PEI)的加入量為每10mL超純水中加入2?3克計;所述反應(yīng)物總質(zhì)量和水溶液體積的比例為15g/100mL。
[0105](2)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的制備
[0106]將步驟(I)制備得到的CPCTS-PEI懸浮于CH3ONa/CH3OH溶液中，置于高壓反應(yīng)釜中，先通氮氣后抽真空，再通入NO氣體，反應(yīng)7天、過濾、洗滌、真空干燥得到CPCTS-PE1-N0產(chǎn)物。
[0107]所述CH3ONa/CH3OH溶液的體積為30?60mL;所述CPCTS-PEI水凝膠的質(zhì)量和CH3ONa/CH3OH溶液體積的比例為10g/100mL;所述的高壓反應(yīng)釜反應(yīng)為先通氮氣后抽真空，除去體系中的氧氣，再通入NO氣體，維持壓力600?800KPa，室溫條件下反應(yīng)7?8天，反應(yīng)完成后，先通入氮氣吹去未反應(yīng)的NO氣體;所述的洗滌是所得固體用無水甲醇和乙醚各洗滌2?3次。
[0108]實施例1O:羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺(CPCTS-PEI)水凝膠的溶脹性能
[0109]對實施例2所得羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺(CPCTS-PEI)水凝膠進(jìn)行溶脹性能測試實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺(CPCTS-PEI)形成的水凝膠，溶脹性能非常好，結(jié)構(gòu)疏松穩(wěn)定，有利于載一氧化氮(NO)及控制一氧化氮(NO)的釋放。紅外譜圖見圖1。
[0110]實施例11:一氧化氮(NO)的釋放
[0111]對實施例2制備得到的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)，采用Griess試劑法測定合成產(chǎn)物在roS(pH7.4)緩沖溶液中一氧化氮(NO)的釋放過程，稱取3組平行樣品，分別于0.5h、Ih、I.5h、2h、4.5h、7.5h、1h、20h、30h、40h取透析袋外側(cè)PBS液，持續(xù)取樣40h，在96孔板中依此滴加I，Π液后，溶液變?yōu)榉奂t色、玫瑰紅色表示有亞硝酸鹽還原，反應(yīng)為陽性。在無光的條件下穩(wěn)定15min后會觀察到紫色或紫紅色出現(xiàn)，隨著釋放時間增長，顏色從淺到深再到淺。然后用酶標(biāo)儀測定其540nm處的吸收強(qiáng)度，結(jié)果見圖
2。圖2的結(jié)果證實羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)形成的產(chǎn)物有一氧化氮(NO)釋放；圖3的結(jié)果證實羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-ΡΕΙ-Ν0)在PBS(pH7.4)緩沖液中持續(xù)釋放40h，達(dá)到最大累計釋放量為680nmol/mg。
[0112]實施例12:羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-N0)的抗菌性
[0113]將實施例2制備得到的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-PE1-NO)形成的產(chǎn)物以低濃度和高濃度分別加入含有2mL大腸桿菌菌懸液和4mL PBS緩沖液的溶液中，37°C培養(yǎng)24h，結(jié)果如圖4所示。I號為低濃度、2號為高濃度、3號為對比樣品，對比發(fā)現(xiàn)I號和3號一樣渾濁，2號澄清透明，證實羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠載一氧化氮(CPCTS-ΡΕΙ-Ν0)形成的產(chǎn)物具備有效抑制細(xì)菌和真菌的生長和繁殖的能力，在常見的口腔致病菌、皮膚癬菌、傷口感染菌等抑菌效果方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0114]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 往羧化殼聚糖的水溶液中加入1-( 3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺攪拌溶解，再加入聚乙烯亞胺，攪拌反應(yīng)，得到羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠；將羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠懸浮于甲醇鈉/甲醇溶液中，通入一氧化氮加壓反應(yīng)，得到載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠的制備方法，其特征在于:所用羧化殼聚糖、聚乙烯亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為(I?2): (I?2):(1.2?2):(1.2?2)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠的制備方法，其特征在于:所述羧化殼聚糖的分子量為150000?200000;所述聚乙烯亞胺的分子量為1800?20000。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠的制備方法，其特征在于:所述聚乙稀亞胺的加入量為每10mL水中加入2?3克計。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠的制備方法，其特征在于:所述攪拌反應(yīng)的時間為24?36h，攪拌轉(zhuǎn)速為600?800rpm。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠的制備方法，其特征在于:所述羧化殼聚糖、聚乙烯亞氨、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺總質(zhì)量與所用水溶液體積的比例為5?15g/1 OOmL。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠的制備方法，其特征在于:所述羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠的質(zhì)量與CH3ONa/CH3OH溶液體積的比例為5?1g/10mL。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠的制備方法，其特征在于:所述通入一氧化氮加壓反應(yīng)指通入氮氣使反應(yīng)容器內(nèi)壓力為600?800KPa。9.一種載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠，其特征在于由權(quán)利要求1?8任一項所述的制備方法制得。10.權(quán)利要求9所述的載一氧化氮的羧化殼聚糖-聚乙烯亞胺水凝膠在生物醫(yī)學(xué)工程材料領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K33/00GK105832656SQ201610355430
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月25日
【發(fā)明人】馬棟, 吉玉潔, 張武, 薛巍
【申請人】暨南大學(xué)