一種高純度荷葉總生物堿提取物的制備方法與用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種高純度荷葉總生物堿提取物及其制備方法， 以及此荷葉總生物堿提取物在用于治療和/或預(yù)防肥胖方面疾病的用途，結(jié)果顯示其具有 較高的3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖、分化抑制活性，可有望用于降脂減肥藥物和/或保健品的制 備。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)今，肥胖已成為全球性疾病，并以驚人的速度增長(zhǎng)。雖然人們普遍認(rèn)為肥胖是由 于能量攝入和消耗之間的長(zhǎng)期失衡所導(dǎo)致，但肥胖的病因卻是極為復(fù)雜的，包括各種行為， 環(huán)境因素，代謝和遺傳因素等相互作用。肥胖不僅影響美觀，而且與生活中常見的疾病密切 相關(guān)并增大其風(fēng)險(xiǎn)，包括高血壓，高血脂，冠狀動(dòng)脈疾病和2型糖尿病等，已逐漸成為世界性 健康問題之一。
[0003] 荷葉為睡蓮科蓮屬植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥葉，具有減肥降脂作 用，《本草綱目》中就有"荷葉服之，令人瘦劣"的記載。中國(guó)荷葉資源豐富，主要分布在長(zhǎng)江、 黃河和珠江等三大流域，為衛(wèi)生部批準(zhǔn)的"既是食品又是藥品"的品種。
[0004] 現(xiàn)代臨床廣泛將荷葉應(yīng)用于肥胖癥及高血脂癥，并取得了較好的療效，研究表明 荷葉生物堿類化合物為其主要活性物質(zhì)，具有降脂減肥、降膽固醇、降血糖、降血壓、抑制細(xì) 胞有絲分裂和抗菌活性等，故對(duì)荷葉生物堿類成分的開發(fā)利用對(duì)于肥胖疾病的治療有著極 為廣闊的前景。
[0005] 3T3-L1前脂肪細(xì)胞在諸多文獻(xiàn)中已有報(bào)道，其與高脂肥胖癥狀有著密切的聯(lián)系。 3T3-L1前脂肪細(xì)胞可分化為成熟的脂肪細(xì)胞，成熟脂肪細(xì)胞可大容量的儲(chǔ)存脂滴，而脂肪 細(xì)胞的數(shù)目多少正是肥胖疾病形成的關(guān)鍵因素之一，故抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖和分 化，干預(yù)成熟脂肪細(xì)胞的形成及數(shù)量，可對(duì)脂滴的儲(chǔ)存量進(jìn)行調(diào)控，從而達(dá)到減少脂肪儲(chǔ) 存、控制和治療肥胖的目的。
[0006] 文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)荷葉總生物堿的提取純化較多采用大孔樹脂分離法，采用樹脂吸附技 術(shù)制備的荷葉總生物堿含量較低。因此，提供一種簡(jiǎn)易的提取荷葉生物堿的方法，且獲得含 有高純度總生物堿的荷葉提取物，并將其研究開發(fā)為具有3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖、分化抑 制活性的抑制劑，不僅符合抗肥胖癥的要求，而且具有良好的市場(chǎng)前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在提供一種具備降脂減肥活性的高純度總生物堿提取物及其制備方法， 所要解決的技術(shù)問題是制備出高純度總生物堿提取物及降脂減肥相關(guān)活性的研究。采用本 發(fā)明方法制備的荷葉總生物堿提取物，藥材提取完全，目標(biāo)化合物提取效率高，方便簡(jiǎn)單， 原料來源豐富易得，工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，后處理簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境無污染，具有較大推廣性。
[0008] 本發(fā)明制備出的高純度總生物堿提取物的方法是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 以荷葉即蓮科蓮屬植物蓮的干燥葉為原材料，將其粉碎，過五十目篩，用稀鹽酸溶 液浸提三次。浸出液合并、過濾，過強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂。收集樹脂，進(jìn)行陰干處理，再用 氨水潤(rùn)濕，以乙醇溶劑回流提取至生物堿提取完畢，提取液減壓濃縮、干燥得總生物堿提取 物。
[0010] 通過本發(fā)明所制備的荷葉總生物堿提取物，經(jīng)HPLC進(jìn)行含量測(cè)定，荷葉堿占該提 取物重量的30.88~40.12% (w/w)，N-去甲基荷葉堿占該提取物重量的20.94~28.35% (w/ w)，0-去甲基荷葉堿占該提取物重量的3.67~6.32% (w/w)，杏黃罌粟堿占該提取物重量的 2.81~5.16% (w/w)，厚殼桂素占該提取物重量的0.81~1.88% (w/w)。所述荷葉堿、N-去甲 基荷葉堿、0-去甲基荷葉堿、杏黃罌粟堿和厚殼桂素等5種生物堿占總生物堿提取物重量的 59.11~81.93%(w/w)。
[0011] 本發(fā)明首次建立了同時(shí)測(cè)定荷葉總生物堿提取物中厚殼桂素、杏黃罌粟堿、0-去 甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿及荷葉堿等5種生物堿含量的HPLC色譜方法，所制備的荷葉總 生物堿提取物中荷葉堿、N-去甲基荷葉堿、0-去甲基荷葉堿、杏黃罌粟堿和厚殼桂素等5種 生物堿質(zhì)量控制方法如下：
[0012] (1)總生物堿提取物溶液的配置取適量總生物堿加色譜甲醇超聲溶解，用微孔濾 膜(0.45μπι)濾過，濾液為供試品溶液，于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0013] (2)對(duì)照品溶液的配制取厚殼桂素、杏黃罌粟堿、0-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉 堿、荷葉堿對(duì)照品適量，精密稱定，加色譜甲醇超聲溶解，分別轉(zhuǎn)移至1 OmL容量瓶定容，制成 1 · 72mg/mL、1 · 03mg/mL、2 · 46mg/mL、1 · 68mg/mL、2 · 57mg/mL 的厚殼桂素、杏黃罌粟喊、〇-去甲 基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿、荷葉堿對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0014] (3)色譜條件色譜柱:Kromasi 1 &8柱（4 · 6mm X 250mm，5μπι);流動(dòng)相:Α(0 · 1 %三乙 胺水溶液）-B(乙腈）線性梯度洗脫：0-10min，45%B;10-15min，645-60%B;15-25min，60% B;流速：1. OmL/min;柱溫：30 °C ;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm;進(jìn)樣量:20yL。
[0015] (4)方法學(xué)考察
[0016] 在一實(shí)施例中，其方法學(xué)考察方法與結(jié)果如下：
[0017] 線性關(guān)系精密吸取各生物堿對(duì)照品溶液適量，分別置10mL量瓶中，加色譜甲醇至 刻度，搖勻。最終得厚殼桂素〇. 344~34.4yg/mL、杏黃罌粟堿0.309~30.9yg/mL、0-去甲基 荷葉堿0 · 492~49 · 2yg/mL、N-去甲基荷葉堿1 · 68~168yg/mL、荷葉堿2 · 57~257yg/mL的混 合對(duì)照品溶液，分別用微孔濾膜(〇.45μπι)濾過，按"(3)"項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取20yL， 注入液相色譜儀，以峰面積A為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度c(yg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù) 基線噪音，以3倍信噪比為檢測(cè)限，10倍信噪比為定量限，確定最低檢測(cè)限和定量限。結(jié)果見 表1。
[0018] 表1各生物堿對(duì)對(duì)照品回歸方程、檢測(cè)限及定量限
[0019]
[0020] 注:1.厚殼桂素;2.杏黃罌粟堿;3.0-去甲基荷葉堿;4. N-去甲基荷葉堿;5.荷葉堿
[0021] 精密度試驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品溶液20yL，按"(3)"項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次， 結(jié)果5個(gè)對(duì)照品峰面積的RSD分別為1.7%、1.9%、1.3%、1.2%、1.1%，表明儀器精密度良 好。
[0022]穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別于配制后0,4,8，12,2處，按"(3)"項(xiàng)下色譜條 件依次測(cè)定峰面積。結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定，測(cè)定結(jié)果均無顯著變化，厚殼 桂素、杏黃罌粟堿、0-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿、荷葉堿RSD分別為1.9 %、2.1 %、 1.8%、1.6%、1.5%，表明供試品溶液24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
[0023] 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取荷葉總生物堿供試品6份，按"（1)"項(xiàng)下方法制備供試品溶 液，按"(3)"項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果厚殼桂素、杏黃罌粟堿、0-去甲基荷葉堿、N-去 甲基荷葉堿、荷葉堿含量的RSD分別為2.3%、2.5%、1.8%、1.9%、2.1%，表明該法重復(fù)性 好。
[0024] 加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的同一總生物堿(厚殼桂素、杏黃罌粟堿、0-去 甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿、荷葉堿的含量分別為1.59%、4.81 %、5.67%、25.94%、 37.88% )6份，每份大約2mg，分別置于10mL的容量瓶，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(厚殼 桂素0.0344mg/mL、杏黃罌粟堿0.103mg/mL、0_去甲基荷葉堿0.123mg/mL、N_去甲基荷葉堿 0.504mg/