魚用兒茶素制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 兒茶素為茶葉中最主要的天然活性成分，具有多種藥理和保健活性。本發(fā)明涉及 一種新型、高生物利用度的魚用兒茶素保健制劑的制備方法及其評價。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，由于工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展和人類對自然界的不斷索取導(dǎo)致的環(huán)境污染、氣候 變化等對我國水域環(huán)境、水產(chǎn)漁業(yè)養(yǎng)殖的影響也已逐漸顯現(xiàn)，尤其在我國一些經(jīng)濟(jì)相對較 發(fā)達(dá)的地區(qū)，由于化工廠、印染廠等高污染企業(yè)的大量污染物排放，已經(jīng)對當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖和天然 水源產(chǎn)生了嚴(yán)重污染。近年來，加之水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化技術(shù)的不斷深入，隨后產(chǎn)生的由養(yǎng)殖水 環(huán)境飼料殘留、富營養(yǎng)化以及隨之產(chǎn)生的水污染等因素引起的魚類疾病日趨嚴(yán)重，尤其是 飼料中高營養(yǎng)素引起的疾病逐漸突出。目前，養(yǎng)殖人員為了加快魚類的生長，縮短飼養(yǎng)周 期，在飼料中加入大量的營養(yǎng)素，從而導(dǎo)致肝脂質(zhì)、營養(yǎng)素代謝紊亂導(dǎo)致的肝性疾病，雖然 此類疾病無傳染性，但危害可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過傳染病。
[0003] 茶多酚（TeaPolyphenols，TP)是茶葉中多酚類及其衍生物的總稱，主要有兒茶 素、黃酮類、花青素和酚酸等物質(zhì)組成，其中兒茶素類占茶多酚總量的60% -90%。兒茶 素具有很強(qiáng)的生物活性，大量研究均表明兒茶素具有抗氧化清除自由基、抗心血管疾病、降 "三高"（高血脂、高血壓和高血糖）、抑菌消炎等多種藥理保健作用。加之兒茶素類化合物 具有排除體內(nèi)有毒、有害物質(zhì)（如清除重金屬、自由基等）的能力，因此開發(fā)新型魚用兒茶 素類水生動物保健品對于發(fā)展我國綠色水產(chǎn)養(yǎng)殖、保證魚類健康、降低漁藥使用和水產(chǎn)品 藥物殘留具有良好的研發(fā)前景。
[0004] 同時由于我國是世界上最大的茶葉種植國和茶葉加工出口國，每年有大量尚品質(zhì) 茶葉采摘、加工和生產(chǎn)，在這些高品質(zhì)茶葉加工過程，大量次品、茶葉下腳料等被廢棄，而其 中仍含有大量的兒茶素類等天然活性成分，如果直接將這些次品、下腳料丟棄，不但大量資 源被浪費(fèi)，而且還對環(huán)境造成重大污染。因此，通過各種萃取技術(shù)將其中的大量的兒茶素制 備純化，然后應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，不僅減少了資源浪費(fèi)，而且對發(fā)展茶產(chǎn)業(yè)循環(huán)經(jīng)濟(jì)具有 重要影響。所以研發(fā)制備新型魚用兒茶素類動物保健品，從而提高兒茶素穩(wěn)定性和魚體內(nèi) 的生物利用度，必將為兒茶素的開發(fā)利用與我國漁業(yè)生產(chǎn)的結(jié)合奠定堅實的基礎(chǔ)。
[0005] 結(jié)合本實驗室前期研究積累和大量文獻(xiàn)資料可知，由于兒茶素類化合物極性較 大、水溶性較高，生物膜滲透性較差，加之小腸上皮細(xì)胞膜中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（P-糖蛋白、多藥耐 藥相關(guān)蛋白等）可能對兒茶素發(fā)揮"外排"作用，從而使得該類化合物口服后難以通過小腸 上皮細(xì)胞進(jìn)入全身血液循環(huán)，以致兒茶素類化合物在機(jī)體內(nèi)的生物利用度較低，大部分在 腸道中被各種酶或微生物所代謝和降解，或隨糞便排泄到體外，從而使得該類化合物難以 在體內(nèi)發(fā)揮有效作用。因此，如何提高兒茶素類化合物生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)速率，從而提高其生物利 用度和增強(qiáng)兒茶素類化合物在作用靶部位的富集，是解決限制兒茶素大規(guī)模應(yīng)用這一重要 "瓶頸"的關(guān)鍵共性問題。目前在提高兒茶素生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)方面的研究主要集中在兒茶素衍生 化物的制備和應(yīng)用上，近來年也有學(xué)者開展了兒茶素/茶多酚納米粒制劑或注射用納米乳 劑的研究，但此類研究主要是針對人類保健品開發(fā)進(jìn)行的有益探索，此類研究并不適合水 產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用。
[0006] 具體而言，目前為了提高兒茶素類天然成分的生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)速率或生物利用度，主 要有如下幾種劑型和制劑：
[0007] 1、茶多酚的微囊制劑：該劑型以乙基纖維素為囊材，采用溶劑揮發(fā)技術(shù)制備茶多 酚（TP)緩釋微囊，該劑型可以提高TP穩(wěn)定性和緩釋作用，且包封率較高，但TP主要活性成 分兒茶素的含量降低了，可能是乙基纖維素結(jié)構(gòu)中含有多酚羥基，與兒茶素酚羥基結(jié)合使 之難以溶出。
[0008] 2、茶多酚的微球制劑：該劑型以生物可降解高分子材料羥丙基甲基纖維素鄰苯二 甲酸酯（HPMCP)為骨架材料，制備了TP微球，結(jié)果顯示加入少量乳化劑可提高TP的包封 率，具有一定的緩釋效果。
[0009] 3、茶多酚的脂質(zhì)體：采用逆相蒸發(fā)法制備TP-維生素E脂質(zhì)體，包封后可增加TP 的穩(wěn)定性，并具有長效特點(diǎn)，同時也可以顯著提高其生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)和生物利用度。
[0010] 然而，上述這些能夠顯著提高兒茶素類化合物生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)速率或生物利用度的制 劑，均為針對人類的使用方式所制備，這些制劑難以用于魚類動物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能提高兒茶素生物利用度的魚用半固體膠 囊制劑---魚用兒茶素制劑的制備方法。
[0012] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種魚用兒茶素制劑的制備方法，包括以下 步驟：
[0013] 1)、兒茶素溶液的配制：
[0014] 將兒茶素溶解于超純水，配制成濃度為9~llmg/mL(較佳為10mg/mL)的兒茶素 EGCG液體；
[0015]2)、在兒茶素EGCG液體中加入PEG1000 (聚乙二醇1000,作為吸收促進(jìn)劑），直至 PEG1000 的終質(zhì)量濃度為10%~30%;
[0016] 然后再加入抗氧化劑和混合氨基酸，最后加入PEG4000 (作為半固體膠凝劑）直至 PEG4000 的終質(zhì)量濃度為10%~20%;
[0017] 所述抗氧化劑與兒茶素EGCG液體的質(zhì)量比為0. 25~0. 5%，混合氨基酸與兒茶素 EGCG液體的質(zhì)量比為0. 5~1. 0%;
[0018] 3)、液體灌裝膠囊的制備：
[0019] 將步驟2)所得液體灌入膠囊中，得魚用兒茶素制劑。
[0020] 備注說明：上述液體在膠囊中會自然凝固形成半固體狀態(tài)。
[0021] 作為本發(fā)明的魚用兒茶素制劑的制備方法的改進(jìn)：
[0022] 所述抗氧化劑為亞硫酸鈉；
[0023] 所述混合氨基酸由茶氨酸和甘氨酸組成，所述茶氨酸的重量含量為8~12% (較 佳重量含量為10%，即，混合氨基酸由茶氨酸和甘氨酸按照1 :9的重量比例混合而得）。
[0024] 作為本發(fā)明的魚用兒茶素制劑的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟2)在100~ 200轉(zhuǎn)/分的攪拌轉(zhuǎn)速下進(jìn)行（磁力攪拌）。
[0025] 作為本發(fā)明的魚用兒茶素制劑的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0026] 所述步驟1)中：兒茶素EGCG液體的濃度為10mg/mL;
[0027]所述步驟2)中：PEG1000的終質(zhì)量濃度為20%，亞硫酸鈉與兒茶素EGCG液體的質(zhì) 量比為0. 4%，混合氨基酸與兒茶素EGCG液體的質(zhì)量比為1. 0%，所述混合氨基酸由茶氨酸 和甘氨酸按照1 :9的重量比例混合而得，PEG4000的終質(zhì)量濃度為20%。
[0028] 在本發(fā)明中：
[0029] 步驟1)可利用超聲振動，從而使兒茶素溶解于超純水中；
[0030] 步驟2)在100~200轉(zhuǎn)/分的攪拌條件下進(jìn)行（例如為磁力攪拌），步驟2)所得 液體為磁力攪拌下呈低粘度的兒茶素混合溶液；
[0031 ] 步驟3)中，一般每粒膠囊灌裝0. 5-1.OmL的液體。
[0032] 本發(fā)明的魚用制劑（魚用兒茶素制劑）屬于一種生物利用度增強(qiáng)型兒茶素魚用半 固體膠囊制劑。
[0033] 本發(fā)明在發(fā)明過程中，根據(jù)魚腸道吸收模型，通過定量檢測不同吸收促進(jìn)劑對兒 茶素EGCG體內(nèi)的吸收量，從而篩選出能夠提高兒茶素生物利用度的吸收促進(jìn)劑，并使之與 兒茶素以適當(dāng)比例混合，從而制成半固體膠囊制劑。本發(fā)明的魚用制劑能夠提高魚體內(nèi)的 兒茶素生物利用度。即，本發(fā)明主要是考慮到魚類腸道特點(diǎn)和生活習(xí)性，采用PEG1000 (為 吸收促進(jìn)劑）和PEG4000(為半固體膠凝劑）作為制劑輔料，從而能夠顯著達(dá)到滿足兒茶素 劑型的完整性和腸道中吸收的快速轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)。
[0034] 本發(fā)明采用魚血漿生物利用度方法評價，具體實施如下：
[0035] 1)、實驗用魚血漿樣品中兒茶素EGCG的定量檢測方法的建立：采用向0. 3mL空白 血漿中加入兒茶素EGCG標(biāo)準(zhǔn)品的方法，配制濃度范圍為0. 5-500mg/L的兒茶素EGCG標(biāo)準(zhǔn) 樣品，向其中加入30yL20%的抗壞血酸，混合后加入2-3mL乙酸乙酯，振蕩lmin，6000r/ min高速離心5min，取出全部有機(jī)相，殘渣用2mL乙酸乙酯重復(fù)萃取一次，合并兩次萃取 有機(jī)相，于45°C水浴中氮?dú)饬鞔蹈?，殘渣?.lmL20%的乙腈水溶液溶解，超聲振蕩后， 12000r/min高速離心3min，取20μL上清液HPLC進(jìn)樣分析。
[0036] 根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，以峰面積（Υ)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線，求出曲線方程和相關(guān)系數(shù)（r)。同時制備含兒茶素EGCG曲線范圍內(nèi)高、中、低濃度血漿 樣品0. 5, 5. 0, 50.Omg/L作為質(zhì)控樣品（QC)，分別按照上述樣品處理方法處理后進(jìn)樣分析， 每個濃度樣品重復(fù)5次，以樣品中EGCG峰面積與直接溶于流動相下所測峰面積之比，計算 高、中、低3種濃度下方法回收率。比較以上樣品于日內(nèi)5次和日間5次測定的峰面積的變 化，計算日內(nèi)精密度和日間精密度。
[0037]2)、實驗用魚的選擇：實驗用健康鯽魚購于杭州蕭山躍騰水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，體重 150±20g，實驗組200條健康鯽魚隨機(jī)分為4組，膠囊飼喂組（本發(fā)明）、普通兒茶素EGCG 顆粒料組、腹腔注射組和空白對照組，每組50只，每組均分別放入2個lmX lmX lm水族箱 中適應(yīng)性養(yǎng)殖3天，循環(huán)水養(yǎng)殖。上述4個實驗組正式實驗飼喂前12h均禁食。膠囊飼喂 組、普通兒茶素顆粒料組劑量均為200mg/kg.天，腹腔注射組劑量為100mg/kg.天；備注說 明：上述200mg、100mg均指的是有效成分兒茶素的用量。
[0038] 3)、生物利用度的計算：將上述不同實驗組和對照組，分別于處理后0.083、0. 17、 0. 5、1. 0、2. 0、4. 0、8. 0、12. 0、24. 0和48.Oh尾靜脈取血，每個時間點(diǎn)采血5只，然后將所取 血液于肝素化離心管中，6000r/min離心后，取1. 5mL血漿于lOmL離心管中，同時按照1)項 下的處理方法處理后進(jìn)HPLC分析。將所測血漿中兒茶素EGCG峰面積代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方 程中，計算血漿中兒茶素EGCG濃度，繪制血藥濃度--時間曲線，利用3P97藥物動力學(xué)軟 件計算藥物濃度一時間曲線下面積（AUC)，將膠囊飼喂組和普通兒茶素EGCG顆粒飼料組分 別與腹腔注射組所得AUC數(shù)值進(jìn)行比較，以此來評價新型制劑對兒茶素在小腸內(nèi)吸收生物 利用度的影響。
[0039] 本發(fā)明在對兒茶素在魚腸道吸收增強(qiáng)作用研究的基礎(chǔ)上，篩選出良好的兒茶素保 健品新配方，從而制