液中固定3小時；
[0058] (4)剝離視網(wǎng)膜：在手術(shù)顯微鏡下用角鞏膜剪于眼球角鞏膜緣后約0. 5mm處剪開， 除去角膜、虹膜，娩出晶狀體和玻璃體。將視網(wǎng)膜以視盤為中心放射狀剪開4刀，置于載玻 片上，用顯微有齒鑷小心將鞏膜翻轉(zhuǎn)，完整分離出視網(wǎng)膜，平鋪于載玻片上；
[0059] (5)封片：滴少許封片劑后以蓋玻片封片；
[0060] (6)照相：立即置于激光掃描共聚焦熒光顯微鏡下觀察、照相。
[0061] 四.視網(wǎng)膜伊文思藍(lán)（EB)滲漏量測定
[0062] (1)分別取各組4只大鼠乙醚麻醉后，進(jìn)行視網(wǎng)膜EB滲漏量的檢測。EB溶于 0. 09 %生理鹽水，濃度為30mg/ml，超聲波震蕩5min，直徑5μm的過濾器過濾，4°C冰箱保存 備用。
[0063] (2)尾靜脈注射 45mg/kgEB。
[0064] (3) 2h后打開心腔，左室灌注（0· 05M，PH3. 5)的檸檬酸緩沖液（37°C預(yù)熱），灌注 壓力為120mmHg(灌注流量相當(dāng)于66ml/min)，時間2min。
[0065] (4)灌注結(jié)束后迅速摘除眼球，仔細(xì)分離視網(wǎng)膜組織，稱其濕重。
[0066] (5)將視網(wǎng)膜與120μ1甲酞胺70°C孵育18h，提取液4°C15000rpm高速離心 30min，取上清分別測620nm及740nm的吸光度值，求其凈吸光度值。
[0067] (6)建立EB染料濃度在甲酰胺中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)EB與凈A值的關(guān)系，得到實際 溶液中EB濃度，用濃度乘以300μ1得出視網(wǎng)膜EB滲漏量（ng)。最后用視網(wǎng)膜干重（mg) 標(biāo)化EB滲漏量（ng)，結(jié)果表示為ng/mg。
[0068] 五·視網(wǎng)膜實時熒光定量檢測
[0069] 1.大鼠視網(wǎng)膜的提取
[0070] 過量麻醉處死大鼠，在手術(shù)顯微鏡下迅速摘取雙眼眼球，去除角膜、晶狀體、玻璃 體，取出雙眼視網(wǎng)膜組織，分別置于不同凍存管中，放入液氮灌中保存。實驗時隨機抽取左 眼或右眼視網(wǎng)膜用于RNA提取。
[0071] 2.Trizol法提取視網(wǎng)膜總RNA
[0072](1)脫臼處死大鼠，摘除眼球，解剖顯微鏡下取出視網(wǎng)膜組織。
[0073] (2)將視網(wǎng)膜組織放入玻璃體勻漿器中置于冰上的碾碎，每100mg組織加入1ml Trizol。室溫放置5min，把裂解液轉(zhuǎn)移到無酶的L5mlEppendorf管中。
[0074] (3)加入0· 2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3min。
[0075] (4)lOOOOrpm4°C離心15min，樣品分為三層：底層為粉紅色的有機相，上層為無 色水相和一個中間層。
[0076] (5)把水相轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，室溫放置10min。
[0077] (6)lOOOOrpm4°C離心10min，離心后在管底出現(xiàn)白色膠狀沉淀，移去上清。
[0078] (7)加 1ml75 % 乙醇（用DEPC水配置）洗滌RNA沉淀，7500rpm4°C離心 5min， 棄去上清。
[0079] (8)室溫放置空氣干燥沉淀，加40ulRNA溶解液，_80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0080] 3.測定樣本總RNA的純度和濃度
[0081] (1)調(diào)零：取49ulRNA溶解液加于紫外分光光度計的比色管中，進(jìn)行調(diào)零。
[0082] (2)測定樣本RNA含量：取lul樣本RNA加入調(diào)零比色管中，讀取數(shù)值。
[0083] (3)樣本RNA濃度的計算：RNA樣本濃度（ug/ml) = 0D260X40ug/mlX50
[0084] (4)樣本RNA純度的計算：以0D260/0D280比值檢測RNA的純度，比值在L8-2. 0 范圍說明純度較好。
[0085] (5)電泳：取樣本RNA2ul加于瓊脂糖凝膠上樣孔內(nèi)，130v恒壓電泳lOmin。在凝 膠成像儀上觀察結(jié)果，可見三條帶即28s、18s、5s，條帶清晰表示RNA完整。
[0086] 4.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0087] (1)反應(yīng)體系各成分用量見表3. 1。
[0088] 表3. 1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系
[0089]
[0090] (2)反應(yīng)條件：25°C孵育 10min，42°C孵育 30min，85°C加熱 5min失活EasyScript RT〇
[0091] (3)反應(yīng)流程：將各組份按照反應(yīng)體系所示加入0. 2ml微離心管中，放入PCR儀， 按反應(yīng)條件設(shè)定程序，開始運行。結(jié)束后取出產(chǎn)物進(jìn)行下一步實驗。
[0092] 5.實時熒光定量PCR
[0093] (1)引物設(shè)計：根據(jù)引物設(shè)計的原則，由上海生工設(shè)計并合成針對大鼠的 β-actin、p21、CDK2及cyclinE的特異性引物（表3·2)。
[0094] 表 3. 2β-actin、eNOS、iNOS及Ang-Ι的特異性引物設(shè)計
[0095]
[0096] (2)配制PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系各成分用量見表3. 3。
[0097] 表3. 3PCR反應(yīng)體系
[0098]
[0099] (3)將反應(yīng)板放入即7700型熒光定量PCR儀中，這種儀器較普通的PCR儀增加 了一套復(fù)雜而緊密的熒光強度檢測系統(tǒng)及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，可對PCR反應(yīng)過程中的每一循環(huán) 的系統(tǒng)熒光強度進(jìn)行實時（real-time)檢測，通過對熒光強度的分析來達(dá)到等量檢測的目 的。設(shè)置好反應(yīng)板文件和程序，開始運行，擴(kuò)增反應(yīng)條件如下（表3.4):
[0100] 表3. 4熒光定量PCR的反應(yīng)擴(kuò)增條件
[0101]
[0102] (4)反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動生成CT(thresholdcycles)值及恪解曲線圖。CT值的 含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。CT值與模板的起始 拷貝數(shù)的對數(shù)存在嚴(yán)格的線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。以β-actin為內(nèi)參。每 份模板的每個基因都設(shè)置了 3個重復(fù)孔，獨立的實驗重復(fù)至少3次。全部實驗結(jié)束，分析并 整理數(shù)據(jù)。
[0103] 6待測組織中目的基因相對量的測定
[0104]按下列公式計算目的基因的相對量：
[0105] ΛCT=CT目的基因一CT管家基因
[0106] ΛΛCT=ΛCT實驗組一ΛCT正常對照組
[0107] 采用2_ΛΛετ表示實驗組目的基因表達(dá)量相對于正常對照組表達(dá)量的倍數(shù)關(guān)系。
[0108] 六.視網(wǎng)膜TUNEL染色
[0109] 1.取材及冰凍切片制備
[0110] (1)造模后第3個月處死大鼠，完整取出大鼠眼球；
[0111] (2)立即將大鼠眼球于液氮中冷凍10-15秒，以0CT包埋；
[0112] (3)立即將0CT包埋的大鼠眼球冷凍于_80°C超低溫冰箱，15分鐘后取出。
[0113] (4)將冷凍包埋好的組織用冰凍切片機連續(xù)切片，厚度為5μm，制成冰凍切片，切 片暫時冷凍于-20°C備用。
[0114] 2.取材及冰凍切片制備
[0115] (1)冰凍切片室溫復(fù)溫30分鐘；
[0116] ⑵冰丙酮固定8min，4°CPBS洗3次X5分鐘
[0117] (3) 3 %BSA室溫封閉30分鐘
[0118] (4)滴加TUNEL反應(yīng)混合液室溫孵育lh，4°CPBS洗3次X5分鐘；
[0119] (5)DAPI染核 1 分鐘，4°CPBS洗 3 次X5 分鐘。
[0120] 七·Westernblot檢測大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、VEGFR、Ang-l、Tie-2、Z0-l及VCAM-1 的表達(dá)量
[0121] 1.大鼠視網(wǎng)膜組織的采集
[0122] (1)術(shù)前準(zhǔn)備1)手術(shù)室消毒：紫外線燈照射30min，通風(fēng)15min;2)手術(shù)器械消毒： 手術(shù)器械高壓蒸汽滅菌半小時，放入烘箱風(fēng)干備用。
[0123] (2)取樣方法1)麻醉：稱重后10 %水合氯醛以300mg/kg腹腔注射麻醉2)麻醉 后lOmin，將大鼠側(cè)臥于手術(shù)臺上，顯微鑷固定大鼠眼球，剪除眼球周圍組織置于生理鹽水 中沖洗3遍。在顯微鏡下去除角膜、晶狀體和玻璃體，用顯微鑷分離視網(wǎng)膜組織。組織冷凍 于液氮中備用。
[0124] 2.大鼠視網(wǎng)膜組織總蛋白的提取
[0125] (1)取lOOmg視網(wǎng)膜組織加入1ml預(yù)冷的組織細(xì)胞裂解液和2μ1PMSF，磷酸酶抑 制劑，冰上勻漿、超聲裂解90sec〇
[0126] (2)冰上靜置裂解30min，靜置過程中每5min用移液器吹打10次。
[0127] (3)4°C13000rpm離心20min，移取上清分裝于干凈的EP管，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0128] 3.Westernblot
[0129] (1)蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理：樣品蛋白與4XSDS加樣緩沖液按3 :l(v/v)混勻，100°C 水浴變性l〇min，12,OOOrpm離心5min，去除雜質(zhì)。
[0130] (2)蛋白濃度的測定（考馬斯亮藍(lán)法）：
[0131] 1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0132] 2)根據(jù)樣品數(shù)量，按試劑A:B為50:1的比例配制BCA試劑工作液，充分混勻；
[0133] 3)各孔加入200μ1BCA工作液，37°C放置30min;
[0134] 4)完全溶解的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10μ1加PBS稀釋至100μ1，使終濃度為200. 5mg/ ml；
[0135] 5)將標(biāo)準(zhǔn)品按 0μ1，1μ1，2μ1，4μ1，8μ1，12μ1，16μ1，20μ1 依次加到 96 孔板 的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加PBS補足到20μ1;
[0136] 6)加2μ1樣品到96孔板的樣品孔中，加PBS到20μ1;
[0137] 7)酶標(biāo)儀測定Α562;
[0138] 8)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度；
[0139] (3)SDS_PAGE電泳膠的配制：
[0140] 1)安裝制膠用玻璃板；
[0141] 2)配10%分離膠，混勻后將膠灌注于兩玻璃板間至分離膠液面距離短玻璃板上 沿約1. 5cm處；3)在分離膠上注入一層雙蒸水，室溫下放置30min;
[0142] 4)分離膠與雙蒸水間出現(xiàn)一條明顯的界限時，倒去雙蒸水，用濾紙吸干殘留水 分；
[0143] 5)配制濃縮膠，混勻后將膠直接