煙酸的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及煙酸的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 世界衛(wèi)生組織2015年糖尿病報(bào)告指出，全球有347, 000, 000的糖尿病患 者，18歲以上的成年人中糖尿病的患病率估計(jì)為9%。糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者最常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥，在糖尿病患者中DR的患病率高達(dá) 51. 3%，造成患者視力嚴(yán)重下降甚至失明，是成年人致盲的重要原因。血-視網(wǎng)膜屏障的損 傷及其伴隨的視網(wǎng)膜血管通透性增加是非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變的一個(gè)主要特征，也是 視力喪失的主要原因。作為一種調(diào)脂藥物，煙酸已用于預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化達(dá)數(shù)十年 之久，煙酸可有效降低總膽固醇（TC)、低密度脂蛋白（LDL)同時(shí)有升高高密度脂蛋白（HDL) 的作用。一些研究證實(shí)煙酸具有改善血管內(nèi)皮功能，降低血管通透性的作用。
[0003]microRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子， 它們?cè)趧?dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。microRNA-126是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性高表達(dá)的 miRNA，它主要調(diào)控的目的基因包括Ang-1、VEGF、VCAM-1。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供煙酸的新用途。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0006] 煙酸具有調(diào)控microRNA-126表達(dá)的用途。
[0007] 優(yōu)選的，上述煙酸的用途，所述煙酸通過(guò)上調(diào)microRNA-126的表達(dá)量，進(jìn)而增加 Ang-Ι的表達(dá)，用于制備增強(qiáng)損傷血管修復(fù)的藥物。
[0008] 優(yōu)選的，上述煙酸的用途，所述煙酸通過(guò)上調(diào)microRNA-126的表達(dá)量，進(jìn)而抑制 VEGF的表達(dá)，用于制備減少細(xì)胞的增殖以及病理性新生血管、減少BRB破壞的藥物。
[0009] 優(yōu)選的，上述煙酸的用途，所述煙酸通過(guò)上調(diào)microRNA-126的表達(dá)量，進(jìn)而抑制 VCAM-1的表達(dá)，抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，用于制備抑制炎癥因子及白細(xì)胞粘附的藥物。
[0010] 上述煙酸在制備用于治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥物中的用途。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是：
[0012] 本發(fā)明提供了一種煙酸的新用途，研究表明，煙酸治療顯著提高了microRNA-126 的表達(dá)，且煙酸可以顯著改善糖尿病患者的視網(wǎng)膜病變，對(duì)于視網(wǎng)膜微血管具有修復(fù)作用， 在調(diào)控microRNA-126表達(dá)以及制備用于治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥物中具有重要應(yīng)用價(jià) 值。
[0013] 所述煙酸新用途的機(jī)制主要是microRNA-126在DR中顯著下降，而煙酸通過(guò)上調(diào) microRNA-126的量，從而增加Ang-Ι的表達(dá)，Ang-Ι有助于損傷血管的修復(fù)，主要是在促進(jìn) 血管成熟穩(wěn)定過(guò)程中并不增加病理性血管的生成，同時(shí)具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，從而有 助于降低血管通透性以及穩(wěn)定血視網(wǎng)膜屏障（BRB);同時(shí)，上調(diào)的microRNA-126有主與抑 制VEGF的表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡以及減少新生血管的形成，維持BRB的穩(wěn)定；DR與炎癥因子 密不可分，有效的抑制炎癥因子及白細(xì)胞粘附有助于抑制DR的發(fā)展，microRNA-126有效 抑制粘附分子VCAM-1的表達(dá)，減少白細(xì)胞粘附，從而降低BRB的破壞，因此煙酸通過(guò)調(diào)控 microRNA-126表達(dá)，從而調(diào)節(jié)各種血管以及炎癥因子的表達(dá)，修復(fù)血管，抑制炎癥，維持血 視網(wǎng)膜屏障的完整，以致有效治療糖尿病視網(wǎng)膜病變。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1中A.是本發(fā)明實(shí)施例中大鼠視網(wǎng)膜HE染色圖像；B.是本發(fā)明實(shí)施例中大鼠 視網(wǎng)膜TUNEL染色圖像；C.本發(fā)明實(shí)施例中大鼠EB血管灌注造影視網(wǎng)膜鋪片；D.分別是本 發(fā)明實(shí)施例中為大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞計(jì)數(shù)；本發(fā)明實(shí)施例中為大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié) 細(xì)胞層TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)；本發(fā)明實(shí)施例中為大鼠視網(wǎng)膜EB定量檢測(cè)。
[0015] 圖2中A.是本發(fā)明實(shí)施例中大鼠視網(wǎng)膜緊密連接蛋白Claudin-5染色圖像；B.是 本發(fā)明實(shí)施例中大鼠視網(wǎng)膜緊密連接蛋白Occludin染色圖像；C.本發(fā)明實(shí)施例中大鼠視 網(wǎng)膜緊密連接蛋白Claudin-5以及Occludin染色的量化分析；D.是本發(fā)明實(shí)施例中大鼠 視網(wǎng)膜緊密連接蛋白Z0-1的westernblotting以及相對(duì)表達(dá)量結(jié)果。E.是本發(fā)明實(shí)施例 中大鼠視網(wǎng)膜緊密連接蛋白Claudin-5,Occludin和Z0-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果。
[0016] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例中大鼠視網(wǎng)膜microRNA-126的mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果。
[0017] 圖4中A.是本發(fā)明實(shí)施例中大鼠視網(wǎng)膜VEGF以及VEGFR的westernblotting結(jié) 果；B.是本發(fā)明實(shí)施例中大鼠視網(wǎng)膜的VEGF以及VEGFR的westernblotting相對(duì)表達(dá)量 結(jié)果；C.是本發(fā)明實(shí)施例中大鼠視網(wǎng)膜Ang-Ι以及Tie-2的westernblotting結(jié)果；D.是 本發(fā)明實(shí)施例中大鼠視網(wǎng)膜的Ang-Ι以及Tie-2的westernblotting相對(duì)表達(dá)量結(jié)果； E.是本發(fā)明實(shí)施例中大鼠視網(wǎng)膜VEGF，VEGFR以及Tie-2染色圖像；F.本發(fā)明實(shí)施例中大 鼠視網(wǎng)膜VEGF，VEGFR以及Tie-2染色的量化分析
[0018] 圖5中A.是本發(fā)明實(shí)施例中大鼠視網(wǎng)膜緊密連接蛋白VCAM-1的western blotting以及相對(duì)表達(dá)量結(jié)果；B.是本發(fā)明實(shí)施例中大鼠視網(wǎng)膜VCAM-1以及⑶45染色圖 像；C.是本發(fā)明實(shí)施例中大鼠視網(wǎng)膜VCAM-1以及CD45染色的量化分析。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖及具體實(shí) 施方式對(duì)本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 一 ·DR大鼠動(dòng)物模型的建立
[0022] 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0023] 2月齡雄性Wistar大鼠90只，體重200_250g。全部大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物中心 無(wú)特定病原體動(dòng)物（SPF)級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食，室溫為 18-22。。。
[0024] 2.糖尿病大鼠模型制作原理
[0025] 抗腫瘤藥物STZ，通過(guò)選擇性破壞大鼠胰島β細(xì)胞，引起實(shí)驗(yàn)性糖尿病。
[0026] 3.糖尿病模型的制備及建立標(biāo)準(zhǔn)
[0027] 大鼠禁食12h后，造模前尾靜脈取血，測(cè)定血糖并稱重。一次性快速腹腔注射2% STZ，劑量為60mg/kg，48h后檢測(cè)FBG以及尿糖，連續(xù)3次FBG>16. 7mmol/L，尿糖>+++，為造 模成功。
[0028] 4.分組及成模后檢測(cè)
[0029] 將90只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（C0N)、模型對(duì)照組（DR)、煙酸（NA)干預(yù)組，每 組30只大鼠。采用尾靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ)溶液的方法建立DR模型。DR模型建立后 第7天開始，安慰劑組給予蒸餾水灌胃，1次/d;煙酸組以40mg/kg劑量行煙酸溶液灌胃，1 次/d。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。于造模成功后3個(gè)月時(shí)取材。糖尿病模型制備成功后每月檢測(cè)血糖1 次，并記錄體重變化。
[0030] 二.視網(wǎng)膜切片的HE染色以及免疫組化染色
[0031] 1.取材
[0032] 處死大鼠，完整取出大鼠眼球，眼球環(huán)形剪開角膜緣，取出晶狀體及玻璃體，保留 眼杯。
[0033] 2.石蠟切片制備
[0034] (1) 10 %的甲醛溶液固定眼杯；
[0035] (2)組織依次脫水、媒染、浸蠟，最后硬蠟包埋；
[0036] (3)將包埋好的蠟塊，用石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為4μm，制成石蠟切片。
[0037] 3.HE染色
[0038] (1)石蠟切片脫蠟至水：順序依次為，二甲苯浸洗2次共5min，100%、95%、90%、 80%、70%乙醇浸洗31^1^5，自來(lái)水洗滌1〇11^11 ;
[0039] (2)蘇木精染色5min，自來(lái)水洗lmin;
[0040] (3) 1 %鹽酸酒精分化30s，自來(lái)水洗lmin，PBS返藍(lán)30s，自來(lái)水洗lmin;
[0041] (4)伊紅染色2min;自來(lái)水洗3min;
[0042] (5)梯度酒精脫水，二甲苯透明；
[0043] (6)中性樹脂膠封片，光鏡下觀察并拍照。
[0044] 4.視網(wǎng)膜免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)VEGF、VEGFR、Tie-2、Claudin-5、Occludin、 VCAM-1、CD45
[0045] (1)石蠟切片二甲苯脫臘，梯度酒精水化，0· 01MPBS洗3次，5min/次；
[0046] (2)切片浸入0. 01M，PH= 6. 0檸檬酸鹽緩沖液，微波加熱直至沸騰后斷電，間隔 5-10min后，反復(fù)以上操作2次，冷卻，0. 01MPBS洗3次，3min/次；
[0047] (3)加入5%BSA封閉液，室溫孵育20min，甩掉封閉液，勿洗；
[0048] (4)滴加50ul-抗VEGF抗體（1:100稀釋），VEGFR2 (1:800稀釋）；Tie-2 (1:50稀 釋）；Claudin-5 (1:100稀釋）；0ccludin(1:100稀釋）；VCAM-1 (1:500稀釋）；CD45 (1:100 稀釋）.37°C孵育lh，0. 01MPBS洗 3 次，5min/次；
[0049] (5)滴加50ul生物素標(biāo)記的第二抗體山羊抗鼠/山羊抗兔（1 :200稀釋），室溫下 孵育 20min，(λ01MPBS洗 3 次，3min/ 次；
[0050] (6)DAB顯色：1ml蒸餾水加A、B、C液各一滴，現(xiàn)用現(xiàn)配；
[0051] (7)蘇木精復(fù)染lmin，分化液分化，視復(fù)染深淺而定，氨水返藍(lán)；
[0052] (8)梯度酒精脫水，二甲苯透明；
[0053] (9)中性樹膠封片，光鏡下觀察并拍照。
[0054] 三.伊文思藍(lán)（EB)血管灌注造影視網(wǎng)膜鋪片
[0055] 于給藥后第3個(gè)月將3個(gè)組分別取4只大鼠，進(jìn)行EB血管灌注造影視網(wǎng)膜鋪片。 [0056](1)麻醉：稱重后10%水合氯醛以30〇11^/1^腹腔注射麻醉；
[0057] (2)EB注射：29G針頭穿刺入尾靜脈內(nèi)注射2%EB100μ1，循環(huán)2小時(shí)；（3)固定： 處死大鼠，摘取眼球，置于濃度為4 %多聚甲醛溶