神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)膠質(zhì)瘤是來源于神經(jīng)上皮的腫瘤，是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，約占全部顱內(nèi)腫瘤的40-50%，以發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、致死率高，成為腫瘤治療的難題。傳統(tǒng)治療方法主要是手術(shù)和放化療來提高患者的生存機(jī)率。但是位于重要功能區(qū)的膠質(zhì)瘤很難做到全切除。放射治療幾乎是各型膠質(zhì)瘤的常規(guī)治療，但療效評價不一，除髓母細(xì)胞瘤對放療高度敏感，室管膜瘤中度敏感外，其他類型對放療均不敏感?；熕幬锵抻谘X屏障及藥物的毒副作用，療效尚不肯定。近年來，免疫治療成為腦膠質(zhì)瘤繼手術(shù)、放化療后的有效治療手段。與其他方式聯(lián)合應(yīng)用，具體有很強(qiáng)的互補(bǔ)作用，對患者受損的免疫系統(tǒng)能夠起到恢復(fù)與重建的獨(dú)特療效，從而進(jìn)一步防止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中通過血清培養(yǎng)法對神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行增殖培養(yǎng)后裂解得到神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗原，由于該抗原只具備膠質(zhì)瘤干細(xì)胞攜帶的抗原信息，只能殺死神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的腫瘤樣干細(xì)胞和少量的腫瘤細(xì)胞，而由于血清培養(yǎng)液中存在一定的微生物污染，以及動物源免疫原性，因此通過血清培養(yǎng)法獲得的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞制備的抗原穩(wěn)定性較差，特異性較弱，因此通過該抗原所獲得的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療性疫苗具有穩(wěn)定性差、特異性較弱、殺瘤率不高以及免疫原性弱等缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)中神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗原所攜帶的抗原信息有限，通過該抗原所獲得的疫苗殺瘤率低、免疫原性較弱等缺陷，提供一種抗原信息較齊全的神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原及其制備方法。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原的制備方法，所述制備方法包括以下步驟:
[0006]獲取神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞，將兩者混合后進(jìn)行細(xì)胞裂解，即獲得神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原。
[0007]在本發(fā)明提供的神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原的制備方法中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞的個數(shù)比例為1:2-2:1。
[0008]在本發(fā)明提供的神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原的制備方法中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞的個數(shù)比例為1:1。
[0009]在本發(fā)明提供的神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原的制備方法中，采用反復(fù)凍融裂解法或X射線照射法進(jìn)行細(xì)胞裂解。
[0010]在本發(fā)明提供的神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原的制備方法中，采用反復(fù)凍融裂解法進(jìn)行細(xì)胞裂解的條件為:液氮或-80°C凍存和37°C水浴復(fù)融，反復(fù)凍融3次。[0011 ] 在本發(fā)明提供的神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原的制備方法中，在進(jìn)行細(xì)胞裂解之前，還包括采用無血清培養(yǎng)液對所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞進(jìn)行的增殖培養(yǎng)過程。
[0012]在本發(fā)明提供的神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原的制備方法中，所述無血清培養(yǎng)液為:含有成纖維細(xì)胞生長因子、表皮細(xì)胞生長因子和B27的培養(yǎng)液。
[0013]在本發(fā)明提供的神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原的制備方法中，取處于對數(shù)生長期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞在進(jìn)行細(xì)胞裂解。
[0014]在本發(fā)明提供的神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原的制備方法中，繼細(xì)胞裂解之后還包括離心步驟，離心條件為:l_4°C、5000rpm離心10_20min。
[0015]本發(fā)明還提供一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原，由上述神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原的制備方法所獲得。
[0016]本發(fā)明進(jìn)一步保護(hù)上述神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原在制備神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原疫苗中的應(yīng)用。
[0017]實(shí)施本發(fā)明提供的神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原及其制備方法，可以達(dá)到以下有益效果:采用神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞制備的神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原較現(xiàn)有神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗原攜帶的抗原信息較多較全，因此采用本發(fā)明提供的神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原所制備的疫苗，不僅能殺死神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，而且還能夠殺死神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞，殺瘤率較高，且免疫原性較強(qiáng)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明提供的一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原的制備方法，該方法包括以下步驟:
[0019]1、分別獲取神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
[0020]2、將步驟1中增殖后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞混合后進(jìn)行細(xì)胞裂解；
[0021]3、對步驟2中裂解后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞進(jìn)行離心，棄上清后，即收獲神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原。
[0022]具體地，步驟1中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞的獲取步驟為:
[0023](11)獲取神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤組織塊；
[0024](12)從步驟(11)中的神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤組織塊中獲取神經(jīng)膠質(zhì)瘤單細(xì)胞并進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
[0025](13)從步驟(12)中增殖后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤單細(xì)胞分離出神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞。
[0026]步驟(11)中，取新鮮的人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織，在本發(fā)明中，該神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織塊取自復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)外科11例膠質(zhì)瘤患者手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本，均經(jīng)術(shù)后病理確診。然后，將新鮮的人腦膠質(zhì)瘤組織用含有120mmol.L 'NaC1.Smmol.L 'KCl^Smmol.L 'Glucose (葡萄糖)和20mmol.L 'Pipes (哌嗪-1，4- 二乙磺酸)的緩沖液洗凈血污，剪切成1_3大小的膠質(zhì)瘤組織塊備用。
[0027]步驟(12)中，將步驟(11)中處理的神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤組織塊用DMEM培養(yǎng)液洗滌2-3次，加入5-10倍組織體積的0.2%膠原酶IV，在37°C孵箱中消化lOmin，1000r/min離心5min后重新懸浮細(xì)胞，用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后400目鋼網(wǎng)過濾，獲得單細(xì)胞懸液，將單細(xì)胞懸液移入離心管，1000r/min離心后棄上清。用無血清培養(yǎng)液重新懸浮離心后的細(xì)胞沉淀，優(yōu)選地，無血清培養(yǎng)液為含有20ng/yL bFGF(成纖維細(xì)胞生長因子)、20ng/μ L EGF(表皮細(xì)胞生長因子)以及20% B27的DMEM/F12培養(yǎng)液；計(jì)數(shù)后按3X 105個/cm2的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶，置5% C0 2孵化箱37°C孵育。待培養(yǎng)瓶長滿細(xì)胞后收集細(xì)胞，離心后加入0.2%膠原酶IV消化約5min，反復(fù)吹打，離心后棄上清，懸浮后重新接種，按1:2或1:3的比例傳代培養(yǎng)至120天，即可獲得處于對數(shù)生長期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤單細(xì)胞液。
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)采用血清培養(yǎng)法培養(yǎng)單細(xì)胞不同的是，在該步驟中，本發(fā)明采用無血清培養(yǎng)液對單細(xì)胞進(jìn)行增殖培養(yǎng)；由于血清培養(yǎng)液存在一定的微生物污染，以及動物源免疫原性且來源有限等，因此，本發(fā)明采用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)單細(xì)胞，不僅可避免血清培養(yǎng)法所帶來的不利因素，為單細(xì)胞提供一個較穩(wěn)定的培養(yǎng)條件，而且更加方便純化增殖后的單細(xì)胞，便于后續(xù)的加工處理，使最終獲得的神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原穩(wěn)定性和特異性更強(qiáng)。另夕卜，在該步驟中獲取處于對數(shù)生長期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤單細(xì)胞一方面是為了獲得足夠多的神經(jīng)膠質(zhì)瘤單細(xì)胞；另一方面，處于對數(shù)生長期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤單細(xì)胞性狀較穩(wěn)定，代謝比較旺盛，因此，獲得神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞所攜帶的抗原信息較多。
[0029]在步驟(13)中，取步驟(12)中獲得的神經(jīng)膠質(zhì)瘤單細(xì)胞液經(jīng)0.2%膠原酶IV消化、洗滌、離心后用PBS重新懸浮細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為IX 105個/ml，按試劑盒說明書進(jìn)行⑶133/1-PE標(biāo)記，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選出被標(biāo)記的細(xì)胞即神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，未被標(biāo)記的即神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞，分別收集神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞以待備用。本發(fā)明中的神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞是指除神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞以外的神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞。
[0030]以上僅為本發(fā)明提供的一種獲取神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞的方法，可以理解的是，通過其他方式獲得神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞的方法均適用于本發(fā)明。
[0031]步驟2中，按1:2-2:1的個數(shù)比分別取步驟1中對數(shù)生長期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞混合，用PBS沖洗，離心后棄上清，采用反復(fù)凍融裂解法或X射線照射法對細(xì)胞進(jìn)行裂解。
[0032]反復(fù)凍融裂解的條件為:液氮或_80°C凍存一周后，在37°C水浴中復(fù)融，反復(fù)凍融3次。由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起膨脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，失去活性。
[0033]X射線照射法的條件為:在X射線(6Gray)下輻射2_3分鐘。
[0034]經(jīng)測試，通過X射線照射法所獲得神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原的殺瘤率要明顯高于反復(fù)凍融裂解所獲得的神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫瘤抗原，因此，本發(fā)明中，優(yōu)先采用X射線照射法對細(xì)胞進(jìn)行裂解。
[0035]可以理解的是，細(xì)胞裂解的方式也并不局限于此，其他細(xì)胞裂解的方法同樣適用于本發(fā)明，如超聲破碎等。
[0036]步驟3中，對已裂解的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤非干細(xì)胞采用吸管進(jìn)行反復(fù)吹打，并在4°C下5000rpm低溫離心10_20min得到混合物，即神經(jīng)膠質(zhì)瘤全腫