T細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤過繼性免疫細(xì)胞治療技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種能夠特異擴(kuò)增的腫 瘤浸潤淋己細(xì)胞(Tumor Infiltrating Lympho巧te,TIL)中CD8+T細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤浸潤淋己細(xì)胞(TIL)最初是由Rosenberg等研究者從小鼠腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)和 分離的一類具有腫瘤抗原特異性細(xì)胞群，運(yùn)類群細(xì)胞WCD4+、CD8+T細(xì)胞為主，同時還包含少 量NK和NKT細(xì)胞。TIL細(xì)胞由其具有特異性腫瘤細(xì)胞殺傷功能而被應(yīng)用于抗腫瘤治療研究當(dāng) 中，行使殺傷功能的主要效應(yīng)細(xì)胞由CD8+T細(xì)胞組成。雖然TIL細(xì)胞治療技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入臨床 應(yīng)用，對鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、淋己癌、黑素癌等晚期癌癥有一定療效，但TIL細(xì)胞的大規(guī)模 擴(kuò)增難、抑制性Treg細(xì)胞比例較高等問題限制了其在臨床腫瘤治療上的廣泛應(yīng)用。因此，解 決W上技術(shù)限制是本專利發(fā)明主要目的。
[0003] 目前臨床應(yīng)用的TIL細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)通常是采用IL-2XD3單克隆抗體作為誘導(dǎo)劑活 化和擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞，為滿足臨床用量，常規(guī)技術(shù)加入高劑量的IL-2，但是高劑量IL-2會對 患者產(chǎn)生毒性作用，也可刺激TIL中CD4+CD25+Treg細(xì)胞增殖，從而抑制CD8+T細(xì)胞的增殖與 殺傷作用。PD-I是程序性死亡分子，與其配體PD-Ll結(jié)合后，可抑制淋己細(xì)胞功能。研究表 明，多數(shù)腫瘤浸潤C(jī)D8+T淋己細(xì)胞表面表達(dá)PD-I分子，其與腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)PD-Ll結(jié)合 后，可誘導(dǎo)活化CD8+T淋己細(xì)胞調(diào)亡，抑制其產(chǎn)生細(xì)胞因子和顆粒酶，進(jìn)而減弱CD8+T淋己細(xì) 胞對腫瘤的殺傷作用，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生免疫逃逸。另一方面PD-I和PD-Ll結(jié)合能夠誘導(dǎo) 化eg細(xì)胞分化，促進(jìn)其分泌IL-10、TGF-e等抑制性細(xì)胞因子而抑制免疫應(yīng)答。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有CD8+T細(xì)胞增殖與殺傷功能受抑制的問題，本發(fā)明提供一種有效的、 簡便的擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞的方法，采用癌性胸腹水來源提取TIL細(xì)胞，經(jīng)過體外多種細(xì)胞因子 刺激，獲得大量具有較強(qiáng)殺傷能力的TIL細(xì)胞，提高了CD8巧細(xì)胞增殖與殺傷作用，同時抑制 CDA+CDSS+heg細(xì)胞增殖，減弱其免疫抑制作用，提高TIL細(xì)胞抗腫瘤作用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0006] -種體外擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞的方法，包括從癌性胸腹水來源提取得到TIL細(xì)胞，向TIL 細(xì)胞培養(yǎng)液中添加細(xì)胞因子比-2、CD3McAb和抗PD-I單克隆抗體。
[0007] 作為優(yōu)選，所述的比-2濃度為300-1000U/ml，CD3McAb濃度為10-50ng/ml，抗PD-I 單克隆抗體50-200ng/ml。
[000引經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，利用抗PD-I單抗封閉活化的CD8+T細(xì)胞表面的PD-I分子，能有效抑制 PD-I和PD-Ll結(jié)合產(chǎn)生的免疫抑制信號，另外也可促進(jìn)CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增，加強(qiáng)細(xì)胞因子和顆 粒酶分泌，提高對腫瘤細(xì)胞殺傷能力。本發(fā)明將抗PD-I單抗添加至TIL細(xì)胞培養(yǎng)過程中，W 獲得擴(kuò)增倍數(shù)大、細(xì)胞殺傷效果強(qiáng)的TIL細(xì)胞。
[0009]更具體的，本發(fā)明關(guān)于一種體外擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞的方法，包括如下步驟：
[0010] (I)獲取腫瘤細(xì)胞和TIL細(xì)胞混合體：
[0011] 準(zhǔn)備無菌肝素抗凝的抗凝瓶，從患者體內(nèi)抽取胸腔積液或腹水，離屯、，棄上清液， 生理鹽水洗涂重懸。
[001^ (2)TIL細(xì)胞的分離：
[001引細(xì)胞貼壁培養(yǎng)：
[0014] 往步驟(1)獲得的重懸細(xì)胞中緩慢加入100%淋己分離液分離得到腫瘤細(xì)胞與TIL 細(xì)胞混合體，生理鹽水重懸細(xì)胞，離屯、收集細(xì)胞;收集得到的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液稀釋至細(xì) 胞濃度為5 X 105-2 X lOVml，放置37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24小時后取出，將所得的TIL懸 浮細(xì)胞移至另一培養(yǎng)瓶;或采用
[0015] 非連續(xù)密度梯度培養(yǎng)：
[0016] 對步驟（1)獲得的重懸細(xì)胞采用非連續(xù)密度梯度離屯、法進(jìn)行離屯、，從下往上依次 加入100%淋己細(xì)胞分離液、75%淋己細(xì)胞分離液、去除上清液的胸腹水，經(jīng)離屯、后，吸取 100 %淋己細(xì)胞分離液界面TIL細(xì)胞，離屯、，棄上清，生理鹽水洗涂重懸。
[0017] (3)TIL細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)：
[001引用無血清培養(yǎng)液稀釋步驟(2)所得的TIL細(xì)胞密度為5 X 105-2 X lOVml，向培養(yǎng)液 中添加細(xì)胞因子抗PD-I單體，第2天加入細(xì)胞因子IL-2和CD3單抗，之后每隔2-3d加入含有 細(xì)胞因子IL-2的無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)14-21天收集細(xì)胞。
[0019] 作為優(yōu)選，所述步驟(2)細(xì)胞貼壁培養(yǎng)中稀釋至細(xì)胞濃度為2Xl〇6/ml。
[0020] 作為優(yōu)選所述步驟(3)中TIL細(xì)胞密度為2 X 106/ml。
[0021] 作為優(yōu)選所述步驟(3)所述的無血清培養(yǎng)液為含有80U硫酸慶大霉素的X-VIV015。
[0022] 作為優(yōu)選所述步驟(3)中抗PD-I單體的濃度為50-200ng/ml，化-2的濃度為300-1000U/ml，CD3McAb 的濃度為 lO-lOOng/ml。
[0023] 作為優(yōu)選所述步驟(3)中抗PD-I單體的濃度為50ng/ml，化-2的濃度為500U/ml， CD3McAb 的濃度為 30ng/ml。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用的細(xì)胞因子組合能夠提高TIL細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，有效抑 制化eg細(xì)胞對CD8巧細(xì)胞的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)抗腫瘤效應(yīng)。
[0025] 具體實(shí)施方法
[0026] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方法進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0027] 實(shí)施例1(實(shí)驗(yàn)組）：
[002引（1)獲取腫瘤細(xì)胞和TIL細(xì)胞混合體：
[0029] 將患者體內(nèi)抽取500ml胸腹水注射到含有肝素鋼的抗凝瓶中，輕輕搖晃使其混勻， 將其平均分到離屯、管中，200化/min離屯、IOmin，離屯、結(jié)束后，棄上清液，用生理鹽水洗涂2 次。
[0030] (2)分離 TIL 細(xì)胞：
[0031 ] 貼壁法:取步驟(1)獲得的細(xì)胞15ml加入等體積生理鹽水至30ml (運(yùn)樣才對吧），充 分混勻，將100%淋己細(xì)胞分離液15ml加入至離屯、管中，淋己分離液與細(xì)胞懸液的體積比為 1:2，沿管壁緩慢將30ml細(xì)胞懸液疊加至淋己分離液上，20(K)r/min離屯、20min，離屯、后收集 白膜層，即為腫瘤細(xì)胞和TIL細(xì)胞混合體，150化/min離屯、5min，生理鹽水洗涂1次后，用生理 鹽水重懸至50ml，取樣計(jì)數(shù)，進(jìn)行第2次洗涂，150化/min離屯、5min，棄上清液。將上述分離后 的細(xì)胞用X-VIVOl5培養(yǎng)液稀釋至細(xì)胞濃度為I X lOVml，放置37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 小時后取出，將懸浮細(xì)胞（即為TIL細(xì)胞)移至另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞，棄 去;或義用
[0032] 非連續(xù)密度梯度培養(yǎng):將步驟（1)獲得的細(xì)胞用生理鹽水重懸至20ml，充分混勻， 從下往上依次緩慢加入15ml 100%淋己細(xì)胞分離液、15ml 75%淋己細(xì)胞分離液、20ml上述 細(xì)胞懸液，2000r/min離屯、20min，吸取100%淋己細(xì)胞分離液界面1'化細(xì)胞，150化/111111離屯、 Smin，棄上清，生理鹽水洗涂1次后，用生理鹽水重懸至50ml，取樣計(jì)數(shù)，進(jìn)行第2次洗涂， 15(K)r/min離屯、5min，棄上清液。（3)TIL細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)：
[0033] W上巧巾分離方法均能很好的分離TIL細(xì)胞，將(2)分離后的TIL細(xì)胞用X-VIV015培 養(yǎng)液稀釋至細(xì)胞濃度為0.5~lX10シml，并向其加入100ng/ml抗PD-l單體，放置37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天加入300~lOOOU/ml比-2和30~lOOng/ml CD3McAb，之后每隔2-3天 根據(jù)細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)，添加適量的含有濃度為500U/ml化-2的X-VIVOl5培養(yǎng)液擴(kuò)增培養(yǎng)， 培養(yǎng)至14-21天收集細(xì)胞。
[0034] 對上述的獲得的TIL細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)：
[0035] 培養(yǎng)至第7-8天和回輸前48小時，按照《中國藥典》取樣進(jìn)行細(xì)菌、真菌、支原體、內(nèi) 毒素檢測，回輸當(dāng)天取樣進(jìn)行臺吩藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性，活細(xì)胞應(yīng)在80% W上，同時進(jìn)行革 蘭氏染色，細(xì)菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素、革蘭氏染色結(jié)果均為陰性，收集細(xì)胞回輸。
[0036] 實(shí)施例2:未添加抗PD-I單抗(對照組）
[0037] 除了（3)細(xì)胞擴(kuò)增中，未添加抗PD-I單抗，其他具體操作步驟如實(shí)施例1。
[0038] 對實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)組和實(shí)施例2的對照組所得的TIL細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增倍數(shù)檢測
[0039] 在第1、7、14、21天取20化1細(xì)胞，吹打成單個細(xì)胞，利用Counterstar自動血細(xì)胞計(jì) 數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)=當(dāng)天計(jì)數(shù)的細(xì)胞總數(shù)/第1天培養(yǎng)前的細(xì)胞總數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如表1。
[0040] 表1 TIL細(xì)胞在不同時間細(xì)胞數(shù)量的變化（XioVL)
[0041]

[0042] 對實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)組和實(shí)施例2的對照組所得的TIL細(xì)胞進(jìn)行Treg表型檢測
[0043] 在第1、7、14、21天收集2 XioVml細(xì)胞于流式管內(nèi)，加入相應(yīng)抗體避光混勻放置 20min，用PBS洗涂2次，15(K)rpm離屯、5min，加入50化IPBS重懸等待上機(jī)測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 2。

[0044] 擊9 TTT會田0^太同口皆甘日1^~^"^。"會田0^^^/捕1白句亦/心、
[0045]
[0046] 對實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)組和實(shí)施例2的對照組所得的TIL細(xì)胞對K562細(xì)胞殺傷能力檢測
[0047] 取對數(shù)生長期K562細(xì)胞系，用PBS緩沖液將祀細(xì)胞濃度調(diào)整為1 X lOVml，按照1: 20效祀比，調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞(TIL細(xì)胞)5 X lOVml、1 X lOVml、2 X lOVml，實(shí)驗(yàn)組:效應(yīng)細(xì)胞和 祀細(xì)胞各加入50iil，效應(yīng)組：效應(yīng)細(xì)胞和RPMI1640培養(yǎng)液各加入SOiil，祀細(xì)胞組:祀細(xì)胞和 RPMI1640培養(yǎng)液各加入SOiil，使每孔終體積為10化1，每組設(shè)3個平行組，放于37°C，5 %C〇2 培養(yǎng)箱解育16-1化，每孔加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔加入I(K)山DMSO，等紫色結(jié)晶完全溶 解后，酶標(biāo)儀(波長570nm)測定OD值。計(jì)算公式:殺傷率=[1-(效祀混合組OD值一祀細(xì)胞組 OD值)/效應(yīng)組OD值]X 100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。
[004引表3 TIL細(xì)胞對K562細(xì)胞毒性比較（％)
[0049]


【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種體外擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞的方法，其特征在于包括從癌性胸腹水來源提取得到TIL細(xì) 胞，向TIL細(xì)胞培養(yǎng)液中添加包括細(xì)胞因子IL-2、⑶3McAb和抗Η)-1單克隆抗體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞的方法，其特征在于所述的IL-2濃度 為300-1000U/ml，CD3McAb濃度為 10-50ng/ml，抗PD-1 單克隆抗體50-200ng/ml。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞的方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 獲取腫瘤細(xì)胞和TIL細(xì)胞混合體： 準(zhǔn)備無菌肝素抗凝的抗凝瓶，從患者體內(nèi)抽取胸腔積液或腹水，離心，棄上清液，生理 鹽水洗滌重懸。 (2) TIL細(xì)胞的分離： 細(xì)胞貼壁培養(yǎng)： 往步驟(1)獲得的重懸細(xì)胞中緩慢加入100%淋巴分離液分離得到腫瘤細(xì)胞與TIL細(xì)胞 混合體，生理鹽水重懸細(xì)胞，離心收集細(xì)胞;收集得到的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液稀釋至細(xì)胞濃 度為5 X 105-2 X 106/ml，放置37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24小時后取出，將所得的TIL懸浮細(xì) 胞移至另一培養(yǎng)瓶;或采用 非連續(xù)密度梯度培養(yǎng)： 對步驟（1)獲得的重懸細(xì)胞采用非連續(xù)密度梯度離心法進(jìn)行離心，從下往上依次加入 100 %淋巴細(xì)胞分離液、75 %淋巴細(xì)胞分離液、去除上清液的胸腹水，經(jīng)離心后，吸取100 % 淋巴細(xì)胞分離液界面TIL細(xì)胞，離心，棄上清，生理鹽水洗滌重懸。 (3) TIL細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)： 用無血清培養(yǎng)液稀釋步驟(2)所得的TIL細(xì)胞密度為5 X 105-2 X 106/ml，向培養(yǎng)液中添 加細(xì)胞因子抗PD-1單體，第2天加入細(xì)胞因子IL-2和CD3單抗，之后每隔2-3d加入含有細(xì)胞 因子IL-2的無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)14-21天收集細(xì)胞。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種體外擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟(2)細(xì)胞 貼壁培養(yǎng)中稀釋至細(xì)胞濃度為2 X 106/ml。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種體外擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟⑶中 TIL細(xì)胞密度為2X106/ml。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種體外擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟⑶所述 的無血清培養(yǎng)液為含有80U硫酸慶大霉素的X-VIV015。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種體外擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟(3)中抗 PD-1 單體的濃度為50-200ng/ml，IL-2的濃度為300-1000U/ml，CD3McAb的濃度為 10-100ng/ ml〇8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種體外擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟(3)中抗 TO-1單體的濃度為50ng/ml，IL-2的濃度為500U/ml，CD3McAb的濃度為30ng/ml。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種體外擴(kuò)增CD8+T細(xì)胞的方法，包括從癌性胸腹水來源提取得到TIL細(xì)胞，向TIL細(xì)胞培養(yǎng)液中添加細(xì)胞因子IL?2、CD3McAb和抗PD?1單克隆抗體，所述的IL?2濃度為300?1000U/ml，CD3McAb濃度為10?50ng/ml，抗PD?1單克隆抗體50?200ng/ml。該方法采用的細(xì)胞因子組合能夠提高TIL細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，有效抑制Treg細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)抗腫瘤效應(yīng)。
【IPC分類】C12N5/0783
【公開號】CN105713878
【申請?zhí)枴緾N201610203410
【發(fā)明人】吳曉星, 楊軍, 劉廣平
【申請人】杭州特馬賽生物技術(shù)有限公司