絲蛋白支架材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種絲蛋白支架材料及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]各種創(chuàng)傷、疾病等引起的組織器官的缺損、病變等是影響人類健康的一大問題。目前，臨床上常采用器官移植的方法對(duì)組織器官的缺損進(jìn)行治療。組織、器官移植中供體不足、組織和器官的缺損修復(fù)和功能重建等問題，已成為生命科學(xué)領(lǐng)域研宄亟需解決的問題。組織工程基本原理是利用三維支架材料模擬體內(nèi)生理環(huán)境，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后將細(xì)胞-支架材料復(fù)合物植入體內(nèi)替代病變的組織器官，以達(dá)到創(chuàng)傷修復(fù)和功能重建的目的。
[0003]而構(gòu)建具有修復(fù)大組織和復(fù)雜器官的功能性生物材料是急需解決的問題。大組織、復(fù)雜器官不像簡(jiǎn)單的薄層組織可以通過小分子擴(kuò)散獲得營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，它們需要通過龐大的血管系統(tǒng)才能獲得營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。微血管系統(tǒng)是由單層內(nèi)皮細(xì)胞組成，營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣可通過內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)散到組織中。修復(fù)損傷的大組織和復(fù)雜器官的生物材料必須具有促血管形成的能力才能使大組織和復(fù)雜器官具有生物功能。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)的解決方案主要有兩種:一種方法是以材料為基礎(chǔ)的，現(xiàn)已開發(fā)應(yīng)用的作為組織工程支架的生物醫(yī)用材料主要分為兩大類:合成生物材料與天然生物材料。硅橡膠、聚氨酯等合成材料在生物相容性、理化性能、降解速率的控制及緩釋性等方面尚有許多不足，部分降解產(chǎn)物有一定的毒性，不利于細(xì)胞黏附和識(shí)別，作為組織工程支架材料推廣使用仍有諸多關(guān)鍵問題需要繼續(xù)解決。而天然生物材料的機(jī)械性能不易控制，但其生物相容性優(yōu)異，種類繁多，來源廣泛，在組織的再生修復(fù)領(lǐng)域逐漸獲得越來越廣泛的應(yīng)用。另一種方法是以細(xì)胞為基礎(chǔ)的，體外構(gòu)建支架再接種上內(nèi)皮細(xì)胞，體外培養(yǎng)再移植入體內(nèi)前誘導(dǎo)血管化，但這種方法需要生長(zhǎng)因子或黏著蛋白或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白或細(xì)胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，過程繁瑣，花費(fèi)較高，不能量化。
[0005]蠶絲中富含的絲蛋白以其特殊的生物學(xué)特性和良好的人體親和性越來越受到人們的關(guān)注。絲蛋白的構(gòu)象主要分為:無規(guī)結(jié)構(gòu)、α -螺旋和β-折疊。而現(xiàn)有技術(shù)中鹽析法和甲醇等有機(jī)溶劑誘導(dǎo)制備的絲蛋白多孔支架存在硬度高，結(jié)晶度高，多孔支架孔壁表面結(jié)構(gòu)無法調(diào)控的問題，不適用于內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及血管形成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種絲蛋白支架材料的制備方法，本發(fā)明提供的絲蛋白支架材料的制備方法制備得到的絲蛋白支架材料生物降解性好、孔隙率高、可以起到促進(jìn)血管生成的作用。
[0007]本發(fā)明提供了一種絲蛋白支架材料的制備方法，包括:
[0008]Α)將絲蛋白溶液濃縮，得到濃縮后溶液，所述濃縮后溶液中絲蛋白的質(zhì)量濃度為15%?35% ；
[0009]B)將步驟A)得到的濃縮后溶液稀釋、熱處理得到水凝膠，所述水凝膠中絲蛋白的質(zhì)量濃度為0.2%?0.6% ；
[0010]C)將步驟A)得到的濃縮后溶液和步驟B)得到的水凝膠混合，得到混合液；調(diào)節(jié)混合液pH值、攪拌、冷凍、干燥、得到支架材料；所述pH值為3?4。
[0011]優(yōu)選的，所述步驟A)濃縮溫度為O?90°C。
[0012]優(yōu)選的，所述步驟A)濃縮時(shí)間為I?168h。
[0013]優(yōu)選的，所述步驟B)熱處理溫度為50°C?70°C。
[0014]優(yōu)選的，所述步驟C)混合液中絲蛋白的質(zhì)量濃度為I %?4%。
[0015]優(yōu)選的，所述步驟C)調(diào)節(jié)pH值為用酸調(diào)節(jié)pH值，所述酸選自鹽酸、和甲酸中的一種。
[0016]優(yōu)選的，所述步驟C)攪拌時(shí)間為I?lOmin。
[0017]優(yōu)選的，所述步驟C)冷凍溫度為_10°C?_80°C，冷凍時(shí)間為I?48h，真空干燥時(shí)間為I?96h。
[0018]優(yōu)選的，所述步驟C)后還包括將得到的支架材料浸泡、冷凍、干燥得到干態(tài)絲蛋白支架材料。
[0019]本發(fā)明提供了一種絲蛋白支架材料，由上述權(quán)利要求任意一項(xiàng)所述的制備方法制備得到。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種絲蛋白支架材料的制備方法，包括:
[0021]A)將絲蛋白溶液濃縮，得到濃縮后溶液，所述濃縮后溶液中絲蛋白的質(zhì)量濃度為15%?35% ;B)將步驟A)得到的濃縮后溶液稀釋、熱處理得到水凝膠，所述水凝膠中絲蛋白的質(zhì)量濃度為0.2%?0.6% ;C)將步驟A)得到的濃縮后溶液和步驟B)得到的水凝膠混合，得到混合液；調(diào)節(jié)混合液PH值、攪拌、冷凍、干燥、得到支架材料；所述pH值為3?4。本發(fā)明通過特定質(zhì)量濃度的絲蛋白濃縮后的溶液和特定質(zhì)量濃度的水凝膠混合，利用絲蛋白的自組裝行為改變絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使得本發(fā)明孔隙率高；本發(fā)明選用絲蛋白溶液，生物降解性好；并且本發(fā)明通過調(diào)節(jié)pH值，改變絲蛋白分子帶電荷情況，破壞疏水作用力，使得本發(fā)明制備得到的絲蛋白支架材料力學(xué)性能低，結(jié)晶度低，更適合血管的生成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，
【附圖說明】
[0022]圖1中(a)和(b)為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的支架材料進(jìn)行掃描電鏡圖；(c)為本發(fā)明比較例I制備得到的支架材料進(jìn)行掃描電鏡圖；(d)為本發(fā)明比較例2制備得到的支架材料進(jìn)行掃描電鏡圖；
[0023]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1和比較例制備得到的支架材料的紅外測(cè)試圖；
[0024]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1和比較例制備得到的支架材料的X-射線衍射檢測(cè)圖；
[0025]圖4為本實(shí)施例和比較例制備得到的支架進(jìn)行壓縮性能測(cè)定圖；
[0026]圖5為本實(shí)施例和比較例制備得到的支架進(jìn)行酶降解處理測(cè)定圖；
[0027]圖6中a為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的支架材料動(dòng)物皮下埋置第28天時(shí)的HE染色切片圖山為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的支架材料動(dòng)物皮下埋置第28天時(shí)CD34免疫組化切片圖；
[0028]圖7為本發(fā)明實(shí)施例3所述所得絲蛋白支架的電鏡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]本發(fā)明提供了一種絲蛋白支架材料的制備方法，包括:
[0030]A)將絲蛋白溶液濃縮，得到濃縮后溶液，所述濃縮后溶液中絲蛋白的質(zhì)量濃度為15%?35% ；
[0031]B)將步驟A)得到的濃縮后溶液稀釋、熱處理得到水凝膠，所述水凝膠中絲蛋白的質(zhì)量濃度為0.2%?0.6% ；
[0032]C)將步驟A)得到的濃縮后溶液和步驟B)得到的水凝膠混合，得到混合液；調(diào)節(jié)混合液pH值、攪拌、冷凍、干燥、得到支架材料；所述pH值為3?4。
[0033]本發(fā)明所述絲蛋白溶液為常規(guī)方法制備得到的絲蛋白溶液，優(yōu)選的，所述制備方法具體為:
[0034]a)將蠶絲在碳酸鈉溶液中加熱脫膠、水洗、烘干得到脫膠蠶絲；
[0035]b)將所述脫膠蠶絲溶解于溶劑中熱處理、透析得到絲蛋白溶液。
[0036]所述碳酸鈉溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.2 %?0.5 % ;所述步驟a)加熱溫度為90?110°C，所述加熱時(shí)間為30?60min。
[0037]所述步驟a)水洗優(yōu)選為去離子水洗，所述水洗的次數(shù)優(yōu)選為2?5次，更優(yōu)選為3次；所述烘干的溫度優(yōu)選為50?100°C，更優(yōu)選為60?90°C ；
[0038]所述步驟b)溶劑選自由乙醇、氯化鈣和水以摩爾比2:1:8的比例混合構(gòu)成的三元溶液或溴化鋰溶液中的一種；所述溶劑的質(zhì)量濃度優(yōu)選為9.3?9.5mol/L ;所述步驟b)熱處理溫度為60?70°C，熱處理時(shí)間為4?8h ;所述透析袋的截留分子量?jī)?yōu)選為3000?12000 ;更優(yōu)選為3500?10000 ;所述透析的時(shí)間優(yōu)選為3d?4d ;所述透析時(shí)可以換水，所述換水的間隔優(yōu)選為I?3h ;更優(yōu)選為2h。最終得到的絲蛋白溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為5%?10%，更優(yōu)選為6%?8%。
[0039]本發(fā)明首先將上述絲蛋白溶液濃縮，得到濃縮后溶液，所述濃縮后溶液中絲蛋白的質(zhì)量濃度為15%?35%。本發(fā)明對(duì)于所述濃縮方式不進(jìn)行限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的濃縮方式即可。所述濃縮后中絲蛋白的質(zhì)量濃度優(yōu)選為20%?30%;所述濃縮溫度優(yōu)選為O?90°C，更優(yōu)選為30?80°C，最優(yōu)選為40?70°C，最最優(yōu)選為50?60°C ;所述濃縮時(shí)間優(yōu)選為I?168h，更優(yōu)選為40?150h，最優(yōu)選為48h?130h ;最最優(yōu)選為48h?120h.
[0040]將步驟A得到的濃縮后溶液稀釋、熱處理得到水凝膠，所述水凝膠中絲蛋白的質(zhì)量濃度為0.2%?0.6%。本發(fā)明對(duì)于所述稀釋方式不進(jìn)行限定，加水稀釋即可；稀釋后熱處理得到水凝膠，所述熱處理的溫度優(yōu)選為50°C?70°C，更優(yōu)選為60V?70°C ;所述熱處理時(shí)間優(yōu)選為24?48h ;所述稀釋后質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.3%?0.5%。