一種異種角膜移植物的無菌加工制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種異種角膜移植物的無菌加工制備方法。該異種角膜移植物可替代異體角膜進(jìn)行角膜移植。
【背景技術(shù)】
[0002]角膜(Cornea)是眼睛最前面的透明部分，覆蓋虹膜、瞳孔及前房，并為眼睛提供大部分屈光力。加上晶體的屈光力，光線便可準(zhǔn)確地聚焦在視網(wǎng)膜上構(gòu)成影像。據(jù)WHO報(bào)告，因外傷、化學(xué)燒傷、腫瘤、嚴(yán)重干眼癥、感染等原因引起的角膜病已成為第二大致盲性眼病，全球每年新增150萬~200萬角膜盲患者。目前，唯一有效的治療方法是異體角膜移植。然而供體來源極度缺乏，全球每年只有12萬例患者能夠接受異體角膜移植治療，我國每年人捐獻(xiàn)角膜每年僅3000例。由于捐獻(xiàn)角膜的嚴(yán)重缺乏，又沒有替代產(chǎn)品，致使角膜病人的醫(yī)治問題長期無法解決。
[0003]為了解決角膜供體不足的問題，人們嘗試采用人工合成的方法來構(gòu)建人工角膜，但是目前人工構(gòu)建的角膜還無法達(dá)到天然角膜精密復(fù)雜的超微結(jié)構(gòu)，不能實(shí)現(xiàn)與宿主植床的完美融合，或難以實(shí)現(xiàn)上皮化，移植后的外觀和宿主的舒適度與自然角膜差異大。
[0004]在利用生物材料進(jìn)行人工角膜構(gòu)建研宄的同時，隨著脫細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展以及脫細(xì)胞組織在臨床上的廣泛應(yīng)用，人們逐漸聚焦于異種角膜移植物的研發(fā)。人們所采用的脫細(xì)胞方法主要有酶消化法(胰酶、DNA酶和RNA酶等)、反復(fù)凍融法、表面活性劑法(TritonX-100、SDS等)和螯合劑法(EDTA)等，但是這些方法都會在一定程度上破壞角膜基質(zhì)中膠原纖維結(jié)構(gòu)和損失糖胺聚糖成分，使角膜組織特性喪失，透明度、力學(xué)強(qiáng)度和屈光性能降低，植入體內(nèi)后還沒愈合就提前降解掉。并且脫細(xì)胞試劑都具有一定的毒性，難以洗脫并伴有毒性風(fēng)險。
[0005]異種角膜移植還需要面對的問題是病毒傳染的風(fēng)險。目前的異種角膜制備方法中人們往往忽略了這一問題。有專利(申請公開號CN201310527550.4)提出采用γ射線輻照進(jìn)行病毒滅活，輻照劑量高達(dá)25KGy。單一的物理病毒滅活方法不符合我國動物源植入性醫(yī)療器械相關(guān)法規(guī)要求，并且如此高的輻照劑量必然會引起角膜基質(zhì)中膠原纖維結(jié)構(gòu)的破壞和膠原、糖胺聚糖等生物大分子的變性，對角膜基質(zhì)的透明度、力學(xué)強(qiáng)度和降解性能的影響依舊不可避免。
[0006]綜上所述，目前還沒有一種理想的異種角膜制備方法:既可以達(dá)到脫細(xì)胞去抗原和病毒滅活目的，又可以最大程度地保留天然角膜的組織結(jié)構(gòu)和組成特性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種異種角膜移植物的無菌加工制備方法。通過本發(fā)明無菌加工技術(shù)，保留了天然角膜的組織結(jié)構(gòu)和組成特性，透明度好、力學(xué)強(qiáng)度高，降解與角膜再生速度相匹配，病毒滅活徹底，生物相容性和生物安全性高，結(jié)構(gòu)和性能長期保持穩(wěn)定，可替代異體角膜進(jìn)行角膜移植。
[0008]優(yōu)選地，異種角膜可采用豬、馬、驢、猴、貓和鴕鳥等非傳染性海綿狀腦病(TSE)易感動物中的一種。
[0009]本發(fā)明提出的異種角膜移植物的無菌加工制備方法，采用眼球整體處理，包括兩步病毒滅活紫外線照射和次氯酸鈉溶液浸泡、去上皮層、兩步脫細(xì)胞血清浸泡和滲透壓法、削切脫水和甘油溶液保存步驟。具體如下:
步驟一、紫外線病毒照射
將無菌的動物眼球眼表部分朝上，置于短波紫外線(200-280nm)下照射。紫外線波長優(yōu)選254nm，照射時間為l_8h，照射強(qiáng)度為0.03-0.5J/cm2，優(yōu)選0.1-0.3J/cm2。
[0010]紫外線照射是血液制品中常用的病毒滅活方法，能夠滅活各種有包膜病毒和無包膜病毒，主要是利用紫外線的能量破壞病毒中DNA或RNA分子鏈，從而使病毒失去復(fù)制能力，從而達(dá)到病毒滅活目的。紫外線輻照對蛋白分子影響非常小，并且也能起到殺菌和交聯(lián)效果。眼球整體進(jìn)行照射，能最大程度保持角膜中生物大分子的結(jié)構(gòu)完整性，提高穩(wěn)定性。
[0011]步驟二、次氯酸鈉溶液浸泡
將紫外線照射后的眼球再次用濃度為0.l-lg/Ι的次氯酸鈉溶液進(jìn)行浸泡病毒滅活，浸泡時間為10-60min，溶液用量為眼球重量的5_20倍(v/m)。然后用10-100倍量清洗液(v/m)進(jìn)行振蕩清洗3-10遍，每遍10-60min，去除殘留次氯酸鈉。
[0012]優(yōu)選地，所述清洗液可采用純化水、注射用水、生理鹽水或磷酸鹽緩沖液(PBS，ρΗ7.4左右)中的一種。
[0013]根據(jù)我國動物源植入性醫(yī)療器械相關(guān)法規(guī)要求，為了將病毒風(fēng)險降到最低，進(jìn)行病毒滅活時必須采用至少兩種不同性質(zhì)的方法，即至少一種物理方法和一種化學(xué)方法。因此，本發(fā)明在紫外線病毒滅活后，再采用化學(xué)試劑進(jìn)行進(jìn)一步病毒滅活，可以將病毒風(fēng)險降到最低。
[0014]步驟二、去上皮層
經(jīng)過振蕩清洗后的眼球表面已經(jīng)充分溶脹，然后用滅菌濾紙輕輕搓去上皮層，暴露出前彈力層。
[0015]步驟四、脫細(xì)胞
經(jīng)過步驟二化學(xué)病毒滅活和振蕩溶脹處理后，角膜中的大部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)都得到破壞，但細(xì)胞碎片還殘存在細(xì)胞外基質(zhì)中，為此可通過血清浸泡和滲透壓清洗將細(xì)胞碎片洗脫出來，達(dá)到徹底脫細(xì)胞效果。
[0016]將去上皮的眼球先浸泡于5-20倍量(v/m)經(jīng)過常規(guī)納濾膜病毒滅活處理的動物自體血清或人血清中，于20-38°C條件下浸泡2-24h。
[0017]然后將眼球移入5-50倍量(v/m)濃度為1-5M、溫度為2_25°C的高滲鹽溶液中，50-250rpm下振蕩處理l_24h。完成一次高滲鹽振蕩處理后，再采用相同的條件進(jìn)行低滲振蕩清洗。如此重復(fù)高滲-低滲振蕩清洗處理5-20遍。本步驟中所述溶液均需經(jīng)過0.22 μ m濾膜過濾，最大程度降低處理過程中的微生物污染風(fēng)險。
[0018]所述高滲鹽溶液可采用氯化鈉、氯化鉀或混合物溶液中的一種。
[0019]所述低滲溶液可采用純化水、注射用水、生理鹽水或磷酸鹽緩沖液等中的一種。
[0020]動物血清中還有可以消解細(xì)胞和細(xì)胞碎片的酶，通過浸泡處理可以將之前步驟未能破碎的細(xì)胞進(jìn)一步破碎，并破壞細(xì)胞碎片與角膜基質(zhì)間的物理結(jié)合力，使得細(xì)胞碎片被消解或更容易洗脫出來。所采用的高滲-低滲循環(huán)振蕩處理，可以使角膜基質(zhì)中的細(xì)胞碎片在處理過程中得到進(jìn)一步的破碎、釋放和溶出。采用高滲-低滲處理可以最大程度地保護(hù)角膜基質(zhì)的纖維結(jié)構(gòu)，避免糖胺聚糖等重要功能蛋白的損失。
[0021]步驟五、削切脫水
在百級潔凈環(huán)境下，嚴(yán)格按照無菌操作要求，用滅菌后眼科剪從經(jīng)過步驟四處理后的眼球上分離下來，獲得還處于溶脹狀態(tài)的全層角膜基質(zhì)，然后用角膜削切器削去后彈力層和部分基質(zhì)層，再用環(huán)鉆進(jìn)行圓形修整，面積為60-100mm2。
[0022]削切修整后的角膜基質(zhì)，采用甘油溶液進(jìn)行振蕩脫水處理，甘油溶液的濃度為60-100% (v/v)，優(yōu)選75-100%，再優(yōu)選85-95% ;用量為角膜基質(zhì)重量的100-500倍量(v/m);脫水時間為30-120min，優(yōu)選45_60min。經(jīng)過脫水后的角膜基質(zhì)厚度為100-500 μm。
[0023]步驟六、甘油溶液保存
在百級潔凈環(huán)境下，嚴(yán)格按照無菌操作要求，將角膜基質(zhì)轉(zhuǎn)移至裝有濃度90-100% (v/V)的無菌甘油保存液的西林瓶中，乳蓋密封，獲得異種角膜移植物。
[0024]所述甘油保存液滅菌方法可采用蒸汽滅菌或?yàn)V膜過濾除菌中的一種。
[0025]甘油具有良好的抑菌功能和脫水作用，角膜基質(zhì)保存其中，不但能夠長期保持無菌狀態(tài)，而且能夠保持結(jié)構(gòu)和性能的長期穩(wěn)定，使得產(chǎn)品具有足夠長的貨架壽命。
[0026]經(jīng)過嚴(yán)格的無菌生產(chǎn)控制，可以免去終端滅菌工藝，避免了終端滅菌處理對角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)造成的不可逆的破壞，最大程度的保持了結(jié)構(gòu)和性能的完整性；采用滅菌處理后的甘油保存液進(jìn)行保存，避免了晾干、冷凍干燥等干燥工藝對角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)和透明度的影響，縮短了生產(chǎn)時間，降低了生產(chǎn)成本，而且甘油可以抑制細(xì)菌的生長，還有助于角膜基質(zhì)保持結(jié)構(gòu)和性能的穩(wěn)定性，有利于角膜基質(zhì)在常溫條件下長時間的保存和運(yùn)輸。
[0027]與現(xiàn)有其他技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明提供了一種異種角膜移植的無菌加工生產(chǎn)方法，可以免去終端滅菌工藝，最大程度地保持了角膜基質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)和性能，具有良好的透明度(見圖1)和力學(xué)強(qiáng)度(見圖2)；
2、本發(fā)明提供了兩種性質(zhì)病毒滅活方式相結(jié)合進(jìn)行病毒滅活的方法——紫外線照射和極低濃度的次氯酸鈉浸泡相結(jié)合，不但可以將病毒風(fēng)險降到最低，而且與傳統(tǒng)的γ射線輻照、強(qiáng)酸強(qiáng)堿和表面活性劑浸泡相比，對角膜基質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響最??；
3、本發(fā)明提供了在病毒滅活基礎(chǔ)上進(jìn)行整個眼球柔和脫細(xì)胞的方法，采用血清浸泡和高滲-低滲循環(huán)處理可以有效脫除細(xì)胞及殘留碎片(見圖3)，不會引入酸堿、表面活性劑、交聯(lián)劑、EDTA等有毒試劑殘留風(fēng)險，具有更高的安全性和良好的生物相容性(見圖4);
4、本發(fā)明提供了一種異種角膜移植物簡便可行的長期保存方法，不需要進(jìn)行晾干、冷凍干燥等干燥處理，不僅避免干燥工藝對角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)和透明度的影響，而且縮短了生產(chǎn)時間和降低了生產(chǎn)成本，適合產(chǎn)業(yè)化，還能夠保持角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)與性能的長期穩(wěn)定性，使得產(chǎn)品具有足夠長的貨架壽命。
[0028]
【附圖說明】
[0029]附圖1為本發(fā)明異種角膜移植物和新鮮角膜的透光率檢測結(jié)果，表明本發(fā)明異種角膜移植物的與新鮮角膜的透明度無顯著性差異。
[0030]附圖2為本發(fā)明異種角膜移