專利名稱：異種脫蛋白骨支架材料及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及骨支架材料，特別是涉及用于修復各種原因引起的骨缺損的組織工程骨支架材料及其制備方法。
背景技術：
隨著組織工程領域骨缺損修復研究地進展，骨支架材料成為限制組織工程骨能否真正應用于臨床的一個關鍵因素。目前，對骨組織工程中支架材料的選擇尚有分歧(Boyan Bo，Lonmann CH，Romeo J，Schwartz Z，Bone and cartilagetissue engineering，Clin Plast Surg，1999，26(4)629-645.)，應用于骨組織工程的支架材料種類繁多，國內外學者作了許多有益的嘗試(Burg KJ，Porter S，Kellam JF.Biomaterials developments for bone tissue engineering.Biomaterials，2000，21(23)2347-2359.Karabuda C，Ozdemir O，Tosun T，et al.Histological andclinical evaluation of 3 different grafting materials for sinus lifting procedure basedon 8 cases.J Periodontol，2001，72(10)1436-1442.)。理想的骨組織工程支架材料應具備良好的生物相容性、可降解性、合理的三維立體孔隙一網架結構、可塑性和一定的機械強度以及良好的細胞一材料界面等特點(Burg KJ，Porter S，KellamJF.Biomaterials developments for bone tissue engineering.Biomaterials，2000，21(23)2347-2359)。當前骨組織工程研究中所用的支架材料有兩類(1)生物衍生材料，如，凍干脫鈣骨、脫蛋白骨和膠原等；(2)人工合成材料，如聚乳酸、聚乙醇酸和聚偶磷氮等。采用不同理化技術制備的天然衍生骨支架材料與化學合成材料相比，材料經脫脂、脫鈣、脫蛋白等處理后，去除了具有阻滯作用的脂質和雜質蛋白，降低了材料的抗原性，且材料的天然網孔系統(tǒng)未受破壞。這種天然結構利于種子細胞的粘附和生長，并為細胞外基質的分泌提供了寬大的表面積和內部空間，具有良好的組織親和性和結合力(Mendes SC Tibbe JM，Veenhof M，et al.Bone Tissue Engineered Implants Using Human Bone MarrowStromal CellsEffect of Cluture Conditions and Donor Age.Tissue Engineering，2002，8(6)911-919；Orban JM，Marra KG，Hollinger J.Composition Options of TissueEngineered Bone.Tissue Engineering，2002，8(4)529-536)。由于骨組織結構在不同種屬動物間存在高度同源性，生物衍生骨植入后易于被宿主細胞識別而替代，顯示良好的生物降解性，材料來源豐富，制作簡便，且理化性能、組織相容性、生物降解性和功能適應性方面優(yōu)于人工合成材料。
以往的研究發(fā)現(xiàn)，完全脫蛋白骨，如Oswestry骨、Anorganic骨等，雖然基本上消除了抗原性，但機械強度卻相對較差(Valentini P，Abensur D，Densari D，etal.Histological evaluation of Bio-Oss in a 2-stage sinus floor elevation andimplantation procedurea human case report.Clin Oral ImplantsRes，1998，9(1)59-67)。而部分脫蛋白骨，如Kiel骨，雖然機械強度尚可，但具有弱抗原性，效果不理想。所以，在具體制作工藝中，異種骨脫蛋白處理的無機與有機成分比至關重要。異種骨有機成分中很多非膠原的酸溶性蛋白具有免疫原性，去除不充分則保留較強抗原性，但去除過多膠原蛋白則材料易碎，影響生物力學強度。
基于以往脫蛋白制備工藝中所存在的缺陷，全面地分析了免疫原的消除與骨體機械強度的保留之間的關系。在此基礎上，本發(fā)明全面改進了異種骨組織的處理方法和步驟，使本發(fā)明的異種骨既消除了抗原性，又能保有良好的生物力學強度和骨誘導性，從而使之在人體骨修復中更好的作用。
發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種異種脫蛋白組織工程骨支架材料，使之具有(1)沒有或只有極低的免疫原性；(2)有足夠的抗壓強度和機械耐受性；(3)具有良好的骨傳導性和骨誘導性，(4)具有良好的三維結構和高孔隙率，從而更有利于細胞的植入和粘附；(5)可根據需要隨意加工成各種形狀和大小，并在植入后可保持再生組織的大體形態(tài)內態(tài)；(6)可與骨形態(tài)蛋白(BMP)、轉移生長因子-β等生物學活性因子復合，有效地誘導骨發(fā)生。
本發(fā)明人在仔細研究和分析了已有異種骨支架材料及其生產方法的基礎上，巧妙采用并組合了一系列有機溶劑、酶制劑和其他化學試劑處理工藝，并結合使用已知的Soxhlet提取器，經過反復大量的實驗研究，終于成功地制備出了本發(fā)明的異種骨支架材料。我們對本發(fā)明異種脫蛋白骨組織的各種物理和化學的分析結果顯示，其具有理想的骨組織工程支架材料應具備的所有特點和良好性能。特別是，我們用本發(fā)明異種脫蛋白骨組織與目前市售的同類產品所作的比較試驗表明，本發(fā)明的異種脫蛋白骨在生物相容性、可降解性、三維立體孔隙和網架結構、可塑性和機械強度等理化和生物學性能方面均明顯好于Oswestry骨、Anorganie骨等現(xiàn)有技術產品(數(shù)據未示出)。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種制備所述異種脫蛋白組織工程骨支架材料的方法。
為了得到本發(fā)明的異種脫蛋白組織工程骨支架材料，首先對新鮮豬肋骨及四肢骨進行預處理去除全部軟組織和骨髓、分別鋸或切割成長度約10mm、20mm和30mm，寬度及厚度相等的骨塊。然后，依次按下述方法處理
首先，在常溫下，將切割或鋸好的骨組織置于20％H2O2中浸泡24小時，用ddH2O沖洗(30分鐘)沖洗后，再次在20％H2O2中浸泡24小時。用ddH2O沖洗(30分鐘)后，依次用疊氮鈉(5mmol/L)、含1％tritonX-100的NaOH(1N)、5％胰蛋白酶和20％H2O2各浸泡12小時，并于每次浸泡后分別用ddH2O沖洗30分鐘。然后，再依次用1∶1甲醇/氯仿混合物、無水乙醚、乙二胺和無水乙醇浸泡24、12、24和24小時。并且，每次浸泡之間均用ddH2O沖洗30分鐘，但無水乙醇浸泡24小時后，應使用ddH2O繼續(xù)浸泡24小時。將經過如上處理的骨組織于50℃烘箱中烘干。最后，用60Co(25KGY)輻照滅菌。
其中，1∶1甲醇/氯仿混合浸泡、無水乙醚和乙二胺浸泡步驟是在soxhlet提取器內完成的。將脫蛋的骨放入提取管內，依次加入1∶1甲醇/氯仿、無水乙醚及乙二胺，于提取器中60-70℃分別加熱24小時、12小時和24小時，上述溶液在提取器中流動為10次/小時，以充分溶解并去除骨中的脂肪細胞或組織，有效地抑制內源性酶的活性。
本發(fā)明的異種骨來源于動物體內，因此使之材料來源廣泛、成本低廉。特別是，由于動物來源的材料具有與人細胞外基質非常相似的網架結構和成分，所以經過簡單的去脂、去細胞和蛋白等處理后，即可得到可直接用于臨床的本發(fā)明的支架材料。本發(fā)明人在已知技術的基礎上，選擇并優(yōu)化各種不同濃度的試劑、選擇并確立必要的處理條件及其設備，最終令人驚奇地制備出理化和生物學特征及性能都好于現(xiàn)有同類產品的異種脫蛋白組織工程骨支架材料。
本發(fā)明方法中處理骨組織所使用的氧化劑、有機溶劑、去污劑、蛋白酶等試劑均為本領域熟知的常用試劑。這些試劑其中，雙氧水(H2O2)的作用在于脫除骨內蛋白質，并使蛋白質變性；20％ H2O2可使大部分骨組織中的膠原蛋白變性并發(fā)揮正常生理功能，其中膠原不僅為細胞提供支持和保護作用，而且與細胞的粘附、生長、表型表達均有密切關系；疊氮鈉的作用是使骨細胞失活；TritonX-100為常用的非離子性除垢劑，用于破壞細胞膜脂及脂蛋；強堿NaOH溶液處理是為了進一步去除特異性非膠原蛋白；胰蛋白酶消化旨在使細胞間蛋白質水解，以更有利于細胞的游離；氯仿和甲醇浸泡不僅可以溶解并去除骨中的脂肪細胞或組織，而且可有效地抑制內源性酶的活性；乙醚處理則進一步去除殘存的脂肪細胞；乙二胺的功能在于去除骨內磷蛋白、唾液蛋白等結合蛋白質，最后，用無水乙醇浸泡是為了進一步清除脂溶性物質并吸除水份。
雖然本發(fā)明的方法中使用了較多的強氧化劑、有機溶劑、去污劑、蛋白酶等試劑處理骨組織，但由于本發(fā)明人基于已有經驗，在試劑的選擇、處理時間和條件上均作了許多改進，所以為得到具有優(yōu)于現(xiàn)有技術的異種脫蛋白骨支架材料提供了前提和必要的技術支持。
與以往使用的脫蛋白技術相比，由于本發(fā)明打破傳統(tǒng)觀念，有效的選擇并組合使用了各種浸泡和殘留蛋白質和細胞等的提取試劑，并且在必要時結合使用了soxhlet提取器。因此，在沒有破壞骨組織固有形態(tài)和亞結構的前提下，成功地去除了幾乎所有抗原物質。從而得到既消除了免疫原性，又保留有良好和足夠的機械強度和性能的異種脫蛋白骨支架材料。而這，也正是體現(xiàn)了本發(fā)明的技術進步。
圖1顯示本發(fā)明脫蛋白骨的掃描電鏡(SEM)照片，可見有原骨組織支架的三維多孔結構及網狀孔隙。
圖2顯示本發(fā)明的脫蛋白骨組織樣品的紅外分析圖譜?？梢?400-1700cm-1處有膠原相關鍵的振動。
圖3顯示未經處理的新鮮骨組織樣品的紅外分析圖譜。其中在2927cm-1處可觀察到C-H鍵的拉伸振動伴有一尖銳峰。
圖4顯示植入按本發(fā)明方法制備的異種脫蛋白骨組織后1周，局部有以淋巴細胞和單核細胞為主的大量炎性細胞浸潤(HE×400)。
圖5顯示植入后2周，局部炎性細胞浸潤明顯減少(HE×400)。
具體實施例方式
以下實施例旨在舉例說明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。
一.制備異種脫蛋白組織工程骨支架材料
首先對新鮮豬肋骨及四肢骨進行預處理去除全部軟組織和骨髓、分別鋸或切割成長度約10mm、20mm和30mm，寬度及厚度相等的骨塊。然后，依次按下述方法處理
在常溫下，將切割或鋸好的骨組織置于20％H2O2中浸泡24小時，用ddH2O沖洗(30分鐘)沖洗后，再次在20％H2O2中浸泡24小時。用ddH2O沖洗(30分鐘)后，依次用疊氮鈉(5mmol/L)、含1％tritonX-100的NaOH(1N)、5％胰蛋白酶和20％H2O2各浸泡12小時，并于每次浸泡后分別用ddH2O沖洗30分鐘。然后，再依次用1∶1甲醇/氯仿混合物、無水乙醚、乙二胺和無水乙醇浸泡24、12、24和24小時。并且，每次浸泡之間均用ddH2O沖洗30分鐘，但無水乙醇浸泡24小時后，應使用ddH2O繼續(xù)浸泡24小時。將經過如上處理的骨組織于50℃烘箱中烘干。最后，用60Co(25KGY)輻照滅菌，即得異種脫蛋白組織工程骨支架材。
上述方法中1∶1甲醇/氯仿混合浸泡、無水乙醚和乙二胺浸泡是在soxhlet提取器內完成的。將脫蛋的骨放入提取管內，依次加入1∶1甲醇/氯仿、無水乙醚及乙二胺，于提取器中60-70℃分別加熱24小時、12小時和24小時，上述溶液在提取器中流動為10次/小時，以充分溶解并去除骨中的脂肪細胞或組織，有效地抑制內源性酶的活性。
二.將上述所得異種脫蛋白組織工程骨支架材進行分析
實施例1本發(fā)明的異種脫蛋白骨的理化性質分析
對制備的異種脫蛋白骨進行組織學、掃描電鏡、紅外線光譜、X射線衍射分析、X線能量散射分析、微量凱氏定氮及力學性能測定。這些觀察和實驗分析的結果如下所述。
1.大體及組織學觀察制得的脫蛋白骨為白色柱狀(大小約10mm×5mm×3mm)，肉眼可見多孔蜂窩狀結構、質地堅硬、無異味。HE染色顯示，脫蛋白骨小梁結構清晰，間質及細胞已脫去，皮質骨板層狀結構完整；而新鮮骨可見間質及細胞。脫蛋白骨間質膠原纖維染色陽性，粘蛋白染色陰性；而新鮮骨組織粘蛋白及膠原染色均陽性。
2.掃描電鏡(SEM)觀察脫蛋白骨可見有原骨組織支架的三維多孔結構及網狀孔隙(參見圖1)，孔隙之間相互交通，其孔隙率為65.5％±6.45％，孔徑大小為472.5±7.02μm。
3.紅外光譜分析本發(fā)明的脫蛋白骨在1400-1700cm-1處有膠原相關鍵的振動，表明有膠原的存在(圖2)。而新鮮骨在2927cm-1處可觀察到C-H鍵的拉伸振動伴有一尖銳峰，表明骨中含有一定量脂肪(圖3)。
4.X射線衍射分析新鮮骨與脫蛋白骨的圖譜均為曲線型羥基磷灰石，但新鮮骨含有較多的非晶成分。
5.X射線能量散射分析新鮮骨的Ca/P比值為1.71±0.95，而脫蛋白骨為1.68±0.76，二者間無顯著性差異(P＞0.05)。
6.蛋白質含量測定用微量凱氏定氮法測得新鮮骨粉蛋白質含量為26.6±2.23％，脫蛋白骨的19.1±2.14％，二者差異顯著(P＜0.01)。
7.力學性能測定新鮮骨和脫蛋白骨的載荷變形曲線為受載后函數(shù)記錄儀描記出骨塊截荷-變形曲線，隨著載荷的增加，骨塊被壓縮，曲線由線性關系變?yōu)榉蔷€性改變，并形成第一個波峰，即載體變化不大而變形增加明顯。此時，可見骨塊有部分骨小粱斷裂。當時間持續(xù)形成第二個波峰時，更多骨小粱被壓縮，最后破壞，脫蛋白骨除彈性模量升高外，壓縮破壞載荷及破壞極限載荷與新鮮骨之間無顯著性差異(參見表1)。
表1 兩組材料的生物力學強度比較(n＝10)
*與新鮮骨比較P＜0.05
因此可以看出，本發(fā)明的脫蛋白骨具有良好的力學強度、機械耐受性，并具有良好的三維結構和高孔隙率。
實施例2本發(fā)明的異種脫蛋白骨的生物安全性研究
本實施例旨在采用急性和亞急性毒理試驗、溶血試驗、熱源試驗、皮內注射試驗、肌肉埋植試驗及細胞毒性試驗等標準方法，評價本發(fā)明的異種脫蛋白骨植入體內后的生物安全性。以下簡要說明這些實驗的結果。
1.急性和亞急性毒理試驗小鼠觀察期內，受體小鼠食欲正常精神飽滿，活動自如，無呼吸抑制、急促等不良反應。72小時后動物體重明顯增加。解剖觀察無腹水，腹腔內容物無粘連，HE染色顯示肝、脾、腎等器官均未見異常。
2.溶血試驗本發(fā)明脫蛋白骨的浸提液對兔血溶血率為2.82％(參見表2)
表2 溶血試驗結果(OD值)
注脫蛋白骨的溶血指數(shù)＝(0.084-0.082)/(0.792-0.082)×100％＝2.82％
3.熱源試驗所有實驗動物注射前后體溫波動在0.8℃以內，且注射后不高于注射前體溫，波動幅度小于1.4℃。
4.皮膚刺激試驗注射后各時間點觀察顯示，注射浸提液及生理鹽水處未發(fā)現(xiàn)有紅斑，水腫或壞死出現(xiàn)，注射20％酒精生理鹽水后6小時至72小時可見注射區(qū)有1.5-2.0cm直徑的紅斑，中心部分水腫明顯，然后紅斑加深并漸漸出現(xiàn)中心部分壞死結痂。
5.肌肉埋植試驗植入后48小時傷口有紅腫并有炎性細胞浸潤，1周后傷口愈合。植入2周后，纖維包膜開始形成，且后炎性細胞減少，材料周圍可見多核巨細胞吞噬顆粒。鏡下未見有肌肉組織變性、壞死或植入物被排斥現(xiàn)象(圖4、5)
6.細胞毒性試驗異種脫蛋白骨對L929細胞的細胞毒性為0級(見表3)，細胞增殖率與陰性對照之間無顯著性差異(P＞0.05)，與陽性對照組比較差異顯著(P＜0.05)。
表3 不同材料對L929細胞的影響(OD值)
*與試驗組比較P＜0.05
實施例3本發(fā)明的異種脫蛋白骨的細胞相容性研究
本實施例描述異種脫蛋白骨的細胞相容性研究的結果。
將本發(fā)明的異種脫蛋白骨與骨髓基質細胞復合培養(yǎng)后，采用倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察貼壁生長狀態(tài)，并以MTT法、流式細胞儀及堿性磷酸酶(ALP)活性檢測來判斷細胞的被移植出來上的存活率、分化水平及活力和代謝水平。
1.倒置相差顯微鏡和組織學觀察
脫蛋白骨與骨髓基質細胞符合培養(yǎng)24小時后，細胞在材料表面和孔隙內均可粘附和分布，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞進一步生長、分化和增殖。骨髓基質細胞與材料復合培養(yǎng)7天后，可見細胞貼壁、聚集成團或連接成網狀。HE染色顯示細胞在材料孔隙內增殖并有基質分泌。
2.掃描電鏡觀察
骨髓基質細胞與材料符合培養(yǎng)7天后，細胞在材料表面均可粘附。細胞呈梭形或多角形，相鄰細胞間有突起相互連接，細胞周圍有網狀膠原附著。
3.MTT法檢測
與細胞單獨培養(yǎng)相比較，骨髓基質細胞與材料復合培養(yǎng)1、3、5和7天，細胞活力無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
表4 材料對骨髓基質細胞活力的影響(n＝4，均數(shù)±標準差)
P＞0.05
4.流式細胞儀檢測細胞周期
與單獨細胞培養(yǎng)相比，骨髓基質細胞與材料復合培養(yǎng)7天后，各組細胞周期未見明顯變化，未見異常倍體細胞(參見表5)。
表5 材料對骨髓基質細胞周期和倍體水平的影響(n＝4)
5.堿性磷酸酶(ALP)活性定量檢測
隨著培養(yǎng)時間的延長，骨髓基質細胞與材料復合培養(yǎng)與單獨培養(yǎng)兩組細胞APL活性都用所增加，但同一時間點兩組間ALP水平無顯著差異(P＞0.05)。
表6 堿性磷酸酶活性測定值(u/g蛋白質，平均數(shù)±標準差)
P＞0.05
由以上觀察和實驗研究的結果可以看出，本發(fā)明的異種脫蛋白骨確實具有良好的細胞相容性。
實施例4本發(fā)明的異種脫蛋白骨在復合細胞體內異位成骨研究
本實施例使用本發(fā)明的異種脫蛋白骨作為骨髓基質細胞支架材料，研究將其植入異種異體動物體內植入后對受體動物成骨作用的影響。
將本發(fā)明的異種脫蛋白骨與培養(yǎng)的骨髓基質細胞復合培養(yǎng)1周后，植入兔背部肌肉內(實驗組)，同時使用常規(guī)方法制備的異種脫蛋白骨植入作為對照組，進行平行的比較實驗。植入手術后第4和8周，手術取出被植入的材料，進行肉眼觀察、常規(guī)組織學檢查、血漿和組織內堿性磷酸酶(ALP)含量檢測，借以分析和比較植入物表面的成骨水平，進而判斷異種脫蛋白骨移植物對對受體動物成骨作用和骨再生的影響。
大體標本觀察可見，植入手術后4和8周，各組動物的植入材料周圍軟組織均未見壞死、化膿、積液等現(xiàn)象。但可見材料有大量纖維組織和血管軟組織包裹并長入，而且難以分離。
2.ALP活性檢測
與植入后4周相比，植入8周后的實驗組動物的血漿ALP活性明顯升高(P＜0.05)。而且，與對照組相比，在植入后同一時間，實驗組動物也表現(xiàn)有較高的ALP活性(P＜0.01)(參見表7)。
表7 各組材料ALP活性測定結果(IU，)(平均數(shù)±標準差)
植入后4周，與實驗組相比P＜0.05，與同一時相檢測的對照組相比*P＜0.01
3.常規(guī)組織學檢查
術后4周，實驗組可見有軟骨帶形成，其中有少量鈣化的骨組織，周圍可見梭形間充質細胞向軟骨細胞分化。術后8周，可見編織骨和髓腔形成，其內見有島狀小梁骨，周邊仍可見軟骨細胞。對照組中未見任何軟骨或新骨形成，隨植入時間延長，并可見材料周圍的肌肉組織、纖維組織、血管等由外向內逐漸長入材料孔隙內。
4.成骨程度定量分析
使用常規(guī)方法評定實驗組植入物的成骨程度。結果可見，4周時為2.89±0.61，8周時為4.78±0.81。且隨植入時間的延長，新骨更趨成熟。
實施例5本發(fā)明的異種脫蛋白骨的免疫學研究
本實施例研究異種脫蛋白骨植入體內后可能引起的免疫反應，為本發(fā)明異種骨組織的臨床應用提供免疫學依據。
分別將按本發(fā)明方法制備的異種脫蛋白骨、自體骨和未處理的新鮮異種骨植入BALB/C小鼠的股后肌袋。然后，分別于術后第1、2、4和6周處死動物，觀察移植后小鼠的細胞、體液免疫反應及局部組織反應。
結果
1.淋巴細胞刺激增殖實驗
將上述三種不用的骨組織植入BALB/C小鼠后，觀察受體動物在各時相點上的脾淋巴細胞遭受相應植入物刺激時的增殖反應(參見下列表8)。
表8 植入后體外淋巴細胞二次刺激增殖刺激指數(shù)(SI)
由表8所示的結果可以看出，植入1周后，新鮮骨組織淋巴細胞體外增殖刺激指數(shù)明顯高于脫蛋白骨及自體骨組(P＜0.01)，植入后2周后，新鮮骨組織淋巴細胞刺激指數(shù)達高峰，而脫蛋白骨及自體骨組無明顯升高，SI值明顯低于新鮮骨組(P＜0.01)。
這些結果提示，新鮮骨具有較強的免疫原性，植入體內后可刺激機體免疫系統(tǒng)，引發(fā)明顯的細胞免疫。而本發(fā)明的脫蛋白骨則對淋巴細胞增殖影響不大，抗原性微弱。
血清特異性抗體水平檢測各實驗組動物植入經處理的異種骨后，血清特異性抗體檢測結果如下列表9所示。
表9 植入后血清特異性抗體(OD值)
新鮮骨組在各時相點明顯高于脫蛋白骨及自體骨組(P＜0.05)
由表9所示的數(shù)據可以看出，本發(fā)明的脫蛋白骨和自體骨在各時相點的OD值之間未見顯著性差異(P＞0.05)。此結果表明，本發(fā)明的脫蛋白骨植入動物體內后，并沒有誘導明顯可見的體液免疫反應。
組織學觀察新鮮骨植入后，各時相點均可見局部的大量炎性細胞浸潤，即表現(xiàn)出明顯的排斥反應；本發(fā)明的脫蛋白骨及自體骨盡管在植入初期有少量中性白細胞滲出，但2-4周后浸潤細胞消失，并顯示有大量的纖維組織長入。此結果表明，本發(fā)明的脫蛋白骨具有較好的組織相容性。
權利要求
1、一種用于組織工程的異種骨支架材料，其特征在于該材料既消除了免疫原性，又保留有良好的機械強度和力學性能。
2、根據權利要求1的異種骨支架材料，其特征在于該材料來源于豬。
3、制備根據權利要求1的異種骨支架材料的方法，該方法包括
(1)將經過預處理的異種骨置于雙氧水中浸泡24后，依次在濃度為5mmol/L的疊氮鈉、含1％tritonX-100的1N氫氧化鈉溶液、5％胰蛋白酶和20％H2O2溶液中各浸泡12小時，
(2)然后再依次用1∶1甲醇/氯仿混合物、無水乙醚、乙二胺和無水乙醇各浸泡24、12、24和24小時。
4、根據權利要求3的方法，特征在于其中步驟(2)是在soxhlet提取器內完成的。
5、根據權利要求3的方法，特征在于所說的材料來源于豬。
全文摘要
本發(fā)明涉及骨支架材料，特別是涉及一種用于修復各種原因引起的骨缺損的異種骨支架材料，本發(fā)明進一步涉及制備所說的骨支架材料的方法。本發(fā)明的骨支架材料基本上沒有免疫原性，但保留有良好的機械強度和力學性能。
文檔編號A61L27/50GK1861202SQ20061005435
公開日2006年11月15日 申請日期2006年6月14日 優(yōu)先權日2006年6月14日
發(fā)明者劉雷, 李起鴻 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院