基質(zhì)細(xì)胞衍生因子結(jié)合放射狀膠原支架的制備方法及其在骨軟骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)計(jì)骨軟骨缺損的修復(fù)，特別涉及一種基質(zhì)細(xì)胞衍生因子結(jié)合放射狀膠原支架在骨軟骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]骨軟骨缺損是發(fā)生在骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，0A)晚期的一個(gè)重要病理變化，骨性關(guān)節(jié)炎是最常見(jiàn)的骨科疾病并導(dǎo)致巨大醫(yī)療消耗，因此世界衛(wèi)生組織啟動(dòng)第二個(gè)“骨關(guān)節(jié)十年”計(jì)劃對(duì)抗0A，由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏自我修復(fù)能力，所以關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)是臨床治療骨關(guān)節(jié)炎的最大挑戰(zhàn)。到目前為止，臨床上對(duì)于骨軟骨缺損的治療以自體軟骨細(xì)胞移植為首選，盡管其療效確切，但它的手術(shù)適應(yīng)癥有限，80%的病人最終選擇了關(guān)節(jié)置換手術(shù)，但其手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大和術(shù)后易出現(xiàn)并發(fā)癥和合并癥，且長(zhǎng)期療效不佳的特點(diǎn)。因此，尋找治療骨軟骨缺損的有效治療方法是當(dāng)務(wù)之急。
[0003]雖然通過(guò)細(xì)胞移植來(lái)治療骨關(guān)節(jié)炎已經(jīng)被廣泛研宄，通過(guò)自體細(xì)胞歸巢而不經(jīng)過(guò)細(xì)胞的移植，作為一種有前景的方法目前仍然缺乏研宄。一般認(rèn)為骨軟骨缺損可以通過(guò)缺損底部的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)來(lái)修復(fù)，然而最近的研宄也表明部分修復(fù)的軟骨來(lái)自缺損周邊軟骨細(xì)胞的浸潤(rùn)。因此設(shè)計(jì)一種能夠促進(jìn)自體細(xì)胞迀移的材料非常重要。由于材料的三維結(jié)構(gòu)和孔隙率等性質(zhì)都可以影響細(xì)胞在其內(nèi)部的生長(zhǎng)，目前大多數(shù)的材料結(jié)構(gòu)都是無(wú)序的并不利于細(xì)胞的迀移，因此設(shè)計(jì)一種放射狀的材料具有重要的意義。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 (SDF-1)在很多器官中表達(dá)，研宄表明它能夠促進(jìn)干細(xì)胞的歸巢和迀移。因此我們探討了通過(guò)放射狀膠原支架結(jié)合SDF-1對(duì)促進(jìn)細(xì)胞迀移和軟骨再生的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出了一種基質(zhì)細(xì)胞衍生因子結(jié)合放射狀膠原支架的制備方法及其在骨軟骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供一種基質(zhì)細(xì)胞衍生因子的新用途，即基質(zhì)細(xì)胞衍生因子結(jié)合放射狀膠原支架在骨軟骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用，本發(fā)明以放射狀膠原支架結(jié)合SDF-1為個(gè)例，對(duì)材料的物理表征以及材料在體外對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的迀移進(jìn)行了研宄，明確了放射狀膠原支架結(jié)合SDF-1對(duì)兔子股骨骨軟骨缺損的修復(fù)作用?，F(xiàn)有的生物材料用于骨軟骨缺損時(shí)無(wú)法促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的迀移，往往無(wú)法達(dá)到較好的修復(fù)效果，本發(fā)明在使用了放射狀膠原支架的基礎(chǔ)上，還結(jié)合了能夠促進(jìn)干細(xì)胞迀移的SDF-1來(lái)修復(fù)骨軟骨缺損。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
步驟一:采用放射狀膠原支架裝置制作放射狀膠原支架
將內(nèi)徑為5.0mm,高為20.0mm的圓柱形模具，在_20°C下冷凍作為冷凍源，在模具的中央設(shè)有一直徑為1.5mm的塑料圓柱，模具的頂部和底用均為塑料；將膠原水溶液加入模具中，在-20 V的溫度下冷凍，膠原水溶液從模具外向內(nèi)逐漸結(jié)晶成放射狀；當(dāng)整個(gè)模具內(nèi)的膠原水溶液全部結(jié)晶完畢時(shí)，將模具在_80°C放置至膠原結(jié)晶溫度降至-80°C，將模具真空干燥48~120小時(shí)，獲得放射狀膠原支架；
步驟二:所述膠原水溶液的制備
剝?nèi)⌒迈r豬腿的肌腱，去除筋膜和脂肪制成預(yù)處理后的肌腱，然后剪成薄片，浸泡于三羥甲基氨基甲烷與乙二胺四乙酸和氯化鈉的混合溶液a中，4°C過(guò)夜，取浸泡后的肌腱薄片用蒸餾水沖洗后溶于0.5mol/L乙酸水溶液中，調(diào)節(jié)pH值為I后加入胃蛋白酶，4°C放置3天，離心，棄去上層脂肪層，取下層膠原混合物a用0.5mol/L乙酸水溶液稀釋3倍體積，紗布過(guò)濾，取濾液用等體積的0.9mol/L氯化鈉水溶液配制成混合溶液b，4°C過(guò)夜，離心，取下層膠原混合物b加入1/4體積的0.5mol/L乙酸水溶液在4°C溶解過(guò)夜后用雙蒸水透析，取截留液在-80°C冷凍干燥后用雙蒸水配制成10mg/mL的膠原水溶液，4°C保存；所述混合溶液a中三羥甲基氨基甲烷終濃度為0.05mol/L,乙二胺四乙酸終濃度為0.02mol/L,氯化鈉終濃度為0.5mol/L ;所述胃蛋白酶的用量為10mg酶/Ig預(yù)處理后的肌腱，胃蛋白酶的酶活是3000-3500NFU/mg
步驟三:結(jié)合SDF-1的放射狀膠原支架的制備
以1:2.5的比例將100ng/ml的SDF-1溶于濃度為40mg/ml的纖維凝膠緩沖A液中，再與40mg/ml的纖維凝膠B液1:1混合，獲得混合液；將混合液注射入放射狀膠原支架中心的孔中，混合液在一分鐘以內(nèi)成膠，獲得含有SDF-1的放射狀膠原支架。
[0007]基質(zhì)細(xì)胞衍生因子結(jié)合放射狀膠原支架在骨軟骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供一種能夠促進(jìn)自體細(xì)胞迀移的含SDF-1的放射狀膠原支架在骨軟骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用，其通過(guò)兩個(gè)方面促進(jìn)了干細(xì)胞的迀移，現(xiàn)有的材料多數(shù)結(jié)構(gòu)紊亂，而骨軟骨缺損是需要能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞迀移的材料；本發(fā)明明確了含SDF-1的放射狀膠原支架制作方法，并實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)的功能檢驗(yàn)，為含SDF-1的放射狀膠原支架的臨床應(yīng)用供了基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1為制備放射狀膠原支架示意圖；
圖2A為制備的放射狀膠原支架垂直面掃描圖；
圖2B為制備的放射狀膠原支架水平面電鏡掃描圖；
圖3A為制備的傳統(tǒng)膠原支架垂直面掃描圖；
圖3B為制備的傳統(tǒng)膠原支架水平面電鏡掃描圖；
圖4為體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞迀移模型；
圖5A為傳統(tǒng)膠原支架；
圖5B放射狀膠原支架；
圖5C為結(jié)合SDF-1的放射狀膠原支架蘇木精伊紅染色圖；
圖6A為傳統(tǒng)膠原支架熒光DAPI染色圖；
圖6B放射狀膠原支架熒光DAPI染色圖；
圖6C結(jié)合SDF-1的放射狀膠原支架熒光DAPI染色圖；
圖7a為實(shí)施例2中傳統(tǒng)膠原支架組大體動(dòng)物標(biāo)本照片；
圖7b為放射狀膠原支架組大體動(dòng)物標(biāo)本照片； 圖7c為結(jié)合SDF-1和放射狀膠原支架組大體動(dòng)物標(biāo)本照片；
圖8為實(shí)施例2中大體動(dòng)物標(biāo)本照片，a為傳統(tǒng)膠原支架組，b為放射狀膠原支架組，c為結(jié)合SDF-1和放射狀膠原支架組的ICRS評(píng)分；
圖9a為實(shí)施例2中傳統(tǒng)膠原支架組缺損部位切片的SO染色圖；
圖9b為實(shí)施例2中放射狀膠原支架組缺損部位切片的SO染色圖；
圖9c為實(shí)施例2中結(jié)合SDF-1和放射狀膠原支架組缺損部位切片的SO染色圖；
圖10 a為傳統(tǒng)膠原支架組軟骨組織切片I型膠原免疫組化染色圖；
圖10 b為放射狀膠原支架組軟骨組織切片I型膠原免疫組化染色圖；
圖10 c為結(jié)合SDF-1和放射狀膠原支架組軟骨組織切片I型膠原免疫組化染色圖圖11 a為傳統(tǒng)膠原支架組軟骨組織切片MMP13免疫組化染色圖；
圖11 b為放射狀膠原支架組軟骨組織切片MMP13免疫組化染色圖；
圖11 c為結(jié)合SDF-1和放射狀膠原支架組軟骨組織切片MMP13免疫組化染色圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
本發(fā)明實(shí)施例所用實(shí)驗(yàn)材料:
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雌性新西蘭大白兔(2.5kg) SPF由浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
[0011]實(shí)驗(yàn)藥品:
纖維凝膠杭州普濟(jì)公司其他試劑:美國(guó)Sigma公司實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備:
攪拌機(jī)金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠
石蠟切片機(jī)德國(guó)MICROW公司
顯微鏡攝影機(jī)日本OLYMPUS公司
BMJ-1II包埋機(jī)及冷凍臺(tái)中國(guó)常州中威電子儀器有限公司
掃描電鏡日立
實(shí)施例1支架制備及檢測(cè):
(I)制備放射狀膠原支架:采用放射狀膠原支架裝置制作放射狀膠原支架，所述放射狀膠原支架裝置為一內(nèi)徑為5.0mm，高20.0mm的模具，該模具為圓柱形，并在-20°C下冷凍作為冷凍源。在模具的中央有一直徑為1.5mm的塑料圓柱，模具的頂部和底用均為塑料。將膠原水溶液加入模具中，繼續(xù)在-20°C下冷凍，膠原水溶液從模具外向內(nèi)逐漸結(jié)晶。當(dāng)整個(gè)模具內(nèi)的膠原水溶液全部結(jié)晶完畢時(shí)，將放射狀膠原支架裝置在-80°C放置至放射狀膠原支架溫度降至_80°C，將放射狀膠原支架裝置真空干燥48小時(shí)，獲得膠原支架。制備支架過(guò)程的示意圖見(jiàn)圖1。倍數(shù)掃描電鏡圖顯示，