軟骨細(xì)胞外基質(zhì)與絲素蛋白復(fù)合取向軟骨支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物組織工程技術(shù)，具體是一種軟骨細(xì)胞外基質(zhì)與絲素蛋白復(fù)合取向軟骨支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物組織工程方法主要包括支架材料、種子細(xì)胞和信號因子三要素，其中，支架材料是組織工程構(gòu)建的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。理想的組織工程軟骨支架材料應(yīng)具有以下特征:良好的生物相容性；適當(dāng)?shù)目山到庑?；足夠的孔隙結(jié)構(gòu)；促進(jìn)細(xì)胞粘附于增殖；支架的容積應(yīng)能保持不變；不易從缺損區(qū)脫落；具有一定的彈性；具有關(guān)節(jié)軟骨的取向結(jié)構(gòu)；成分、形狀、力學(xué)性能上與人軟骨細(xì)胞外基質(zhì)相似等。支架材料作為種子細(xì)胞的載體，不僅影響種子細(xì)胞的增殖與分化，而且還決定移植后能否與組織有效的結(jié)合，從而發(fā)揮其修復(fù)缺損軟骨組織的作用。
[0003]可用于軟骨支架構(gòu)建的材料主要有合成材料、天然生物材料、仿生納米材料等。早期應(yīng)用于軟骨組織工程的支架材料主要為單一的合成材料，如聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸聚羥基乙酸共聚物(PLGA)等。但由于合成材料生物相容性差、容易引起機(jī)體免疫排斥反應(yīng)、體內(nèi)降解速率慢等缺點，后來則傾向于應(yīng)用生物相容性更好、體內(nèi)降解速率可調(diào)控的天然生物材料如殼聚糖、明膠、II型膠原、透明質(zhì)酸、6-硫酸軟骨素、軟骨細(xì)胞外基質(zhì)等。而為了克服單一天然生物材料力學(xué)強(qiáng)度不足、體內(nèi)降解速率難以控制等不足，由兩種或兩種以上不同材料復(fù)合來優(yōu)化材料的特性已經(jīng)成為目前軟骨組織工程研究熱點，如I型膠原/透明質(zhì)酸復(fù)合支架、II型膠原/透明質(zhì)酸復(fù)合支架、II型膠原/透明質(zhì)酸/6-硫酸軟骨素復(fù)合支架、軟骨細(xì)胞外基質(zhì)/PLGA復(fù)合支架等。
[0004]關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)復(fù)雜并有很高程度的異質(zhì)性，由軟骨細(xì)胞外基質(zhì)包繞軟骨細(xì)胞組成，形成垂直于關(guān)節(jié)面的取向結(jié)構(gòu)。目前國內(nèi)對于組織工程軟骨支架材料的研究多停留在孔隙無規(guī)則的支架上，模擬正常關(guān)節(jié)軟骨取向結(jié)構(gòu)支架的研究卻很少見。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有的軟骨組織工程支架材料的性能以及支架孔隙結(jié)構(gòu)不足的問題，所提出的一種軟骨細(xì)胞外基質(zhì)與絲素蛋白復(fù)合取向軟骨支架及其制備方法。
[0006]本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0007]—種軟骨細(xì)胞外基質(zhì)與絲素蛋白復(fù)合取向軟骨支架，由軟骨外基質(zhì)和絲素蛋白交聯(lián)而成，孔隙結(jié)構(gòu)為取向結(jié)構(gòu)。
[0008]一種軟骨細(xì)胞外基質(zhì)與絲素蛋白復(fù)合取向軟骨支架的制備方法，包括以下步驟:
a.制備軟骨細(xì)胞外基質(zhì)凍干海綿
①切取關(guān)節(jié)軟骨片，用含有苯甲基磺酰氟的Tris-HCl緩沖液浸泡后粉碎為勻漿；
②差速離心法取500nm-5Pm左右的軟骨微絲； ③0?4°C下加入含TritonX-100和苯甲基磺酰氟的Tris-HCl緩沖液震蕩12?24h；
④離心，蒸餾水反復(fù)沖洗；再離心，加入DNasel與RNaseA在震蕩消化12?24h ；
⑤離心，超純水反復(fù)沖洗，冷凍干燥；
b.制備絲素蛋白溶液
①蠶絲脫膠:將蠶絲扯松放于Na2C03溶液中煮沸30?60min;沖洗，用Na 2C03溶液繼續(xù)煮沸30?60min，沖洗，瞭干；
②取脫膠后的蠶絲溶于LiBr溶液，50?80°C下攪拌2?8h，制得絲素蛋白混合溶液；
③將絲素蛋白混合溶液裝入透析袋中進(jìn)行透析；
④將透析后的絲素蛋白溶液8000?12000rpm/min離心，上清液裝入透析袋中再次透析，加入聚乙二醇溶液進(jìn)行濃縮；
⑤將濃縮后的絲素蛋白溶液8000?12000rpm/min離心，取上清溶液保存?zhèn)溆茫?br> c.支架構(gòu)建和交聯(lián)
將軟骨細(xì)胞外基質(zhì)凍干海綿溶于純水后與絲素蛋白溶液混勻，注入模具，采用定向結(jié)晶技術(shù)在-15?_80°C下結(jié)晶12?24h，真空冷凍干燥12?24h ;取出后，進(jìn)行紫外線照射物理交聯(lián)和化學(xué)試劑交聯(lián)，烘干，滅菌。
[0009]本發(fā)明獲得了如下的有益效果:本發(fā)明有效的解決了現(xiàn)有的軟骨組織工程支架材料的性能以及支架孔隙結(jié)構(gòu)不足的問題。本發(fā)明采用的人、豬、?；蜓蜿P(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)及絲素蛋白均屬于天然生物材料，具有良好的生物相容性，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解較快，絲素蛋白降解較慢，二者結(jié)合可調(diào)節(jié)降解速度使其更適于種子細(xì)胞繁殖和代謝。同時體系中絲素蛋白可提高支架生物力學(xué)強(qiáng)度；通過脫細(xì)胞系列處理去處抗原成分，避免發(fā)生免疫排斥反應(yīng)、傳播疾??；通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)及絲素蛋白的濃度及定向結(jié)晶時冷凍溫度、降溫速率等因素，控制多孔支架的微結(jié)構(gòu)，制備出具有適宜孔徑和孔隙率的三維取向支架；通過控制交聯(lián)時間或交聯(lián)劑濃度，調(diào)節(jié)支架的生物力學(xué)特性和降解速率，使組成結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能與正常軟骨細(xì)胞外基質(zhì)相似；可塑性好，制備工藝簡單，可利用CAD設(shè)計和制造技術(shù)制備與退變軟骨的形狀、大小相同的復(fù)合取向支架材料，可用于構(gòu)建組織工程軟骨修復(fù)軟骨退變，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0010]圖1是本發(fā)明所采用的定向結(jié)晶過程示意圖；
圖2是本發(fā)明支架的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖3是本發(fā)明應(yīng)力-應(yīng)變曲線圖；
圖4是本發(fā)明HE染色放大50倍無細(xì)胞及細(xì)胞碎片殘留圖；
圖5是本發(fā)明番紅-0染色放大50倍圖；
圖6是本發(fā)明甲苯胺藍(lán)染色放大50倍圖；
圖7是光鏡下本發(fā)明橫斷面呈均勻三維網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)50倍放大圖；
圖8是光鏡下本發(fā)明縱斷面呈均勻三維管狀取向結(jié)構(gòu)50倍放大圖；
圖9是電鏡下本發(fā)明橫斷面呈均勻三維網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)130倍放大圖；
圖10是電鏡下本發(fā)明縱斷面呈均勻三維管狀取向結(jié)構(gòu)130倍放大圖；
圖11是電鏡下本發(fā)明內(nèi)部孔壁結(jié)構(gòu)8000倍放大圖； 圖12是CCK-8試劑盒檢測支架浸提液培養(yǎng)下脂肪干細(xì)胞的增殖圖；
圖13是培養(yǎng)3天后Live/Dead染色脂肪干細(xì)胞在支架上分布平面圖；
圖14是培養(yǎng)3天后Live/Dead染色脂肪干細(xì)胞在支架上分布立體圖；
圖15是培養(yǎng)7天后Live/Dead染色脂肪干細(xì)胞在支架上分布平面圖；
圖16是培養(yǎng)7天后Live/Dead染色脂肪干細(xì)胞在支架上分布立體圖。
[0011]圖1中:1.模具；2.泡沫塑料套。
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合附圖及【具體實施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0013]1、制備豬軟骨細(xì)胞外基質(zhì)凍干海綿
切取新鮮豬關(guān)節(jié)軟骨組織，操作方法如下:①用PH7.5，濃度為0.01M的Tris-Hcl緩沖液(含0.035mM苯甲基磺酰氟)浸泡軟骨片后經(jīng)組織粉碎機(jī)(品牌BIL0N;型號DS-1)粉碎為勻漿差速離心法取500nm-5Pm左右的軟骨微絲4°C下加入PH7.5的含1%TritonX-100 的 Tris-HCl 緩沖液(含 0.035mM 苯甲基磺酰氟)震蕩 12h 10000rpm/min離心后蒸饋水反復(fù)沖洗；⑤10000rpm/min離心后加入50U/ml DNasel與lU/ml RNase A在37°C下震蕩消化12h ;? lOOOOrpm/min離心后超純水反復(fù)沖洗，冷凍干燥后即得。
[0014]2、制備絲素蛋白溶液
以桑蠶絲為原料，操作方法如下:①蠶絲脫膠(堿煮):將Na2C03 10.6g溶于5L純水，將蠶絲扯松放于Na2C03溶液中煮沸30min，時刻翻轉(zhuǎn)。棄水，洗10次，用5L Na 2C03溶液繼續(xù)煮沸30min，棄水，洗5_6次，抒干，通風(fēng)處瞭干40g LiBr溶于50ml純水，取脫膠后的蠶絲10g溶于LiBr溶液，在60°C下攪拌4h，制得絲素蛋白混合溶液；③將絲素蛋白混合溶液裝入截留分子量為12000?14000的透析袋中，用自來水透析兩天，用蒸餾水透析一天，每天換4-5次水；④將透析后絲素蛋白溶液12000rpm/min離心15min，棄掉沉淀后裝入截留分子量為3500的透析袋中，于20%聚乙二醇溶液中濃縮4-8h ;⑤將濃縮后的絲素蛋白溶液12000rpm/min離心15min，棄掉沉淀后，取少量絲素蛋白溶液烘干法測濃度，剩余絲素蛋白溶液4°C保存，備用。
[0015]3、軟骨細(xì)胞外基質(zhì)與絲素蛋白復(fù)合取向軟骨支架構(gòu)建和交聯(lián)
將軟骨細(xì)胞外基質(zhì)凍干海綿溶于純水后與絲素蛋白溶液混勻為漿料，漿料中軟骨細(xì)胞外基質(zhì)和絲素蛋白濃度均為3%，將漿料加入模具后采用定向結(jié)晶技術(shù)，-2