組織損傷修復(fù)中的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1的蛋白酶抗性突變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1的肽，所述肽已突變，使得其抵抗蛋白酶二肽基肽酶IV(DPPIV)以及基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的消化，但仍保持天然SDF-1吸引T細(xì)胞的能力。突變體可粘附至自組裝肽形成的膜，然后在組織損傷部位移植以輔助促進(jìn)修復(fù)。
【專利說明】組織損傷修復(fù)中的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1的蛋白酶抗性突變 體
[0001] 本申請(qǐng)是國際申請(qǐng)日為2007年10月22日、國際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2007/022394、進(jìn) 入國家階段的申請(qǐng)?zhí)枮?00780039382. 7、發(fā)明名稱為"組織損傷修復(fù)中的基質(zhì)細(xì)胞衍生因 子1的蛋白酶抗性突變體"的PCT申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003] 本申請(qǐng)要求2007年6月22提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)60/929, 353以及2006年10月 23日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)60/853, 441的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益。這些在先申請(qǐng)的內(nèi)容在此通過引 用的方式整體并入。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004] 本發(fā)明涉及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子I(SDF-I)的肽，所述肽采用以下方式突變，所述方 式保留其吸引細(xì)胞的能力但使其抵抗蛋白酶（特別是基質(zhì)金屬蛋白酶2 (MMP-2)和/或二 肽基肽酶IV (DPPIV/CD26))導(dǎo)致的滅活。當(dāng)其被遞送到損傷組織時(shí)，這些突變體促進(jìn)組織 修復(fù)。所述肽在許多狀況（包括胃腸道或其它位置的潰瘍，意外、手術(shù)或疾病造成的創(chuàng)傷， 以及心肌梗塞造成的心臟組織損傷）的治療中也應(yīng)當(dāng)是有效的。所述肽在使糖尿病患者對(duì) 創(chuàng)傷、潰瘍或病變引起的傷害敏感性下降的治療中也應(yīng)是有效的。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施 方式中，利用自組裝肽形成的膜將SDF-I的突變形式遞送到損傷組織。

【背景技術(shù)】
[0005] 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(SDF_1，或CXCL12)是吸引靜息T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞以及 CD34+干細(xì)胞的趨化因子家族中的68個(gè)氨基酸的成員。通常發(fā)現(xiàn)它有兩種不同的形式 SDF-I α和SDF-I β，其是差異mRNA剪接的結(jié)果（US5, 563, 048)。除了 SDF-I β在C末端有 4個(gè)氨基酸（-Arg-Phe-Lys-Met)的延伸外，這些形式是基本上相同的。兩種形式的SDF-I 都以21個(gè)氨基酸長度的信號(hào)肽起始，所述的信號(hào)肽被切割以形成活性肽（US5, 563, 048)。 就本發(fā)明而言，應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語"SDF-1"指的是所述肽的活性形式（即在切割信號(hào)肽之后）， 并包含 SDF-I α 和 SDF-I β。
[0006] 還發(fā)現(xiàn)了全長68個(gè)氨基酸的SDF-I序列并不是活性所需的。具有SDF-I至少前8 個(gè)N末端殘基的肽保持全長肽的受體結(jié)合和生物活性，雖然其效力減弱。例如，SDF-I、1-8、 1-9U-9二聚體以及1-17誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣以及T淋巴細(xì)胞和CEM細(xì)胞中的趨化作用，并結(jié)合 至CXC趨化因子受體4 (CXCR4)。然而，天然的SDF-I在5ηΜ下具有半最大的趨化活性，而 1-9二聚體需要500ηΜ，因而其效力是1/100。1-17以及1-9單體類似物的效力分別是SDF-I 的1/400和1/3600。C末端環(huán)化的SDF-I變體已被描述，其具有更高的CXCR4受體結(jié)合親 和性，并且這種類型的環(huán)化可以（如果需要）用于連接本發(fā)明所描述的肽。就本發(fā)明而言， 術(shù)語SDF-I將包括在C末端截短但仍保持SDF-I生物學(xué)活性（即趨化T淋巴細(xì)胞和CEM細(xì) 胞以及結(jié)合至CXC趨化因子受體4 (CXCR4))的肽的形式。在最低限度上，這些截短形式包 括所述肽N末端的前8個(gè)氨基酸。
[0007] SDF-I 在胚胎發(fā)育期間（Nagasawa 等，Nature382 :635-638(1996) ;Zou 等， Nature393 :595-599(1998))以及干細(xì)胞移植后（Lapidot 等，Bloodl06 :1901-1910(2005)) 造血干細(xì)胞歸巢至骨髓中起關(guān)鍵作用。除了在干細(xì)胞歸巢中的作用，SDF-I在心臟發(fā)生以及 血管生成中也很重要。SDF-I缺陷小鼠在圍產(chǎn)期死亡并且在心室間隔形成、骨髓造血以及器 官特異的血管生成中有缺陷（Nagasawa等，Nature382 :635-638(1996) ;Zou等，Nature393 : 595-599(1998))。還有報(bào)道說異常低水平的SDF-I至少部分地對(duì)糖尿病患者的創(chuàng)傷愈合 有損害，并且這種損害可以通過在組織損傷部位施用這種細(xì)胞因子而逆轉(zhuǎn)（Gallagher等， J.Clin Invest. 117 ： 1249-1259(2007))〇
[0008] 在正常成年人心臟中，SDF-I持續(xù)表達(dá)，但其表達(dá)在心肌梗塞后的數(shù)天內(nèi)上調(diào) (Pillarisetti 等，Inf lammation25 :193-300 (2001))。Askari 等通過心肌內(nèi)移植過表 達(dá)SDF-I的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染心成纖維細(xì)胞并聯(lián)合G-CSF治療，在心肌梗塞后8周增加 SDF-I表 達(dá)（Lancet362 :667-703 (2003))。這與心臟中更高數(shù)量的骨髓干細(xì)胞（c-Kit或CD34 陽性）和內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)，并導(dǎo)致血管密度上升以及左心室功能改善。這些研究提示，天 然發(fā)生的心肌修復(fù)過程的不足部分地歸結(jié)于SDF-I可用度的不夠。因此，在心肌梗塞 后以受控的方式遞送SDF-I可以吸引更多前體細(xì)胞從而促進(jìn)組織修復(fù)（Penn等，Int. J. Cardiol. 95(Suppl. I) :S23-S25(2004))。除此之外，SDF-I的施用可用于改善患者尤其 是糖尿病患者的創(chuàng)傷或潰瘍的愈合。
[0009] 可用于在組織損傷部位持續(xù)遞送藥物的一個(gè)方式是通過生物相容性膜的應(yīng)用。某 些肽在與低濃度的單價(jià)金屬陽離子孵育時(shí)能夠自組裝（U. S. 5, 670, 483 ;U. S. 6, 548, 630)。 組裝導(dǎo)致無毒性、無免疫原性以及對(duì)于蛋白酶相對(duì)穩(wěn)定的凝膠樣膜的形成。一旦形成，膜在 血清、水溶液以及細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)中是穩(wěn)定的。它們可在無菌條件下制備，能夠支持細(xì)胞生長 并在移植入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)緩慢地消化。這些特性使得所述的膜非常適合作為治療劑遞送的設(shè) 備（US20060148703 以及 20060088510)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明部分基于將以下作為前提的實(shí)驗(yàn)：基質(zhì)細(xì)胞衍生因子I(SDF-I)在損傷的 心臟組織恢復(fù)中的有益效果受該組織中高濃度的蛋白酶基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)所限 制。更具體地，我們提出MMP-2切割SDF-I并因而消除了其吸引前體細(xì)胞至組織損傷部位 的能力。
[0011] 為了驗(yàn)證這個(gè)前提，本發(fā)明人開發(fā)了保留吸引T細(xì)胞能力但抗MMP-2消化的SDF-I 的突變形式。所述的mSDF-1肽粘附至特別設(shè)計(jì)的由自組裝肽形成的膜，然后在心臟損傷 的動(dòng)物模型中驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)粘附至膜并植入到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌的mSDF-1，相對(duì)于未粘附至膜的 SDF-I或mSDF-1，更大程度地促進(jìn)心臟的恢復(fù)。
[0012] 此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SDF-I的截短形式保持和全長肽一樣的生物活性，第四位或 第五位氨基酸上的突變保護(hù)肽不受蛋白酶消化。
[0013] 在本發(fā)明的第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及SDF-I的突變形式（mSDF-1)，所述突變形式 的特征在于，未突變SDF-I的N末端的第四位和/或第五位氨基酸改變（K PVSLSYR CPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNR QVCIDPKLKWIQEYLEKALN K(SEQ ID NO :52))。由此，第四位氨基酸改 變?yōu)榉荢氨基酸和/或第五位氨基酸改變?yōu)榉荓氨基酸。如上面所討論的，如果存在前八 個(gè)氨基酸（上面序列中高亮顯示的序列），則全長SDF-I肽的截短形式保持生物活性，并且， 這些截短形式也可通過突變第四和/或第五位而具有蛋白酶抗性。本發(fā)明也包括這些生物 活性的截短突變體。提出了另一途徑，本發(fā)明包括至少包含SEQ ID NO :52的1-8位氨基酸 的肽，其可選地在C末端延伸SEQ ID NO :52剩余序列（如9-68位氨基酸所示）的所有或 任意部分。在所有這些情況中，所述肽具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :52所給出的序列，不同的是 第四位是非S的蛋白氨基酸和/或第五位是非L的蛋白氨基酸。
[0014] 就本發(fā)明而言，所有的肽序列都是從N末端（最左端）至C末端（最右端）書寫 的，并且除非另有指定，所有的氨基酸都是"蛋白"氨基酸，即它們是以下氨基酸的L異構(gòu) 體：丙氨酸（A);精氨酸（R);天門冬酰胺（N);天冬氨酸（D);半胱氨酸（C);谷氨酸（E); 谷氨酰胺（Q);甘氨酸（G);組氨酸⑶；異亮氨酸（I);亮氨酸（L);賴氨酸（K);甲硫氨酸 (M);苯丙氨酸（F);脯氨酸（P);絲氨酸（S);蘇氨酸（T);色氨酸（W);酪氨酸（Y);或纈氨 酸（V)。突變SDF-I肽在此可縮寫為"mSDF-l"、"mSDF"或SDF(NqN'），其中N是原先存在的 氨基酸的單字母名稱，q是其距所述肽N末端的位置，Ν'是取代N的氨基酸。還應(yīng)當(dāng)了解， 盡管SEQ ID NO :52顯示了 SDF-Ia的完整全長序列，該序列可在C末端延伸最多至四個(gè)氨 基酸（特別是-R-F-K-M序列）。因此，本發(fā)明包括SDF-I a和SDF-I β的突變體形式（參 見US5, 563, 048)。在某些情況下，通過在N末端添加氨基酸而突變的肽簡寫為"Xp-R"，其 中所述的X是蛋白氨基酸，P是整數(shù)，R是延伸前的肽。還應(yīng)當(dāng)了解，除非另有指定，可使用 所有藥學(xué)上可接受的肽形式，包括所有藥學(xué)上可接受的鹽。
[0015] mSDF-1肽必須保持趨化活性，其敏感度（由例如在本發(fā)明所描述的Jurkat T細(xì)胞 遷移分析中獲得50%最大反應(yīng)所需的有效濃度來確定）至少為未突變SDF-I的1/10。此 夕卜，所述mSDF-1肽必須抗基質(zhì)金屬蛋白酶2 (MMP-2)切割引起的趨化活性丟失。優(yōu)選地， mSDF-1的滅活速率小于SDF-I滅活速率的1/2 (更優(yōu)選地，小于1/4或1/10)。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方式中，mSDF-1肽具有序列：K PVXLSYRCPCRFFESHV ARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKW IQEYLEKALN K(SEQ ID N0:53)，其中X是20個(gè)蛋白氨基酸中除S之外的任一蛋 白氨基酸。這些肽當(dāng)中最優(yōu)選的是SDF(S4V)，其具有序列：KPVVLSYRCPCRFF ESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDP KLKWIQEYLEKALN K(SEQ ID NO :54)。SEQ ID53 和 54 顯示了 SDF-I 肽的全長 序列。然而，應(yīng)當(dāng)理解，只要存在前8個(gè)N末端氨基酸，所述肽的截短形式將保持活性。這 些肽也是本發(fā)明的一部分，并可通過突變第4和/或5位的氨基酸使其具有蛋白酶抗性。
[0017] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，mSDF-1肽具有序列：KPVSXSYRCPCRFFESH VARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLK WIQEYLEKALN K(SEQ ID N0:55)，其中X是20個(gè)蛋白氨基酸中除L、W或E之外 的任一蛋白氨基酸。這些肽當(dāng)中最優(yōu)選的是SDF(L5P)，其具有序列：KPVSPSYRCP CRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQV CIDPKLKWIQEYLEKALN K(SEQ ID NO :56)。此夕卜，截短的并具有 SEQ ID NO :55或56的至少前8個(gè)氨基酸的肽被包括在本發(fā)明中。它們可在C末端延伸來自上面 已顯示序列的另外的氨基酸。
[0018] 上面所顯示的最長的mSDF-1肽具有68個(gè)氨基酸的長度。然而，除非另有指定，應(yīng) 當(dāng)了解可以添加另外的蛋白氨基酸至N末端而沒有實(shí)質(zhì)改變趨化活性或MMP-2抗性。此 外，N末端氨基酸的添加代表了一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，因?yàn)槠渚哂惺沟盟鲭膶?duì)第二種常見 肽酶-二肽基肽酶IV(DPPIV/⑶26,在此縮寫為"DPPIV"）的消化具有抗性的效果。
[0019] DPPIV是110-kD的糖蛋白，其在腎近端小管、腸上皮細(xì)胞、肝臟、胎盤以及肺中表 達(dá)，并且切割N末端第二位上具有脯氨酸的肽（Kikawa等，Biochim. Biophys. Actal751 : 45-51(2005))。SDF-I在第二位上具有脯氨酸（可參見上述的SEQ ID N0:52)并因而被 DPPIV在該脯氨酸和隨后的纈氨酸之間切割（Narducci等，Bloodl07 :1108-1115(2006); Christopherson, Exp. Hematol. 34 :1060-1068 (2006)) 〇
[0020] 消除DPPIV的蛋白水解作用的一個(gè)途徑是改變SDF-I第二位的脯氨酸（參見SEQ ID NO :52)。然而，這個(gè)脯氨酸是SDF-I的生物學(xué)活性所必需的，因而不能被替換并保持治 療有效的肽。但是，通過添加1到4個(gè)氨基酸（或有機(jī)基團(tuán)）至SEQ ID NO :52的N末端， 可以保持活性并制得DPPIV抗性肽。例如，已在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)DPPIV切割的抗性可通過在所 述肽N末端添加絲氨酸獲得。
[0021] 因此，在另一方面，本發(fā)明涉及肽Xp-SDF-I,其中X優(yōu)選為任何蛋白氨基酸，P是1 至Ij 4的整數(shù)，SDF-I如SEQ ID NO :52所示。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，η = 1。應(yīng)當(dāng)了解，當(dāng)P 大于1時(shí)，2-4個(gè)添加氨基酸中的每一個(gè)可分別選自于本發(fā)明所述的任意蛋白氨基酸，即這 些蛋白氨基酸的任一種可出現(xiàn)在第一位，任一種可出現(xiàn)在第二位，等等。
[0022] SDF-I也可以通過添加"蛋白酶保護(hù)性有機(jī)基團(tuán)"至N末端而獲得DPPIV抗性。本發(fā) 明的"蛋白酶保護(hù)性有機(jī)基團(tuán)"指的是非蛋白氨基酸的有機(jī)基團(tuán)，當(dāng)其添加至SDF-I的N末 端氨基酸時(shí)，導(dǎo)致修飾的肽保持至少10% (和優(yōu)選的至少50%或80%)的未修飾SDF-I的 趨化活性（由例如本發(fā)明所描述的Jurkat T細(xì)胞遷移分析來確定），此外，其被DPPIV滅活 的速率小于未修飾SDF-I滅活速率的50 % (更優(yōu)選地，速率小于25 %或10 % )。例如，X可以 是：R1-(CH2)d-,其中d是0-3的整數(shù)，R 1選自：氫（提醒：當(dāng)R1是氫時(shí)，d必須至少是1);支鏈 或直鏈的C1-C 3烷基；支鏈或直鏈的C2-C3鏈烯基；鹵素，CF3 ;-C0NR5R4 ;-C00R5 ;-C0R5 (CH2) ^NR5R4 (CH上SOR5 (CH上SO2R5, - (CH上SO2NR5R4 ;以及0R5,其中R4和R5每種獨(dú)立地是氫或 直鏈或支鏈的C1-C3烷基。在有機(jī)基團(tuán)用于X的情況下，p應(yīng)當(dāng)是1。此外，X可表示上面所 討論的蛋白氨基酸，從而1-4個(gè)氨基酸被添加至SDF-I，并且這些添加的氨基酸中的一個(gè)或 多個(gè)可被蛋白酶保護(hù)性有機(jī)基團(tuán)所替換。
[0023] 在通式Xp-SDF-I中，SDF-I可選地包括上述SEQ ID NO :52的第四位和/或第五位 上的任意突變。因此，本發(fā)明包含Xp-HiSDF-I形式的肽，其中X和p如上所述，并且mSDF-1 選自：SEQ ID NO :53 ;SEQ ID NO :54 ;SEQ ID NO :55 ;和 SEQ ID NO :56。這些雙突變肽可抵 抗DPPIV 和 MMP-2。
[0024] 本發(fā)明也包含融合蛋白，其中上述mSDF-1、Xp-SDF-I或XpHSDF-I序列中的任一種 被連接至可形成生物相容性膜的自組裝肽?？梢詫⒄掣搅说鞍酌缚剐許DF-I的膜植入患者 的組織損傷部位，特別是心臟組織損傷、創(chuàng)傷（無論是意外、手術(shù)還是疾病的結(jié)果）或潰瘍 部位，并且所述膜在該部位長時(shí)期地保持SDF-I生物學(xué)活性。通過將蛋白酶抗性SDF-I肽 的C末端直接連接至自組裝肽的N末端形成融合蛋白，或兩個(gè)肽可通過連接序列連接。因 此，本發(fā)明包括具有以下通式的融合蛋白：A- (L) n_ (R),，其中N是0-3的整數(shù)，q是1-3的整 數(shù)，A是上述蛋白酶抗性SDF-I肽（即，mSDF-l、Xp-SDF-l或Xp-mSDF-l)中的一種，L是3-9 個(gè)氨基酸長的連接序列，和R是選自下列的自組裝肽：
[0025] AKAKAEAEAKAKAEAE, (SEQ ID N0:1)；
[0026] AKAEAKAEAKAEAKAE, (SEQ ID NO :2)；
[0027] EAKAEAKAEAKAEAKA, (SEQ ID NO :3)；
[0028] KAEAKAEAKAEAKAEA, (SEQ ID NO :4)；
[0029] AEAKAEAKAEAKAEAK, (SEQ ID NO :5)；
[0030] ADADARARADADARAR, (SEQ ID NO :6)；
[0031] ARADARADARADARAD, (SEQ ID NO :7)；
[0032] DARADARADARADARA, (SEQ ID NO :8)；
[0033] RADARADARADARADA, (SEQ ID NO :9)；
[0034] ADARADARADARADAR, (SEQ ID NO:10)；
[0035] ARADAKAEARADAKAE, (SEQ IDNO:11)；
[0036] AKAEARADAKAEARAD, (SEQ ID NO:12)；
[0037] ARAKADAEARAKADAE, (SEQ ID NO:13)；
[0038] AKARAEADAKARADAE, (SEQ ID NO:14)；
[0039] AQAQAQAQAQAQAQAQ, (SEQ ID NO:15)；
[0040] VQVQVQVQVQVQVQVQ, (SEQ ID NO:16)；
[0041] YQYQYQYQYQYQYQYQ, (SEQ ID NO:17)；
[0042] HQHQHQHQHQHQHQHQ, (SEQ ID NO:18)；
[0043] ANANANANANANANAN, (SEQ ID NO:19)；
[0044] VNVNVNVNVNVNVNVN, (SEQ ID NO :20)；
[0045] YNYNYNYNYNYNYNYN, (SEQ ID NO:21)；
[0046] HNHNHNHNHNHNHNHN, (SEQ ID NO :22)；
[0047] ANAQANAQANAQANAQ, (SEQ ID NO :23)；
[0048] AQANAQANAQANAQAN, (SEQ ID NO :24)；
[0049] VNVQVNVQVNVQVNVQ, (SEQ ID NO :25)；
[0050] VQVNVQVNVQVNVQVN, (SEQ ID NO :26)；
[0051] YNYQYNYQYNYQYNYQ, (SEQ ID NO :27)；
[0052] YQYNYQYNYQYNYQYN, (SEQ ID NO :28)；
[0053] HNHQHNHQHNHQHNHQ, (SEQ ID NO :29)；
[0054] HQHNHQHNHQHNHQHN, (SEQ ID NO :30)；
[0055] AKAQADAKAQADAKAQAD, (SEQ ID NO:31)；
[0056] VKVQVDVKVQVDVKVQVD, (SEQ ID NO :32)；
[0057] YKYQYDYKYQYDYKYQYD, (SEQ ID NO :33)；
[0058] HKHQHDHKHQHDHKHQHD, (SEQ ID NO :34)；
[0059] RARADADARARADADA, (SEQ ID NO :35)；
[0060] RADARGDARADARGDA, (SEQ ID NO :36)；
[0061] RAEARAEARAEARAEA, (SEQ ID NO :37)；
[0062] KADAKADAKADAKADA, (SEQ ID NO :38)；
[0063] AEAEAHAHAEAEAHAH, (SEQ ID NO :39)；
[0064] FEFEFKFKFEFEFKFK, (SEQ ID NO :40)；
[0065] LELELKLKLELELKLK, (SEQ ID NO:41)；
[0066] AEAEAKAKAEAEAKAK, (SEQ ID NO :42)；
[0067] AEAEAEAEAKAK, (SEQ ID NO:43)；
[0068] KAKAKAKAEAEAEAEA, (SEQ ID NO :44)；
[0069] AEAEAEAEAKAKAKAK, (SEQ ID NO :45)；
[0070] RARARARADADADADA, (SEQ ID NO :46)；
[0071] ADADADADARARARAR, (SEQ ID NO :47)；
[0072] DADADADARARARARA, (SEQ ID NO :48)；
[0073] HEHEHKHKHEHEHKHK, (SEQ ID NO :49)；
[0074] VEVEVEVEVEVEVEVEVEVE，（SEQ ID N0:50);和
[0075] RFRFRFRFRFRFRFRFRFRF, (SEQ ID NO:51).
[0076] 最優(yōu)選的自組裝肽是：RARADADARARADADA，（SEQ ID NO :35)，q = I ;并且優(yōu)選的 蛋白酶抗性SDF-I肽是SDF(S4V)以及XP-SDF(S4V)，特別地p = l。當(dāng)連接到一起時(shí)，獲得 的融合蛋白是，為方便起見，縮寫為SDF(S4V)-RAD或XP-SDF(S4V)-RAD。當(dāng)n = 1并且L是 GGGGGG(縮寫為 "6G"，SEQ ID N0:57) ;GIVGPL(SEQ ID Ν0:58)和 PVGLIG(SEQ ID Ν0:59) 時(shí)產(chǎn)生優(yōu)選的連接序列。最后的代表了 ΜΜΡ-2切割位點(diǎn)（"MCS")。GIVGPL(SEQ ID NO :58) 代表了 MCS的雜亂（scrambled)形式，縮寫為"SCR"。令人驚奇的是，該序列也被發(fā)現(xiàn)經(jīng)受 MMP-2切割，盡管其速率低于MCS。優(yōu)選地，包含連接序列的融合蛋白是：SDF(S4V)-6G-RAD ; Xp-SDF(S4V)-6G-RAD ;SDF(S4V)-MCS-RAD ;Xp-SDF(S4V)-MCS-RAD ;SDF(S4V)-SCR-RAD ;以及 XP-SDF (S4V) -SCR-RAD。此外，P 優(yōu)選為 1。
[0077] 在另一方面，本發(fā)明涉及核酸（其包含編碼任意上述蛋白酶抗性肽或融合蛋白的 核苷酸序列），載體（其中這些核酸被可操作地連接至啟動(dòng)子序列）和宿主細(xì)胞（用所述載 體轉(zhuǎn)化）。術(shù)語"可操作地連接"指的是遺傳元件以允許其行使正常功能的方式連接。例如， 當(dāng)所述肽的轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子的控制下并且產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物被正確地翻譯為所述肽時(shí)，編碼肽的 序列被可操作地連接至啟動(dòng)子。
[0078] 優(yōu)選的編碼蛋白酶抗性SDF-I肽以及融合蛋白的核酸包括：
[0079] aagcccgtcgtcctgagctacagatgcccatgccgattcttcgaaagccatgttgccagagccaacgtc aagcatctcaa aattctcaacactccaaactgtgcccttcagattgtagcccggctgaagaacaacaacagacaag tgtgcattgacccga agctaaaagtggattcaggagtacctggagaaagctttaaacaag(SEQ ID NO:60)；
[0080] aagcccgtcgtcctgagctacagatgcccatgccgattcttcgaaagccatgttgccagagccaacgtc aagcatctcaa aattctcaacactccaaactgtgcccttcagattgtagcccggctgaagaacaacaacagacaag tgtgcattgacccga agctaaagtggattcaggagtacctggagaaagctttaaacaagtgaggaatcgtgggacc tctgcgtgcccgtgccga cgccgacgcccgtgcccgtgccgacgccgacgcc(SEQ ID NO:61)；
[0081] aagcccgtcgtcctgagctacagatgcccatgccgattcttcgaaagccatgttgccagagccaacgtc aagcatctcaa aattctcaacactccaaactgtgcccttcagattgtagcccggctgaagaacaacaacagacaag tgtgcattgacccga agctaaagtggattcaggagtacctggagaaagctttaaacaagcctgtgggactgatcgg agtgcccgtgccgacgcc gacgcccgtgcccgtgccgacgccgacgcc(SEQ ID NO:62);和
[0082] aagcccgtcgtcctgagctacagatgcccatgccgattcttcgaaagccatgttgccagagccaacgtc aagcatctcaa aattctcaacactccaaactgtgcccttcagattgtagcccggctgaagaacaacaacagacaag tgtgcattgacccga agctaaagtggattcaggagtacctggagaaagctttaaacaagggaggcgggggaggtgg gcgtgcccgtgccgac gccgacgcccgtgcccgtgccgacgccgacgcc (SEQ ID NO:63)
[0083] 在另一方面，本發(fā)明涉及已公開的美國申請(qǐng)20060148703和20060088510描述的 自組裝肽所形成的生物相容性膜，其具有粘附的mSDF-l、X p-SDF-I或Xp-HiSDF-I肽。術(shù)語 "生物相容性"指的是膜是無毒的并可植入患者體內(nèi)而不引發(fā)免疫反應(yīng)。〇. 1%到10%之間 (和優(yōu)選0.5-5% )的組裝成膜的肽結(jié)合突變的SDF-1。結(jié)合可以是共價(jià)或非共價(jià)的。當(dāng) 蛋白酶抗性SDF-I肽簡單地捕獲入膜基質(zhì)以及當(dāng)?shù)鞍酌缚剐許DF-I肽通過生物素/抗生物 素蛋白連接結(jié)合至膜內(nèi)的自組裝肽時(shí)，發(fā)生非共價(jià)結(jié)合。如本發(fā)明所述，術(shù)語"抗生物素蛋 白"旨在包括鏈霉抗生物素蛋白。所述的膜可選地具有也是粘附的其它治療劑，如TOGF或 白細(xì)胞介素8。
[0084] 用于連接分子的生物素和抗生物素蛋白的應(yīng)用是本領(lǐng)域所熟知的，并且可應(yīng)用標(biāo) 準(zhǔn)方法，在膜形成之前或之后，將蛋白酶抗性SDF-I肽粘附至自組裝肽。用生物素/抗生物 素蛋白與自組裝膜連接的特定方法描述于US20060088510并且該方法可應(yīng)用于形成具有 粘附的細(xì)胞因子的膜。為避免生物素/抗生物素蛋白基團(tuán)與蛋白酶抗性肽之間的位阻影 響，兩者間可包含間隔區(qū)。間隔區(qū)可采取1-15(優(yōu)選1-10)個(gè)脂肪酸或1-15(優(yōu)選1-10) 個(gè)氨基酸的形式，并將蛋白酶抗性SDF-I肽與自組裝肽分隔開至少另外的12埃以及至多不 超過另外的250埃。摻入這種類型的間隔區(qū)的方法是本領(lǐng)域所熟知的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方式中，約1 %的用于膜內(nèi)的自組裝肽被粘附至蛋白酶抗性SDF-I肽。還優(yōu)選的是，組成膜 的自組裝肽是均質(zhì)的，即所有肽是相同的。
[0085] 作為另一種選擇，蛋白酶抗性SDF-I肽可通過肽鍵連接至膜部分的自組裝肽，即 蛋白酶抗性SDF-I肽可以是融合蛋白的一部分，其直接或通過插入的連接氨基酸序列連 接至自組裝肽?？墒褂萌我馍鲜龅娜诤系鞍?，SDF(S4V)-6G-RAD ;Xp-SDF(S4V)-6G-RAD ; SDF (S4V)-MCS-RAD ;XP-SDF(S4V)-MCS-RAD ;SDF (S4V)-SCR-RAD 和 Xp-SDF (S4V)-SCR-RAD 是 特別優(yōu)選的。所述的膜由融合蛋白（或自組裝肽）制備，利用了這樣的事實(shí)：本發(fā)明所述的 自組裝肽在水中不會(huì)聚集在一起，但在低濃度單價(jià)金屬陽離子存在的條件下組裝成膜。因 此，例如，融合蛋白可在自組裝不會(huì)發(fā)生的條件下制備，然后暴露在促進(jìn)膜形成的條件下， 如低濃度單價(jià)金屬離子。最終獲得可植入患者體內(nèi)的基質(zhì)，并且其在植入部位保持高濃度 的SDF-I生物學(xué)活性?；蛘?，融合蛋白可在單價(jià)陽離子濃度太低而不能誘導(dǎo)自組裝的情況 下?lián)饺肟勺⑸渌幬锝M合物，然后施用給患者以誘導(dǎo)體內(nèi)的膜形成。
[0086] 突變的SDF-I肽抵抗MMP-2和/或DPPIV的切割但保持天然SDF-I的至少部分 (至少10 %，優(yōu)選超過25 %、50 %或80 % )趨化活性。因此，它們理想地適合在諸如損傷 的心臟組織的部位應(yīng)用，其中MMP-2(或DPPIV)以高濃度存在。此外，MMP-2切割位點(diǎn)可以 (如果需要）置于連接SDF-I肽至自組裝肽的連接區(qū)域內(nèi)。這將使得蛋白酶抗性SDF-I肽 隨時(shí)間從移植的膜釋放。
[0087] 上面所描述的組合物在治療任何以高濃度的MMP-2和/或DPPIV為特征的疾病或 狀況中都應(yīng)當(dāng)是有效的，其中對(duì)干細(xì)胞的吸引可能誘導(dǎo)再生或痊愈。這包括了炎癥以及缺 血性疾病諸如中風(fēng)、肢體缺血、傷口愈合以及糖尿病潰瘍的治療。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方 式中，本發(fā)明涉及治療損傷的心臟組織的方法，例如在心臟病發(fā)作之后，通過在損傷部位或 其附近注射或植入任意上述的生物相容性膜或融合蛋白。優(yōu)選地，將膜直接注射或植入患 者的損傷組織，如心肌。膜應(yīng)當(dāng)足夠大以防止蛋白酶抗性SDF-I被體液洗脫，并應(yīng)當(dāng)存在足 夠量的mSDF-1以促進(jìn)T細(xì)胞遷移至損傷部位。關(guān)于這些參數(shù)的指導(dǎo)由本文描述的實(shí)驗(yàn)提 供。

【具體實(shí)施方式】
[0088] 本發(fā)明基于通過將損傷組織（如損傷的心臟組織）暴露給SDF-I從而促進(jìn)損傷組 織恢復(fù)的概念，所述的SDF-I已突變使得其抵抗MMP-2和/或DPPIV切割，并且其通過自發(fā) 組裝肽形成的膜遞送。所述自組裝肽已在US5, 670, 483和6, 548, 630中描述（在此通過引 用整體并入）。將因子粘附至膜的方法以及所述膜在遞送治療劑至心臟組織中的用途也已 描述（參見已公開的美國申請(qǐng)20060148703和20060088510,在此通過引用整體并入）。制 備和使用膜的同樣步驟可應(yīng)用于本發(fā)明。
[0089] 自鉬裝狀的描沭
[0090] 用于自組裝的肽應(yīng)當(dāng)是至少12個(gè)殘基長，并含有交替的疏水氨基酸和親水氨基 酸。長于約200個(gè)氨基酸的肽趨于存在有關(guān)溶解度和膜穩(wěn)定性的問題，因而應(yīng)當(dāng)避免。理 想地，肽應(yīng)當(dāng)是約12-24個(gè)氨基酸長度。
[0091] 自組裝肽必須是互補(bǔ)的。這意味著一條肽上的氨基酸必須具有與另一條肽上的氨 基酸形成離子鍵或氫鍵的能力。離子鍵可在酸性氨基酸側(cè)鏈和堿性氨基酸側(cè)鏈間形成。親 水堿性氨基酸包括Lys、Arg、HiS和Orn。親水酸性氨基酸是Glu和Asp。離子鍵可在一條 肽的酸性殘基和另一條肽的堿性殘基間形成。形成氫鍵的氨基酸是Asn和Gin。可摻入肽 內(nèi)的疏水性氨基酸包括 Ala、Val、lie、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr 和 Gly。
[0092] 自組裝肽也必須是"結(jié)構(gòu)相容"的。這意味著它們?cè)诮Y(jié)合的時(shí)候必須彼此間保持 基本恒定的距離。通過計(jì)算每對(duì)離子鍵或氫鍵中每個(gè)氨基酸側(cè)鏈上非分支原子的總數(shù)，可 計(jì)算每對(duì)離子鍵或氫鍵的肽間距離。例如，賴氨酸在側(cè)鏈上具有五個(gè)、谷氨酸在側(cè)鏈上具 有四個(gè)非分支原子。這些不同肽上的兩個(gè)殘基間的相互作用將導(dǎo)致9個(gè)原子的肽間距離。 在一個(gè)僅包含EAK重復(fù)單元的肽內(nèi)，所有的離子對(duì)涉及賴氨酸和谷氨酸，因而恒定的肽間 距離將被保持。因此，這些肽將是結(jié)構(gòu)上互補(bǔ)的。肽間距離的變化超過一個(gè)原子（約3-4 埃）的肽不能正確形成凝膠。例如，如果兩個(gè)結(jié)合肽具有9原子間距的離子對(duì)以及7原子 間距的其他離子對(duì)，這就沒有滿足結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性需求。互補(bǔ)性和結(jié)構(gòu)相容性的完整討論可在 U. S. 5, 670, 483 和 6, 548, 630 中找到。
[0093] 還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到膜可以由肽的均質(zhì)混合物和肽的非均質(zhì)混合物形成。本文中的術(shù)語 "均質(zhì)"的意思是肽彼此之間相同。"非均質(zhì)"表明肽結(jié)合至另一個(gè)結(jié)構(gòu)不同的肽上。不管 采用的是均質(zhì)還是非均質(zhì)的肽，關(guān)于氨基酸的排列、長度、互補(bǔ)性以及結(jié)構(gòu)相容性的要求都 是適用的。此外，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到肽末端殘基的羧基和氨基基團(tuán)可以采用標(biāo)準(zhǔn)基團(tuán)保護(hù)，也可以 不保護(hù)。
[0094] 狀的制各
[0095] 本發(fā)明的自組裝和蛋白酶抗性SDF-I肽可采用標(biāo)準(zhǔn)N-叔丁氧羰基（t-Boc)化學(xué) 固相肽合成以及采用η-甲基吡咯烷酮化學(xué)循環(huán)來制備。一旦肽被合成，它們可采用諸如在 反相色譜柱上的高壓液相色譜（HPLC)步驟來純化。也可以通過HPLC評(píng)估純度，并且，正確 組合物的存在可通過氨基酸分析確定。用于mSDF-1肽的合適純化步驟描述在實(shí)施例部分。 [0096] 融合蛋白可以是化學(xué)合成或采用重組DNA技術(shù)制備。本發(fā)明描述了這些蛋白的全 長序列，并提供可用于產(chǎn)生這些蛋白的DNA序列的實(shí)例。
[0097] SDF-I結(jié)合至自纟目裝狀
[0098] 幾種策略可用于將蛋白酶抗性SDF-I粘附至自組裝肽。一個(gè)策略是先前已經(jīng) 顯示對(duì)于遞送I 3DGF-BB(-種生長因子）至組織有效的非共價(jià)結(jié)合（Hsieh等，J. Clin. Invest. 116 :237-248(2006))。
[0099] 第二種粘附策略是生物素夾心（biotin-sandwich)方法（Davis,等，？1"〇(：· Nat' IAcad. Sci. USA103 :8155-8160(2006)),其中所述的蛋白酶抗性SDF-I是生物素化的， 并采用四價(jià)鏈霉抗生物素蛋白作為連接體連接至生物素化的肽。為實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)，蛋白酶抗 性SDF-I可偶聯(lián)到用于生物素化的受體肽的15個(gè)氨基酸的序列（稱為AP ;Chen等，Nat. Methods2 :99-104(2005))。由于SDF-I的活性位點(diǎn)位于靠近氨基末端的位置，融合蛋白應(yīng) 當(dāng)通過在C末端摻入額外的序列來制備。受體肽序列允許通過大腸桿菌酶生物素連接酶的 位點(diǎn)特異生物素化（BirA ;Chen等，Nat. Methods2 :99-104(2005))。許多商業(yè)化的試劑盒 可用于生物素化蛋白質(zhì)。然而，許多這樣的試劑以非特異的方式生物素化賴氨酸殘基，這可 能降低mSDF-1的活性，因?yàn)橐炎C實(shí)SDF-I的N末端賴氨酸對(duì)于受體結(jié)合以及活性是關(guān)鍵性 的（Crump等，EMBO J. 16 :6996-7007(1997))。生物素化的自組裝肽由MIT生物聚合體實(shí)驗(yàn) 室制備，并且，當(dāng)與天然自組裝肽以1到100的比例混合時(shí)，納米纖維的自組裝不應(yīng)受干擾 (Davis 等，Proc. Nat，IAcid. Sci. USA103 :8155-8160(2006))。
[0100] 第三種目標(biāo)策略是通過構(gòu)建突變SDF-I與自組裝肽的融合蛋白，將蛋白酶抗性 SDF-I肽直接摻入自組裝納米纖維中。例如，mSDF-1可偶聯(lián)至SEQ ID NO :35的16個(gè)氨基 酸的序列。融合蛋白的這個(gè)"RAD"部分將在組裝時(shí)摻入納米纖維支架。
[0101] 臘的形成
[0102] 本發(fā)明所述的自組裝肽和融合蛋白不會(huì)在水中形成膜，但在低濃度單價(jià)金屬陽離 子存在時(shí)自組裝。這些陽離子的有效性順序是Li+ > Na+ > K+ > Cs+(U. S. 6, 548, 630)。5mM 濃度的單價(jià)陽離子對(duì)于肽自組裝是足夠的，并且高至5M的濃度仍然是有效的。與單價(jià)金屬 陽離子締合的陰離子對(duì)本發(fā)明來說不是關(guān)鍵的，其可以是乙酸鹽、氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽 等等。
[0103] 自組裝肽的起始濃度將影響形成的膜的最終大小和厚度。通常情況下，肽的濃度 越高，膜形成的程度也越高。形成可發(fā)生在肽濃度低至〇.5mM或lmg/ml時(shí)。然而，膜優(yōu)選 在更高的肽起始濃度形成，如l〇mg/ml，以促進(jìn)更好的操縱特性?？偟膩碚f，通常情況下，將 肽加入鹽溶液比將鹽加入肽溶液能更好地形成膜。
[0104] 膜的形成相對(duì)不受pH值和溫度的影響。然而，pH值應(yīng)當(dāng)保持在12以下并且溫度 通常應(yīng)當(dāng)在4-90°C的范圍內(nèi)。等于或大于IOOmM的二價(jià)金屬陽離子導(dǎo)致不正確的膜形成， 因而應(yīng)當(dāng)避免。類似地，應(yīng)當(dāng)避免0. 1%或更高濃度的十二烷基硫酸鈉。
[0105] 膜形成可通過簡單的目測(cè)來觀察，如果需要，可用諸如剛果紅（Congo Red)的染料 輔助。膜的完整性也可用顯微鏡觀察，染色或不需要染色。
[0106] 藥物纟目合物和劑量
[0107] 粘附蛋白酶抗性SDF-I肽或融合蛋白的膜可摻入包含有載體的藥物組合物，所述 載體諸如鹽、水、林格氏液（Ringer's solution)以及其它試劑或賦型劑。劑型通常被設(shè)計(jì) 用于移植或注射，特別是進(jìn)入心臟組織的，但局部治療也會(huì)有效，例如在創(chuàng)傷治療中。所有 劑型可采用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的方法制備（參見例如，Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16th ed. A. Oslo. ed. , Eason, PA (1980)) 〇
[0108] 預(yù)期那些熟練的從業(yè)者將根據(jù)具體案情采用臨床醫(yī)學(xué)已良好建立的方法調(diào)整劑 量。最佳劑量由本領(lǐng)域已知的方法確定，并受一些諸如患者年齡、疾病狀態(tài)以及其它臨床相 關(guān)因素的影響。
[0109] 實(shí)施例
[0110] 實(shí)施例I =SDF-I突變體的生物學(xué)效果和蛋白酶抗性
[0111] SDF-I鈍化和表汰
[0112] 成熟SDF-I α的DNA序列可從人cDNA克隆入pET-Sumo載體，并且可摻入額外的N 末端絲氨酸殘基以有利于Sumo蛋白酶切割（生成69個(gè)氨基酸形式的SDF-1)。融合蛋白可 通過在反轉(zhuǎn)錄引物中摻入RAD或AP序列而制備。Sumo-SDF-I融合蛋白可在Rosetta DE3 大腸桿菌中表達(dá)，并在37°C生長至1. 5的光密度（600nm)。細(xì)胞以0. 25mM異丙基β -D-硫 代半乳糖苷誘導(dǎo)4小時(shí)，并通過離心收獲。如下面所述，SDF-Ia可以通過3步法純化，所 有步驟在21°C實(shí)施。
[0113] 來自4-L生長物的細(xì)胞在300mi裂解緩沖液（6M胍，20mM磷酸鹽（pH7. 8)，500mM NaCl)中裂解和勻漿。通過3000g離心收集碎片。第一個(gè)純化步驟由以鎳-NTA捕獲存在于 Sumo-SDF-Ια融合蛋白中的多聚組氨酸標(biāo)簽組成。鎳-NTA樹脂以洗滌緩沖液（8M尿素， 500mM NaCl，20mM磷酸鹽（pH6. 2))洗漆，結(jié)合的蛋白在pH4洗脫。進(jìn)一步的純化和氧化重 折疊在陽離子交換HPLC色譜柱上實(shí)施。將樣品調(diào)節(jié)至結(jié)合緩沖液（8M尿素，30mM2-巰基 乙醇，ImM EDTA，50mM Tris pH8)，并加載在HPLC色譜柱上。Sumo-SDF-I的重折疊在色譜 柱上通過運(yùn)行2小時(shí)重折疊緩沖液（50mM Tris pH8,75mM NaCl，0. ImM還原型谷胱甘肽以 及0. ImM氧化型谷胱甘肽）進(jìn)行。Sumo-SDF-I通過分級(jí)梯度（0. 5至IM NaCl)洗脫和濃 縮。SUM0-SDF-1 融合蛋白在 50mM Tris pH8. 0、500mM NaCl 中被 Sumo 蛋白酶 I (1U/50 μ g 蛋白）切割。將樣品調(diào)節(jié)至〇. I %的三氟醋酸（TFA)并加載在C18反相HPLC色譜柱上用 于最后的純化步驟。色譜柱經(jīng)受從30%至40%的乙腈（溶于0.1% TFA)線性梯度。包含 SDF-I的部分被凍干和重懸。純化SDF-I的活性通過Jurkat T淋巴細(xì)胞系的遷移來測(cè)試。
[0114] SDF-I構(gòu)律物的修飾
[0115] SDF-I融合構(gòu)建物通過三個(gè)序列中的一個(gè)序列的插入性突變而修飾：一個(gè)序列對(duì) MMP-2切割（MMP切割位點(diǎn)或MCS)敏感，另一個(gè)序列包含相同氨基酸但其處于隨機(jī)順序（雜 亂（scrambled)序列或SCR)，第三個(gè)序列包含6個(gè)甘氨酸作為連接體。
[0116] 趨化閔子中的MMP切割位點(diǎn)突奪
[0117] SDF-I在其N末端的活性位點(diǎn)被MMP-2切害I]，得到N末端四肽以及滅活的 SDF-I (5-68)。為給SDF-I提供對(duì)MMP-2切割的抗性，進(jìn)行四個(gè)不同氨基酸的特異性突變， 其基于 Netzel-Arnett 等所描述的 MMP-2 底物序列（Biochemtstry32 :6427-6432 (1993))。 這四個(gè)不同的構(gòu)建物如上述用于SDF-I的方式表達(dá)和純化。在四個(gè)不同的突變中， SDF-I (L5W)和SDF-I (L5E)顯示了最小的對(duì)于T細(xì)胞遷移的活性。相比之下，SDF-I (S4V) 和SDF-I (L5P)顯示了與天然SDF-I相當(dāng)?shù)纳锘钚?。因?yàn)镾DF-I (L5P)更難純化，選擇 SDF-I (S4V)用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。
[0118] 突奪對(duì)蛋白酶敏感件以及趨化活件的影響
[0119] 在Jurkat T細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中以IOOnM的濃度檢測(cè)SDF-I的突變形式。該實(shí)驗(yàn)顯 示SDF-I (S4V)和SDF-I (L5P)均保留未突變SDF-I在促進(jìn)T細(xì)胞遷移上的大部分活性。這 種活性在SDF-I (L5W)突變體和SDF-I (L5E)突變體中大大減小。
[0120] 所述肽對(duì)MMP-2切割的敏感性通過突變體與酶孵育1小時(shí)、然后通過SDS-PAGE來 檢測(cè)孵育產(chǎn)物而確定。這個(gè)檢測(cè)揭示了，不同于SDF-1，所述突變體未經(jīng)歷指示切割的位置 轉(zhuǎn)移。如Jurkat T細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)所顯示的那樣，發(fā)現(xiàn)MMP-2孵育減少SDF-I的趨化活性，但 不影響SDF-I (S4V)。這些結(jié)果提示SDF-I的S4V變體保留趨化因子生物活性但抵抗MMP-2 的活化。
[0121] 體內(nèi)數(shù)據(jù)
[0122] 進(jìn)行盲隨機(jī)研究以評(píng)估大鼠心肌梗塞后不同的SDF-I形式對(duì)心臟功能的影響。以 用于測(cè)量心室內(nèi)壓力以及心室容量的Millar導(dǎo)管系統(tǒng)測(cè)量射血分?jǐn)?shù)。與僅有MI的群體相 t匕，在大鼠心肌梗塞四周后，SDF-I (S4V)-6G-RAD和SDF-I (S4V)-MCS-RAD都顯著地提高心 臟的功能。這提示，MMP-2抗性（SDF-1(S4V))和粘附至膜是成功的心臟修復(fù)治療所必需的。
[0123] 實(shí)施例2 :SDF_1截短形式的實(shí)驗(yàn)
[0124] SDF-I的3個(gè)截短形式是商業(yè)合成的；都包括天然SDF-I的前17個(gè)氨基酸。 SDF-117氨基酸的兩種突變體被設(shè)計(jì)為具有更強(qiáng)的MMP-2抗性，其基于我們之前有關(guān)完整 SDF-I蛋白的工作：
[0125] SDF-117AA:
[0126] KPVSLSYRCPCRFFESH(SEQ ID 64)
[0127] SDF-I (S4V)17AA:
[0128] KPVVLSYRCPCRFFESH(SEQ ID 65)
[0129] SDF-1(L5P)17AA:
[0130] KPVSPSYRCPCRFFESH(SEQ ID 66)
[0131] 遷移實(shí)驗(yàn)通過Jurkat T淋巴細(xì)胞系完成。截短的SDF-I 17AA的效力是天然SDF-I 的1/500,但誘導(dǎo)的最大遷移與天然SDF-I相似。因此，如果用與全長蛋白相比500倍的濃 度，應(yīng)當(dāng)觀察到相同的T淋巴細(xì)胞遷移反應(yīng)。突變的SDF-I (S4V) 17AA和SDF-I (L5P) 17AA 的效力是沒有突變的SDF-117AA的1/3。這是一種與天然SDF-I和SDF-I (S4V)之間所見的 相似改變。
[0132] 利用MMP-2對(duì)所述肽進(jìn)行切割實(shí)驗(yàn)：2nmole的SDF-117AA、SDF-I (S4V) 17AA和 SDF-1(L5P)17AA與MMP-2在RT孵育1小時(shí)。蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上運(yùn)行，顯示了 SDF-I 17AA 的切割，但沒有SDF-I (S4V) 17AA或SDF-I (L5P) 17AA的切割。因此，這些截短的蛋白質(zhì)是治 療有效的，因?yàn)樗麄內(nèi)允巧锘钚缘牟⑶乙彩荕MP-2抗性的。
[0133] 本發(fā)明所引用的文獻(xiàn)通過引用完全并入?，F(xiàn)已對(duì)本發(fā)明做了完全的描述，本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明可在條件、參數(shù)等等的廣泛和等同范圍內(nèi)實(shí)施，而不影響本發(fā)明 或其任意實(shí)施方式的精神或范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種分離的突變基質(zhì)細(xì)胞衍生因子I(SDF-I)肽，包括通式mSDF-1或Xp-mSDF-l，其 中所述SDF-I是包含SEQ ID NO: 52的至少氨基酸1-8的氨基酸序列的肽，并且其任選在C 末端延伸SEQ ID NO:52的剩余序列的全部或任意部分，所述SEQ ID NO:52的剩余序列如 氨基酸9-68所示，并且其中： a) X是蛋白氨基酸或蛋白酶保護(hù)性有機(jī)基團(tuán)； b) p是1至Ij 4之間的整數(shù)； c) mSDF-1是包含所述SDF-I N末端的第四和/或第五位氨基酸突變的所述SDF-I的 突變形式，其中mSDF-1具有對(duì)T細(xì)胞的趨化活性，并且其被基質(zhì)金屬蛋白酶2 (MMP-2)滅 活的速率低于天然SDF-I肽滅活速率的二分之一；和 d) Xp-HiSDF-I是包含所述SDF-I N末端的第四和/或第五位氨基酸突變的所述SDF-I 的突變形式，其中Xp-HiSDF-I具有對(duì)T細(xì)胞的趨化活性，其被二肽基肽酶IV (DPPIV)滅活的 速率低于天然SDF-I滅活速率的二分之一，并且其被MMP-2滅活的速率低于天然SDF-I滅 活速率的二分之一。
2. 權(quán)利要求1的分離的突變SDF-I肽，包含所述mSDF-1肽或所述Xp-HiSDF-I肽，其中 所述mSDF-1肽或所述X pHSDF-I肽： a) 包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列； b) 保持對(duì)T細(xì)胞的趨化活性，其為天然SDF-I的至少10% ;和 c) 被MMP-2滅活的速率低于天然SDF-I滅活速率的四分之一。
3. 權(quán)利要求1的分離的突變SDF-I肽，包含所述mSDF-1肽或所述Xp-HiSDF-I肽的通式， 其中所述mSDF-1肽或所述X p-mSDF-l肽： a) 包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列； b) 保持對(duì)T細(xì)胞的趨化活性，其為天然SDF-I的至少10% ;和 c) 被MMP-2滅活的速率低于天然SDF-I滅活速率的四分之一。
4. 包含通式A-(L)n-(R)q的融合蛋白，其中：A是權(quán)利要求1的分離的突變SDF-I肽，η 是0-3的整數(shù)，q是1-3的整數(shù)，L是3-9個(gè)氨基酸的連接序列，和R是選自下列的自組裝 肽：AKAKAEAEAKAKAEAE (SEQ ID NO: 1); AKAEAKAEAKAEAKAE (SEQ ID NO: 2); EAKAEAKAEAKAEAKA (SEQ ID NO: 3); KAEAKAEAKAEAKAEA (SEQ ID NO: 4); AEAKAEAKAEAKAEAK (SEQ ID NO: 5); ADADARARADADARAR (SEQ ID NO: 6); ARADARADARADARAD (SEQ ID NO: 7); DARADARADARADARA (SEQ ID NO: 8); ADARADARADARADAR (SEQ ID NO: 10); ARADAKAEARADAKAE (SEQ ID NO: 11); AKAEARADAKAEARAD (SEQ ID NO: 12); ARAKADAEARAKADAE (SEQ ID NO: 13); AKARAEADAKARADAE (SEQ ID NO: 14); AQAQAQAQAQAQAQAQ (SEQ ID NO: 15); VQVQVQVQVQVQVQVQ (SEQ ID NO: 16); YQYQYQYQYQYQYQYQ (SEQ ID NO: 17); HQHQHQHQHQHQHQHQ (SEQ ID NO: 18); ANANANANANANANAN (SEQ ID NO: 19); VNVNVNVNVNVNVNVN (SEQ ID NO: 20); YNYNYNYNYNYNYNYN (SEQ ID NO: 21); HNHNHNHNHNHNHNHN (SEQ ID NO: 22); ANAQANAQANAQANAQ (SEQ ID NO: 23); AQANAQANAQANAQAN (SEQ ID NO: 24); VNVQVNVQVNVQVNVQ (SEQ ID NO: 25); VQVNVQVNVQVNVQVN (SEQ ID NO: 26); YNYQYNYQYNYQYNYQ (SEQ ID NO: 27); YQYNYQYNYQYNYQYN (SEQ ID NO: 28); HNHQHNHQHNHQHNHQ (SEQ ID NO: 29); HQHNHQHNHQHNHQHN (SEQ ID NO: 30); AKAQADAKAQADAKAQAD (SEQ ID NO: 31); VKVQVDVKVQVDVKVQVD (SEQ ID NO: 32); YKYQYDYKYQYDYKYQYD (SEQ ID NO: 33); HKHQHDHKHQHDHKHQHD (SEQ ID NO: 34); RADARGDARADARGDA (SEQ ID NO: 36); RAEARAEARAEARAEA (SEQ ID NO: 37); KADAKADAKADAKADA (SEQ ID NO: 38); AEAEAHAHAEAEAHAH (SEQ ID NO: 39); FEFEFKFKFEFEFKFK (SEQ ID NO: 40); LELELKLKLELELKLK (SEQ ID NO: 41); AEAEAKAKAEAEAKAK (SEQ ID NO: 42); AEAEAEAEAKAK (SEQ ID NO: 43); KAKAKAKAEAEAEAEA (SEQ ID NO: 44); AEAEAEAEAKAKAKAK (SEQ ID NO: 45); RARARARADADADADA (SEQ ID NO: 46); ADADADADARARARAR (SEQ ID NO: 47); DADADADARARARARA (SEQ ID NO: 48); HEHEHKHKHEHEHKHK (SEQ ID NO: 49); VEVEVEVEVEVEVEVEVEVE (SEQ ID NO: 50);和 RFRFRFRFRFRFRFRFRFRF (SEQ ID NO: 51)。
5. 權(quán)利要求4的融合蛋白，其中A是所述mSDF-1肽或所述Xp-mSDF-l肽，并且包含SEQ ID NO: 53-SEQ ID NO: 56中任一的氨基酸序列，特別地其中A是SEQ ID NO: 54的mSDF-1 肽。
6. 權(quán)利要求5的融合蛋白，其中n=l，并且L選自下述：GGGGGG (SEQ ID NO:57); GIVGPL (SEQ ID NO:58)和 PVGLIG (SEQ ID NO:59)。
7. -種核酸，包含編碼權(quán)利要求I的分離的突變基質(zhì)細(xì)胞衍生因子I或權(quán)利要求4的 融合蛋白的核苷酸序列。
8. -種生物相容性肽膜，包含一個(gè)或更多個(gè)具有選自SEQ ID N0:1-SEQ ID NO:8、SEQ ID N0:10-SEQ ID N0:34、或SEQ ID N0:36-SEQ ID N0:51的氨基酸序列的自組裝肽，并且 其中0. 1-10%的所述自組裝肽結(jié)合至權(quán)利要求1的分離的突變基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1。
9. 權(quán)利要求8的生物相容性肽膜，其中所述分離的突變基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1通過生物 素/抗生物素蛋白連接結(jié)合至所述膜內(nèi)的自組裝肽，或者通過肽鍵共價(jià)結(jié)合至所述膜內(nèi)的 自組裝肽。
10. 權(quán)利要求9的生物相容性肽膜，其中有間隔區(qū)將所述分離的突變基質(zhì)細(xì)胞衍生因 子1與所述一個(gè)或更多個(gè)自組裝肽分隔開至少14埃并且不超過250埃。
11. 權(quán)利要求1的突變基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1在制備用于治療患者以輔助損傷組織修復(fù) 的藥物中的用途，所述治療包括：將權(quán)利要求1的突變基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1局部地施用至所 述損傷組織，特別地其中所述患者被治療選自下列的疾病或狀況：中風(fēng)；肢體缺血；由于創(chuàng) 傷的組織損傷；以及糖尿病潰瘍。
12. 權(quán)利要求11的用途，其中所述突變基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1被粘附至生物相容性膜或 粘附至自組裝肽，所述自組裝肽在局部施用至所述損傷組織后形成生物相容性膜。
13. 權(quán)利要求11的用途，其中所述患者被治療的是對(duì)心臟組織的損傷，并且所述治療 包括將所述生物相容性肽膜注射或植入所述患者的心肌。
【文檔編號(hào)】A61K38/19GK104211800SQ201410353635
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2007年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2006年10月23日
【發(fā)明者】R.李V.賽格斯 申請(qǐng)人:布里格哈姆及韋門斯醫(yī)院