下來，制成細(xì) 胞懸液。
[0056] (5)將細(xì)胞懸液接種到新的培養(yǎng)瓶中，于37°C、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 待傳代的細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%~90%時(shí)，即可按照1 :2或者1 :3的比例再次傳代。
[0057] (6)將hBMSCs細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)擴(kuò)增至第2代時(shí)，制成數(shù)量為I. 5 X IO7的細(xì)胞懸液 備用。
[0058] 3、凍存
[0059] (1)收集對(duì)數(shù)期的步驟2獲得的細(xì)胞懸液（24h前換液一次），顯微鏡下觀察細(xì)胞 密度及狀態(tài)是否良好。
[0060] (2)將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用PBS液洗2遍，加入0· 25 %胰酶（含0· 01 % EDTA)室溫消 化至細(xì)胞由梭形變?yōu)閳A形時(shí)，用血清終止胰蛋白酶的作用，吸管輕輕吹下貼壁細(xì)胞，吹打成 懸液，轉(zhuǎn)移至新的15ml離心管中。
[0061] (3) 1200rpm離心6分鐘，棄上清，輕彈管底以打散細(xì)胞，加入PBS液吹打均勻。取 出少量培養(yǎng)液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將剩余細(xì)胞重復(fù)上述離心操作。
[0062] (4)棄上清，輕彈管底以打散細(xì)胞，用含10%血清的二甲基亞砜重懸細(xì)胞，用吸管 輕輕吹打均勻，分裝至凍存管中，使細(xì)胞濃度在2 X IOfVml左右。
[0063] (5)旋緊凍存管蓋，用封口膜封口，標(biāo)記好名稱及日期。將細(xì)胞置于梯度降溫盒中， 于-80°C放24小時(shí)，之后轉(zhuǎn)入液氮中備用。
[0064] 三、可引導(dǎo)尿道再生的生物材料的制備
[0065] 將步驟二培養(yǎng)后的hBMSCs按密度I X IOfVcm2負(fù)載于步驟一制備的膠原管上，得到 hBMSCs-膠原支架材料即引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料。
[0066] 實(shí)施例2、引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料在修復(fù)尿道組織缺損中的應(yīng)用
[0067] -、試驗(yàn)動(dòng)物與分組
[0068] 試驗(yàn)動(dòng)物為雄性比格犬（12月齡，體重12±1. 5kg) 10只，隨機(jī)分成兩組，每組各5 只。實(shí)驗(yàn)組：實(shí)施例1制備的引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料；對(duì)照組：實(shí)施例1中步 驟一制備的膠原管。
[0069] 二、試驗(yàn)方法
[0070] 分別用實(shí)施例1中制備得到的引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料和實(shí)施例1中 步驟一制備的膠原管對(duì)犬缺損尿道進(jìn)行組織修復(fù)，術(shù)后六個(gè)月處死比格犬，觀測(cè)引導(dǎo)尿道 再生的生物材料在犬組織工程尿道再生中的作用。
[0071] 1、缺損尿道的制備方法
[0072] 人為手術(shù)處理：3%的戊巴比妥鈉溶液（Merck公司，德國(guó)）按lml/kg腹腔注射麻 醉實(shí)驗(yàn)犬。會(huì)陰部備皮，常規(guī)消毒鋪巾。取會(huì)陰部倒"V"字形切口，切開皮膚及皮下組織， 游離并切除陰莖骨近側(cè)尿道組織，長(zhǎng)度為5cm，得到缺損尿道。
[0073] 2、對(duì)缺損尿道進(jìn)行修復(fù)的方法
[0074] 用3-0可吸收縫線將實(shí)施例1中制備得到的引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料 與尿道遠(yuǎn)近端吻合，放置8F多孔硅膠尿管支撐尿道并引流膀胱；再用1-0絲線逐層縫合海 綿體肌、皮下組織及皮膚，最后用1-0絲線將尿管末端縫合固定于包皮上。
[0075] 三、試驗(yàn)結(jié)果
[0076] 1、標(biāo)本觀察
[0077] 采集2組犬的尿道標(biāo)本進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，實(shí) 驗(yàn)組修復(fù)段尿道比較柔軟，有一定彈性；尿道標(biāo)本縱行剖開后觀察，實(shí)驗(yàn)組尿道腔較正常尿 道腔狹小，但構(gòu)成一完整腔道，黏膜面光滑紅潤(rùn)；而對(duì)照組黏膜面粗糙蒼白，修復(fù)段尿道未 形成一完整腔道，明顯狹窄，甚至完全閉鎖。
[0078] 2、組織學(xué)觀察
[0079] 將實(shí)驗(yàn)組再生后的尿道中心處離斷標(biāo)本，將標(biāo)本一分為二，一半標(biāo)本置于4%中 性甲醛中固定24h，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚2. 5 μ m，脫蠟，常規(guī)蘇木精-伊紅染色（HE染 色），鏡下觀察再生尿道的組織結(jié)構(gòu)；另一半標(biāo)本采集后立即進(jìn)行冰凍切片，共下述步驟3 使用。
[0080] HE染色觀察結(jié)果如圖2所示：實(shí)驗(yàn)組修復(fù)段尿道被覆完整的黏膜上皮層，約6-7 層，細(xì)胞排列規(guī)則，與正常尿道上皮相近；對(duì)照組修復(fù)段尿道被覆不連續(xù)的黏膜上皮層，細(xì) 胞層數(shù)少，細(xì)胞排列不規(guī)則，多數(shù)部位僅有單層上皮細(xì)胞覆蓋。兩組尿道黏膜下均以纖維組 織生長(zhǎng)為主，平滑肌生長(zhǎng)不明顯，實(shí)驗(yàn)組可見少量口徑較小的新生血管，對(duì)照組新生血管罕 見。
[0081] 3、免疫熒光檢測(cè)人源細(xì)胞核
[0082] 上述另一半標(biāo)本采集后立即行冰凍切片，片厚5 μπι，用4%多聚甲醛室溫下固定 IOmin后，用PBS液清洗后加入3%雙氧水（H2O2)室溫下作用lOmin，再用0. 3%TritonX-100 透膜處理20min ; 10 %山羊血清封閉非特異抗原20min，PBS液清洗后滴加鼠抗人源細(xì)胞核 IgG-抗（1 :100)，放入濕盒中4°C過夜孵育，次日加 Alexa Fluor標(biāo)記的羊抗鼠 IgG二抗 (1 :1〇〇)作用30min，DAPI染核lOmin，激光共聚焦顯微鏡下觀察。
[0083] 尿道中人源細(xì)胞核表達(dá)情況如圖3所示：Anti-human nuclei IgG單抗檢測(cè)尿道 標(biāo)本后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組再生尿道中存在抗人源細(xì)胞核抗體熒光染色陽(yáng)性的細(xì)胞，主要分布于 粘膜下組織中，粘膜層幾乎沒有。表明人BMSCs可以在犬體內(nèi)存活，并發(fā)揮一定作用。
[0084] 4、免疫熒光檢測(cè)尿道組織成分
[0085] 分別用 pan cytokeratin AE1/AE3 (1:100)、a-SMA (1:200)、vWF (1:400) IgG 單抗 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的尿道標(biāo)本中上皮、平滑肌、血管的再生情況，具體方法同上。激光共 聚焦顯微鏡下觀測(cè)三種組織成分的熒光染色，并用Image-Pro Plus軟件定量計(jì)算兩組尿道 上皮、平滑肌、血管的平均熒光密度值，每張切片隨機(jī)取10個(gè)高倍視野進(jìn)行計(jì)算，取均值。
[0086] 免疫熒光結(jié)果如圖4和表1所示：實(shí)驗(yàn)組尿道上皮再生效果顯著優(yōu)于對(duì)照組（P < 0. 01)，與正常尿道上皮無(wú)差異（P > 0. 05);實(shí)驗(yàn)組尿道平滑肌、血管的再生雖優(yōu)于對(duì)照 組（P < 0. 01)，但與正常尿道相比，差距顯得很大（P < 0. 01)，再生能力相當(dāng)有限。
[0087] 表1正常尿道、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組修復(fù)段尿道組織各成分的平均熒光密度值（X土s，n = 10)
[0088]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料的制備方法，包括如下步驟：將間充質(zhì)干 細(xì)胞負(fù)載于由離體哺乳動(dòng)物表皮制備的尿道狀膠原管上，得到所述引導(dǎo)尿道再生的功能性 生物支架材料。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述間充質(zhì)干細(xì)胞和所述膠原管的配比 為 I X IO6個(gè)：cm 2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于： 所述由離體哺乳動(dòng)物表皮制備的尿道狀膠原管按照包括如下步驟的方法制備：將離體 哺乳動(dòng)物表皮依次用氫氧化鈉水溶液和去污劑處理，得到膠原支架材料，再用所述膠原支 架材料制成與尿道大小相符的管狀支架，得到尿道狀膠原管。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于： 所述去污劑為吐溫-80、吐溫-20或TRIT0N-X100 ; 所述氫氧化鈉水溶液的濃度為2-5mol/L ; 所述吐溫-80、所述吐溫-20和所述TRIT0N-X100的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1-5%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于： 所述離體哺乳動(dòng)物表皮依次用氫氧化鈉水溶液和去污劑處理包括如下步驟： 1) 將所述離體哺乳動(dòng)物表皮在濃度為2-5mol/L氫氧化鈉水溶液中浸泡10-60分鐘，得 到氫氧化鈉膠原支架材料； 2) 將所述氫氧化鈉膠原支架材料在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-5 %的吐溫-80水溶液中浸泡3小 時(shí)，得到膠原支架材料； 所述用所述膠原支架材料制成與尿道大小相符的管狀支架的方法，包括如下步驟：用 可吸收縫線將所述膠原支架材料縫合成與尿道大小相符的管狀支架。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述間充質(zhì)干細(xì)胞為骨髓間充 質(zhì)干細(xì)胞；所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具體為離體的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述哺乳動(dòng)物為豬、牛、羊、馬或 兔；所述哺乳動(dòng)物具體為牛。
8. 權(quán)利要求1-7中任一所述的方法制備得到的引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料。
9. 一種制備用于引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架的膠原管的方法，包括如下步驟：將 離體哺乳動(dòng)物表皮依次用氫氧化鈉溶液和去污劑處理，得到膠原支架材料，再用所述膠原 支架材料制成與尿道大小相符的管狀支架，得到膠原管。
10. 權(quán)利要求8所述的引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料或由權(quán)利要求9所述的方 法制備的膠原管在如下（1)-(5)中至少一種中的應(yīng)用： (1) 制備修復(fù)尿道組織缺損的產(chǎn)品； (2) 制備促進(jìn)尿道缺損組織再長(zhǎng)的產(chǎn)品； (3) 制備促進(jìn)尿道上皮再生的產(chǎn)品； (4) 制備促進(jìn)尿道平滑肌再生的產(chǎn)品； (5) 制備促進(jìn)尿道血管再生的產(chǎn)品。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料的制備方法包括如下步驟：將間充質(zhì)干細(xì)胞負(fù)載于由離體哺乳動(dòng)物表皮制備的尿道狀膠原管上，得到所述引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料。通過試驗(yàn)證明：本發(fā)明的引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料對(duì)尿道缺損組織有很好的修復(fù)作用，可以促進(jìn)尿路再生。
【IPC分類】A61L27-24, A61L27-50, A61L27-38
【公開號(hào)】CN104857564
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510204561
【發(fā)明人】戴建武, 侯祥林, 葉鋼, 賈維盛, 陳冰
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
【公開日】2015年8月26日
【申請(qǐng)日】2015年4月27日