一種引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料及其制備方法，屬于醫(yī)用材 料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 膠原蛋白為生物體提供了一種機(jī)械支撐作用，維護(hù)器官與組織的完整性，保障其 正常功能的行使，這對于實質(zhì)性器官而言非常重要。膠原蛋白是基底膜的主要成分之一，在 骨骼中超過80%的有機(jī)質(zhì)是I型膠原蛋白，膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，作為細(xì)胞 生長的依附與支架，能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞等的增殖分化和移植。
[0003] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)作 為一種成體干細(xì)胞，為中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞，它具有自我更新、高度增殖和在特定條件下 多向分化的特性，能分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、肌腱等組織結(jié)構(gòu)，還能誘導(dǎo)分化為心肌細(xì) 胞、神經(jīng)細(xì)胞、胰島細(xì)胞等。BMSCs不僅具備潛在的免疫調(diào)節(jié)和抗炎特性，而且在組織修復(fù)的 過程中具有分泌糖蛋白、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)的作用，這種作用不但可以有效減少組織炎 癥和纖維化的發(fā)生，而且可以刺激組織的再生。BMSCs來源豐富、易于獲取、體外培養(yǎng)擴(kuò)增迅 速、且具備跨胚層多向分化的能力，故被認(rèn)為是組織工程較為理想的種子細(xì)胞。
[0004] 外傷、狹窄、先天畸形等原因引起的尿路組織缺損，是泌尿外科常見疾病。對于這 類疾病的治療目前多采用自體材料進(jìn)行修復(fù)。自體材料能夠部分替代尿路的形態(tài)和功能， 提高患者的健康和生活質(zhì)量，但其來源都是以犧牲正常組織為代價的，這將對患者造成二 次創(chuàng)傷。并且以這些材料修補尿路缺損并不能完全達(dá)到預(yù)期效果，術(shù)后尿瘺、再狹窄等并發(fā) 癥的發(fā)生比例高。因此利用功能性生物材料，重建尿路正常的形態(tài)和功能，減少手術(shù)并發(fā) 癥，減輕患者痛苦及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，提高生活質(zhì)量有著重要臨床意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料的制備方法。
[0006] 本發(fā)明提供的引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料的制備方法包括如下步驟：將 間充質(zhì)干細(xì)胞負(fù)載于由離體哺乳動物表皮制備的尿道狀膠原管上，得到所述引導(dǎo)尿道再生 的功能性生物支架材料。
[0007] 上述方法中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞和所述膠原管的配比為IX IO6個：cm2。
[0008] 上述方法中，所述由離體哺乳動物表皮制備的尿道狀膠原管按照包括如下步驟的 方法制備：將離體哺乳動物表皮依次用氫氧化鈉水溶液和去污劑處理，得到膠原支架材料， 再用所述膠原支架材料制成與尿道大小相符的管狀支架，得到尿道狀膠原管。
[0009] 上述方法中，所述去污劑為吐溫-80、吐溫-20或TRIT0N-X100 ;所述氫氧化鈉水溶 液的濃度為2-5mol/L ;所述吐溫-80、所述吐溫-20和所述TRIT0N-X100的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為 1-5 % 〇
[0010] 上述方法中，所述離體哺乳動物表皮依次用氫氧化鈉水溶液和去污劑處理包括如 下步驟：
[0011] 1)將所述離體哺乳動物表皮在濃度為2-5mol/L氫氧化鈉水溶液中浸泡10-60分 鐘，得到氫氧化鈉膠原支架材料；
[0012] 2)將所述氫氧化鈉膠原支架材料在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-5%的吐溫-80水溶液中浸泡3 小時，得到膠原支架材料。
[0013] 上述方法中，所述用所述膠原支架材料制成與尿道大小相符的管狀支架的方法， 包括如下步驟：用可吸收縫線將所述膠原支架材料縫合成與尿道大小相符的管狀支架。
[0014] 上述方法中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具 體為離體的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0015] 上述方法中，所述哺乳動物為豬、牛、羊、馬或兔；所述哺乳動物具體為牛。
[0016] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述方法制備得到的引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支 架材料。
[0017] 本發(fā)明的最后一個目的是提供一種制備用于引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架的 膠原管的方法。
[0018] 本發(fā)明提供的制備用于引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架的膠原管的方法包括如 下步驟：將離體哺乳動物表皮依次用氫氧化鈉溶液和去污劑處理，得到膠原支架材料，用所 述膠原支架材料制成與尿道大小相符的管狀支架，得到膠原管。
[0019] 上述引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料或由上述方法制備的膠原管在如下 (1)-(5)中至少一種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0020] (1)制備修復(fù)尿道組織缺損的產(chǎn)品；
[0021] (2)制備促進(jìn)尿道缺損組織再長的產(chǎn)品；
[0022] (3)制備促進(jìn)尿道上皮再生的產(chǎn)品；
[0023] (4)制備促進(jìn)尿道平滑肌再生的產(chǎn)品；
[0024] (5)制備促進(jìn)尿道血管再生的產(chǎn)品。
[0025] 本發(fā)明將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞hBMSCs按密度I X IOfVcm2負(fù)載于管狀膠原支架材 料（長5cm，內(nèi)徑0.8cm)上，得到引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料。通過試驗證明：本 發(fā)明的引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料對尿道缺損組織有很好的修復(fù)作用，可以促進(jìn) 尿路再生。
【附圖說明】
[0026] 圖1為尿道大體標(biāo)本。其中，A為實驗組；B為對照組，兩箭頭之間為修復(fù)段尿道。
[0027] 圖2為正常尿道、實驗組修復(fù)段尿道和對照組修復(fù)段尿道的組織學(xué)對比圖 (HEX 100, HEX400)。
[0028] 圖3為實驗組修復(fù)段尿道人源細(xì)胞核的熒光表達(dá)情況（共聚焦顯微鏡X 800)。其 中白色箭頭所指為抗人源細(xì)胞核抗體染色陽性的細(xì)胞。
[0029] 圖4為正常尿道、實驗組修復(fù)段尿道和對照組修復(fù)段尿道的上皮、平滑肌、血管的 免疫熒光檢測比對（共聚焦顯微鏡X 400)。
【具體實施方式】
[0030] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0031] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032] 鼠抗人源細(xì)胞核（anti-human nuclei) IgG單抗、鼠抗廣譜細(xì)胞角蛋白（pan cytokeratin AE1/AE3) IgG 單抗、鼠抗 α 平滑肌肌動蛋白（a-smooth muscle actin， a -SMA) IgG單抗、兔抗血管假性血友病因子（von willebrand factor，vWF) IgG單抗、Alexa Fluor標(biāo)記的羊抗鼠 IgG二抗、Alexa Fluor標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，均是美國Molecular Probes公司的產(chǎn)品。
[0033] 激光共聚焦顯微鏡是德國L-eica公司的產(chǎn)品。
[0034] 實施例1、引導(dǎo)尿道再生的功能性生物支架材料的制備方法
[0035] 一、膠原管的制備
[0036] 1、膠原支架材料的制備
[0037] 本發(fā)明的膠原支架材料是一種殺滅細(xì)菌、病毒及瘋牛病等病原體的膠原支架材 料，是將牛皮膚依次用氫氧化鈉溶液和去污劑處理后得到的產(chǎn)品。具體步驟如下：
[0038] (1)剝?nèi)∨＃ㄘi、牛、羊、馬或兔等哺乳動物）的體表皮膚，得到離體的表皮；
[0039] (2)機(jī)械處理掉離體的表皮下附帶成分（如肌肉、脂肪等），并用去離子水清洗表 皮，得到清洗后的表皮；
[0040] (3)將清洗后的表皮用5mol/L氫氧化納溶液，處理40分鐘；
[0041] (4)重復(fù)步驟（3) 1-3次，得到氫氧化納溶液處理后的表皮；
[0042] (5)將氫氧化納溶液處理后的表皮用去污劑-質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的吐溫-80 (去污劑 可為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-5 %的吐溫-80、吐溫-20、TRIT0N-X100或其它化學(xué)去污劑）處理3小 時，得到去污劑處理的表皮；
[0043] (6)用去熱原水對去污劑處理的表皮充分清洗，去掉化學(xué)成分殘留，得到膠原支架 材料，將其保存于生理鹽水中；
[0044] (7)置換新的生理鹽水漂洗2小時；
[0045] (8)放置凍干機(jī)冷凍干燥；鈷源照射，密封保存。
[0046] 2、膠原管的制備
[0047] 將步驟1制備得到的膠原支架材料制成規(guī)格為5cmX3cm的長方形膜片，厚度為 〇. 2cm，并根據(jù)預(yù)實驗中所測得的犬尿道大小，用3-0可吸收縫線將膠原材料連續(xù)縫合，形 成長為5cm、內(nèi)徑為0. 8cm的管狀支架即膠原管。
[0048] 二、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
[0049] 1、密度梯度離心法分離BMSCs細(xì)胞
[0050] 將l_2ml狗的骨髓緩慢加入到比重為I. 077g/L的等量的淋巴細(xì)胞分離液（購自 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）中，盡量保持液面不被破壞。室溫2000rpm，離心 20min，離心管內(nèi)液體分為3層。取中間層MSCs，加5ml的PBS液中（購自GIBCO公司），室 溫1200rpm，離心洗絳6min，棄上清，取沉淀。
[0051] 2、接種和擴(kuò)增培養(yǎng)
[0052] (1)用含10% FBS、90% L-DMEM、100 μ g/ml青霉素和100U/ml硫酸鏈霉素的干細(xì) 胞培養(yǎng)基調(diào)節(jié)步驟1得到的沉淀中的細(xì)胞密度。然后將6 X IO7個骨髓有核細(xì)胞接種到T25 的塑料培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% C02、95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0053] (2)原代接種后24-48小時，除去未貼壁的造血細(xì)胞，用PBS液洗絳，半量換液。以 后每隔2~3天換液1次。
[0054] (3)當(dāng)細(xì)胞達(dá)70%~80%匯合時，用PBS液將培養(yǎng)的細(xì)胞洗2遍，加入0.25%胰 酶（含0. 01 % EDTA)消化液，室溫消化，顯微鏡下觀察，待細(xì)胞由梭形變?yōu)閳A形時，用含血清 培養(yǎng)液或血清終止胰蛋白酶的作用。
[0055] (4)用吸管輕輕吹打培養(yǎng)瓶的細(xì)胞貼附面，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離