一種針對(duì)vsg的伊氏錐蟲(chóng)納米抗體及其編碼序列與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)或生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種針對(duì)于伊氏錐蟲(chóng)變異表面糖蛋白(variant surface glucoprotein, VSG)的納米抗體，其編碼序列及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]伊氏錐蟲(chóng)(Trypanosoma evansi)病是由伊氏錐蟲(chóng)引起的一種血液原蟲(chóng)病，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，我國(guó)許多地區(qū)都有分布。伊氏錐蟲(chóng)主要寄生于馬、驢、騾、水牛、黃牛、奶牛、綿羊等家畜，一些野生動(dòng)物如虎、鹿和駱駝也常見(jiàn)感染。伊氏錐蟲(chóng)病能直接引起動(dòng)物的急性死亡或隱性感染，造成貧血，死胎、流產(chǎn)，泌乳減少等，給我國(guó)畜牧業(yè)造成極大的損失。另外，國(guó)外還有感染人的報(bào)道，因此伊氏錐蟲(chóng)病也是一種人畜共患寄生蟲(chóng)病。該病的控制有賴于有效的檢測(cè)診斷方法。
[0003]目前伊氏錐蟲(chóng)病的檢測(cè)和診斷方法主要有:
(1)病原學(xué)方法，如鏡檢法；
(2)分子生物學(xué)檢測(cè)方法，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (lamp)法。
[0004](3)免疫學(xué)檢測(cè)方法，如補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、膠乳凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、間接熒光抗體試驗(yàn)等等。目前應(yīng)用的最多的仍然是免疫學(xué)檢測(cè)方法，而免疫學(xué)方法檢測(cè)的關(guān)鍵就是篩選出活性高的特異性抗體。
[0005]納米抗體技術(shù)，是在傳統(tǒng)抗體的基礎(chǔ)上，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)研發(fā)得到，是目前已知最小的可結(jié)合抗原的抗體分子。最初有比利時(shí)科學(xué)家Hamers.R在駱蛇血液中發(fā)現(xiàn)，普通的抗體蛋白由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，而從駱駝血液中發(fā)現(xiàn)的新型抗體只有兩條重鏈，沒(méi)有輕鏈，這些新型抗體能像正?？贵w一樣于抗原緊密結(jié)合，但不像單鏈抗體那樣相互粘連聚集成塊。以其為基礎(chǔ)構(gòu)建的納米抗體不僅分子量為普通抗體的1/10，而且化學(xué)性質(zhì)也更加靈活，穩(wěn)定性好，可溶性高，表達(dá)容易且容易獲得，并能夠偶聯(lián)其他分子，因此應(yīng)用納米抗體技術(shù)研發(fā)錐蟲(chóng)檢測(cè)試劑具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明正是利用該技術(shù)，利用篩選得到的伊氏錐蟲(chóng)變異表面糖蛋白抗原特異的納米抗體，用于檢測(cè)錐蟲(chóng)感染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種針對(duì)伊氏錐蟲(chóng)變異表面糖蛋白(VSG)的納米抗體，同時(shí)提供該納米抗體的編碼序列及該納米抗體在制備檢測(cè)的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種針對(duì)VSG的納米抗體的VHH鏈，包括框架區(qū)FR和互補(bǔ)決定區(qū)⑶R，所述框架區(qū)FR包括FRl?FR4的氨基酸序列:其中，F(xiàn)Rl的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，F(xiàn)R2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的，F(xiàn)R3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，F(xiàn)R4的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述互補(bǔ)決定區(qū)⑶R包括⑶Rl?⑶R3的氨基酸序列:⑶Rl的氨基酸序列SEQ ID NO:2所示，⑶R2的氨基酸序列SEQ ID NO:4所示，CDR3的氨基酸序列SEQ ID NO:6所示。
[0008]進(jìn)一步的，所述的VSG納米抗體的VHH鏈，它具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
[0009]一種VSG納米抗體，它針對(duì)VSG表位的納米抗體，包括兩條具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的VHH鏈。
[0010]一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質(zhì):上述的針對(duì)VSG納米抗體的VHH鏈，或上述的VSG納米抗體。
[0011]—種表達(dá)載體，它含有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
[0012]一種宿主細(xì)胞，它可以表達(dá)VSG納米抗體。
[0013]一種VSG納米抗體在制備VSG檢測(cè)試劑方面的應(yīng)用。
[0014]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下:本發(fā)明首先制備及純化伊氏錐蟲(chóng)變異表面糖蛋白，將其免疫駱駝，制備VSG特異的納米抗體庫(kù)，然后將純化后的VSG偶聯(lián)在酶標(biāo)板上，利用噬菌體展示技術(shù)篩選高表達(dá)的VSG特異的納米抗體，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG1，建立能在大腸桿菌TGl中高效表達(dá)的納米抗體株。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是VSG納米抗體的DNA電泳圖，M分子量marker，I陰性對(duì)照，2_19 PCR產(chǎn)物，條帶約600bp。
[0016]圖2是VSG納米抗體經(jīng)鎳柱親和層析純化后再經(jīng)AKTAexpress純化后的SDS-PAGE電泳圖和Western blot印跡圖；其中M為分子量標(biāo)記，單位kD，1-5表示VSG納米抗體；
圖3是應(yīng)用VSG納米抗體識(shí)別伊氏錐蟲(chóng)VSG的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)結(jié)果。圖中“▲ ”曲線為VSG納米抗體，“ ■”曲線為陰性對(duì)照抗體SEA。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下實(shí)施例用來(lái)解釋說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明應(yīng)用針對(duì)VSG納米抗體偶聯(lián)在酶標(biāo)板上，展示蛋白質(zhì)的正確空間構(gòu)象，以此形式的抗原篩選免疫納米抗體庫(kù)(駱駝重鏈抗體噬菌體展示庫(kù))，而獲得了能在大腸桿菌中高效表達(dá)的納米抗體株。
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0019]實(shí)施例1
本實(shí)施例構(gòu)建伊氏錐蟲(chóng)VSG特異納米抗體庫(kù)，步驟如下:
(1)首先純化伊氏錐蟲(chóng)VSG抗原，然后將ImgVSG抗原與弗氏佐劑等體積混合，免疫一只羊蛇(Alpa-Vet，www.alpa-vet.be)，每周一次，共免疫7次，刺激B細(xì)胞表達(dá)抗原特異性的納米抗體；
(2)7次免疫結(jié)束后，提取10ml羊駝外周血淋巴細(xì)胞并提取總RNA ；
(3)合成cDNA并利用套式PCR擴(kuò)增VHH；
(4)利用限制性內(nèi)切酶pstl及NotI酶切20ug噬菌體展示載體及1uIVHH并連接兩個(gè)片段；
(5)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞TGl中，構(gòu)建VSG納米抗體文庫(kù)并測(cè)定庫(kù)容，庫(kù)容大小為5.1XlO9O
[0020]實(shí)施例2
本實(shí)施例篩選VSG特異的納米抗體，步驟如下:
(1)將溶解在10mMNaHCO3^ pH8.2的20ug VSG包被在NUNC酶標(biāo)板上，4°C放置過(guò)夜；
(2)第二天加入10ul3%milk，室溫封閉2h ；
(3)2h后，加入10ul 10ntfu含有VSG納米抗體文庫(kù)的輔助噬菌體，室溫作用Ih;
(4)第一輪淘選用0.05%PBS+Tween-20洗10遍/第二輪20-25遍/第三輪20遍，除掉非特異性結(jié)合的噬菌體；
(5)用10mMTEA(triethylamine)將與VSG特異結(jié)合的■菌體解離下