納米鉆石表面修飾負(fù)載甲氨蝶呤的藥物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米藥物，具體涉及一種納米鉆石表面修飾后負(fù)載化療藥物甲氨蝶呤的納米藥物及其制備方法，以及該藥物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著當(dāng)今科技發(fā)展的突飛猛進(jìn)，人們賴以生存的環(huán)境日益惡劣，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)病率越來越高。目前臨床上傳統(tǒng)的癌癥治療方法中，化療是最為簡便有效的方法之一，但是抗癌藥物多為小分子化合物，血液給藥后會迅速分布于全身，對患者產(chǎn)生較大的毒副作用，藥物損失量大，而且多次給藥會使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性，從而使得化療效率極低。因此研發(fā)高效低毒的新型抗癌藥物尤為迫切。
[0003]近年來隨著納米科學(xué)與生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等學(xué)科的有機(jī)結(jié)合，納米生物醫(yī)學(xué)已經(jīng)成為引人矚目的新興交叉學(xué)科之一。鑒于納米材料的獨特優(yōu)點，研宄開發(fā)納米藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域具有巨大的發(fā)展前景，其中最受關(guān)注的是以納米顆粒作為藥物載體，將藥物通過物理吸附或共價偶聯(lián)的方式結(jié)合到納米顆粒上用于藥物輸送。由于納米鉆石在目前所有碳納米材料衍生物中具有毒性最低、生物兼容性高且表面易修飾等特點，其作為藥物載體應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有很大的潛在價值。而甲氨蝶呤作為臨床上應(yīng)用較多的抗葉酸類化療藥物，血液給藥后在全身循環(huán)過程中損傷正常細(xì)胞的同時導(dǎo)致藥物損失。鑒于納米鉆石載藥及運輸藥物的優(yōu)越性，我們將修飾后的納米鉆石通過化學(xué)偶聯(lián)甲氨蝶呤制備成納米藥物，并研宄其對腫瘤細(xì)胞活性、周期、凋亡等的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種納米鉆石表面修飾負(fù)載甲氨蝶呤的藥物及其制備方法，以及該藥物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供的一種納米鉆石表面修飾負(fù)載甲氨蝶呤的藥物的制備方法，包括如下步驟:
[0006](I)稱取干燥的羧基化的納米鉆石，按每Img羧基化的納米鉆石加入1-1.5mL濃度為0.1M、pH5.8的MES緩沖溶液中，超聲分散30min形成懸濁液，再按每Img羧基化的納米鉆石中加入0.2mg EDC與0.3mg NHS,室溫攪拌反應(yīng)6h，計時結(jié)束后以15000rpm離心5min，棄去上清液，得到活化羧基的納米鉆石沉淀物；
[0007](2)把活化羧基的納米鉆石沉淀物分散到濃度為0.1Μ、ρΗ8.4的硼酸緩沖溶液中，超聲分散形成懸池液，按每Img活化羧基的納米鉆石加入0.5mg H2N-PEG-NH2,繼續(xù)室溫攪拌反應(yīng)12h，待反應(yīng)結(jié)束后，用濃度為0.1Μ、ρΗ8.4的硼酸緩沖溶液以15000rpm離心5min洗滌3次，獲得納米鉆石-聚乙二醇二胺(ND-PEG-NH2)沉淀物；
[0008](3)按每Img ND-PEG-NH2沉淀物溶于0.5mL無水乙醇中，超聲分散30min，形成懸濁液，按每Img ND-PEG-NH2沉淀物逐滴加入體積分?jǐn)?shù)為I %的縮水甘油的乙醇溶液0.5mL，再加入幾滴三乙胺，維持反應(yīng)體系pH在8-9，室溫避光攪拌反應(yīng)24h，得到沉淀物，分別用無水乙醇和滅菌雙蒸水以15000rpm離心5min洗滌3次，得到納米鉆石-聚乙二醇二胺-縮水甘油(ND-PEG-GLY)載體，放在真空干燥箱里避光保存；
[0009](4)按每Img干燥的ND-PEG-GLY加入ImL滅菌雙蒸水中，避光超聲分散30min形成懸濁液，接著按ND-PEG-GLY與甲氨蝶呤(MTX)質(zhì)量比5: 1-3加入MTX，再按每Img MTX中加入0.6mg EDC與0.35mg NHS在37°C水浴環(huán)境中避光反應(yīng)24h，以15000rpm離心5min，用滅菌雙蒸水洗滌3次，制得納米鉆石表面修飾負(fù)載甲氨蝶呤的藥物ND-PEG-GLY-MTX，真空干燥，冷藏。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明選用的納米鉆石材料具有生物相容性好、無毒、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、表面易修飾等諸多優(yōu)點。通過納米載體ND-PEG-GLY與人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)作用，表明ND-PEG-GLY具有生物兼容性；將納米載體ND-PEG-GLY通過酯鍵偶聯(lián)化療藥物甲氨蝶呤(MTX)，制備成ND-PEG-GLY-MTX納米藥物，經(jīng)MTT實驗和流式細(xì)胞儀測試細(xì)胞周期和凋亡實驗表明ND-PEG-GLY-MTX能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡且療效強(qiáng)于游離MTX，其可在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。
【附圖說明】
[0011]圖1A用流式細(xì)胞儀檢測HeLa細(xì)胞的散點圖
[0012]圖1B用流式細(xì)胞儀檢測HeLa細(xì)胞攝取納米藥物ND-PEG-GLY-MTX的散點圖
[0013]圖2納米藥物ND-PEG-GLY-MTX對體外培養(yǎng)HeLa細(xì)胞活性的影響
[0014]圖3A用流式細(xì)胞儀檢測HeLa細(xì)胞周期的結(jié)果
[0015]圖3B用流式細(xì)胞儀檢測甲氨蝶呤MTX影響HeLa細(xì)胞周期的結(jié)果
[0016]圖3C用流式細(xì)胞儀檢測納米載體ND-PEG-GLY影響HeLa細(xì)胞周期的結(jié)果
[0017]圖3D用流式細(xì)胞儀檢測納米藥物ND-PEG-GLY-MTX影響HeLa細(xì)胞周期的結(jié)果
[0018]圖3E圖3A-D細(xì)胞周期各時相比較的柱狀圖
[0019]圖4各實驗組隨著處理時間的延長對細(xì)胞凋亡影響的柱狀圖
[0020]圖5細(xì)胞內(nèi)吞納米藥物ND-PEG-GLY-MTX機(jī)制
【具體實施方式】
[0021]以下為實施例中使用的材料:
[0022]納米鉆石(ND，元素六，直徑大約140nm, Ireland)。
[0023]甲氨蝶呤(MTX)是抗葉酸類化療藥物，分子式為C2tlH22N8O5,分子量為454.45，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格按C2tlH22N8O5計算為lOOmg。
[0024]縮水甘油(GLY，分子量74.08)為Sigma公司生產(chǎn)。
[0025]聚乙二醇二胺(H2N-PEG-NH2，分子量為2000)為上海西寶生物有限公司生產(chǎn)。
[0026]實施例1:
[0027](I)納米鉆石-聚乙二醇二胺(ND-PEG)復(fù)合物的制備
[0028]準(zhǔn)確稱取5mg羧基化的納米鉆石，在70 °C真空干燥箱干燥一夜，置于5mLMES(0.1M，ρΗ5.8)緩沖溶液中，超聲分散30min形成懸濁液，接著加入1.0mg EDC、1.5mgNHS,室溫攪拌反應(yīng)6h，以15000rpm離心5min，除去上清液，得到活化羧基的納米鉆石沉淀物；
[0029]把活化羧基的納米鉆石重新分散到硼酸(BBS，0.1M，pH8.4)緩沖溶液中，超聲分散30min形成懸濁液，加入2.5mg H2N-PEG-NH2,繼續(xù)室溫攪拌反應(yīng)12h，用硼酸緩沖溶液(BBS，0.1M，pH8.4)以15000rpm離心5min洗滌3次，獲得納米鉆石-聚乙二醇二胺(ND-PEG-NH2)沉淀物，真空干燥備用。
[0030](2)納米鉆石-聚乙二醇二胺-縮水甘油(ND-PEG-GLY)納米載體的制備
[0031 ] 準(zhǔn)確稱取5mg干燥的ND-PEG，接著加入2.5mL的硼酸(BBS0.1M，pH8.4)緩沖溶液，超聲分散30min形成懸濁液，逐滴加入2.5mL體積分?jǐn)?shù)為I %的縮水甘油乙醇溶液，然后向反應(yīng)液中滴加幾滴三乙胺，維持反應(yīng)體系pH在8左右，室溫避光攪拌反應(yīng)24h，以15000rpm離心5min，除去上清液，用滅菌雙蒸水洗滌兩次，棄去上清液，得到ND-PEG-GLY納米載體沉淀物，真空干燥備用。
[0032](3)納米鉆石-聚乙二醇二胺-縮水甘油-甲氨蝶呤(ND-PEG-GLY-MTX)納米藥物的制備
[0033]準(zhǔn)確稱取5mg干燥的ND-PEG-GLY，超聲分散重懸于5mL滅菌雙蒸水中，接著將其置于37°C水浴中，然后迅速加入2mg MTX、1.2mg EDC、0.7mg NHS，避光攪拌反應(yīng)24h。待反應(yīng)結(jié)束后，于15000rpm離心5min，用滅菌雙蒸水清洗沉淀直至上清夜無色為止，收集所有上清液并記錄其體積，待測定未反應(yīng)的MTX，將制得的納米藥物ND-PEG-GLY-MTX真空干燥備用。
[0034]在pH 8.0的硼酸緩沖溶液(BBS)中，配制濃度為2.2M的MTX溶液，分別稀釋配制 2.2 X 1(Γ3Μ、6.6 X 1(Γ3Μ、11 X 1(Γ3Μ、15.4 X 1(Γ3Μ、19.8 X 1(Γ3Μ、33 X 1(Γ3Μ、44 X 1(Γ3Μ、55Χ 10_3Μ、66Χ 10_3Μ，用紫外-可見分光光度法在303nm處測其吸光度值。以MTX濃度為橫坐標(biāo)，303nm處的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制MTX的標(biāo)準(zhǔn)曲線。據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，用反應(yīng)前加入MTX的總量減去反應(yīng)后上清液中MTX的質(zhì)量，即得到每毫克ND-PEG-GLY偶聯(lián)MTX的質(zhì)量為(132±1.75) Ug0
[0035]實施例2:
[0036](I)?(2)的制備同實施例1
[0037](3)納米鉆石-聚乙二醇二胺-縮水甘油-甲氨蝶呤(ND-PEG-GLY-MTX)納米藥物的制備
[0038]準(zhǔn)確稱取5mg干燥的ND-PEG-GLY，超聲分散重懸于5mL滅菌雙蒸水中，接著將其置于37 °C水浴中，然后迅速加入Img MTX、1.2mg EDC、0.7mg NHS，避光攪拌反應(yīng)24h。待反應(yīng)結(jié)束后，于15000rpm離心5min，用滅菌雙蒸水清洗沉淀直至上清夜無色為止，收集所有上清液并記錄其體積，通過紫外-可見分光光度計測定其中MTX在303nm處的吸光度，以此計算出每毫克ND-PEG-GLY上偶聯(lián)MTX為(102 ±0.25) μ g。
[0039]實施例3:
[0040](I)?(2)的制備同實施例1
[0041](3)納米鉆石-聚乙二醇二胺-縮水甘油-甲氨蝶呤(ND-PEG-GLY-MTX)納米藥物的制備
[0042]準(zhǔn)確稱取5mg干燥的ND-PEG-GLY，超聲分散重懸于5mL滅菌雙蒸水中，接著將其置于37°C水浴中，然后迅速加入3mg MTX、1.2mg EDC、0.7mg NHS，避光攪拌反應(yīng)24h。待反應(yīng)結(jié)束后，于15000rpm離心5min，用滅菌雙蒸水清洗沉淀直至上清夜無色為止，收集所有上清液并記錄其體積，通過紫外-可見分光光度計測定其中MTX在303nm處的吸光度，以此計算出每毫克ND-PEG-GLY上偶聯(lián)MTX為(122 ±0.6) μ g。
[0043]實施例4:
[0044]流式細(xì)胞儀檢測HeLa細(xì)胞攝取納米藥物(ND-PEG_GLY_MTX)的實驗
[0045]取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞以2.0 X 105/dish的密度接種于35mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)16h后，棄液，PBS洗滌，本實驗中用實施例1制備的ND-PEG-GLY-MTX納米藥物，加入ND-PEG-GLY-MTX (含100 μ g/mL MTX)納米藥物于37°C孵育4h，孵育完畢，收集細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，以未做任何處理的