專利名稱：腎病檢測及治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及早期診斷腎病和/或疾病的腎并發(fā)癥的方法。本發(fā)明還涉及腎病的預(yù)防和治療。
背景技術(shù)：
在尿中出現(xiàn)過多的諸如白蛋白之類的蛋白是腎病的指征。糖尿病性腎病就是這樣一種疾病。在檢測到白蛋白過多時，腎病已經(jīng)發(fā)展了，可能已經(jīng)達(dá)到不可逆的和治療幾乎無效的階段。因此，本發(fā)明的目的是提供一種檢驗(yàn)，其比當(dāng)前已知的放射免疫法更為靈敏，以盡可能早地檢測出這樣的疾病，從而可以在疾病的早期開始預(yù)防或治療。
特殊的蛋白尿，尤其是白蛋白尿(微量和大量)，是疾病的標(biāo)志，這些疾病包括腎病(腎小球性腎炎、細(xì)菌性和病毒性腎小球腎炎、免疫球蛋白A性腎病和過敏性紫癜、膜性增殖性疾病、膜性腎病、干燥綜合癥、糖尿病性腎病、腎病綜合癥(輕微病變性疾病、局灶性腎小球硬化和相關(guān)疾病)、急性腎功能衰竭、急性腎小管間質(zhì)性腎炎、腎盂腎炎、生殖泌尿道炎癥、丙克拉莫普西癥、腎移植排異、麻風(fēng)病、返流性腎病、腎石病等)、遺傳性腎病(髓質(zhì)囊腫、髓質(zhì)海綿腎、多囊腎病(常染色體顯性基因多囊腎病、常染色體隱性基因多囊腎病、結(jié)節(jié)性硬化癥)、馮希二氏綜合癥、家族性薄腎小球基底膜癥、III型膠原腎小球腎病、纖維結(jié)合增殖因子腎小球腎病、阿爾波茨氏綜合癥、磷脂沉著綜合癥、甲髕綜合癥、先天性泌尿系異常)、單克隆免疫球蛋白病(多發(fā)性骨髓瘤、淀粉樣變性病及相關(guān)疾病)、熱性疾病(家族性地中海熱、HIV感染-愛滋病)、炎性疾病(全身性血管炎(結(jié)節(jié)性多動脈炎、韋格納氏壞死性肉芽腫、多動脈炎、壞死性和新月形腎小球腎炎)、多發(fā)性肌炎-皮肌炎、胰腺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、痛風(fēng))、血液疾病(鐮狀細(xì)胞病、血栓性血小板減少性紫癜、溶血性尿毒性綜合癥、急性皮質(zhì)壞死、腎血栓栓塞)、創(chuàng)傷和外科手術(shù)(大范圍損傷、燒傷、腹及血管手術(shù)、輸入麻醉劑)、藥物(青霉胺、類固醇)和藥物濫用、惡性病(上皮癌(肺癌、乳腺癌)、腺癌(腎)、黑素瘤、淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤)、循環(huán)系統(tǒng)疾病(心肌梗塞、心功能衰竭、周圍血管病、高血壓、冠心病、非粥性硬化性心血管病、動脈粥性硬化性心血管病)、皮膚病(牛皮癬、全身性硬皮病)、呼吸系統(tǒng)疾病(COPD、縮窄性睡眠性呼吸暫停、高空無汗癥)及內(nèi)分泌疾病(肢端肥大癥、糖尿病、尿崩癥)。
腎病可以由細(xì)菌感染、過敏反應(yīng)、先天缺陷、結(jié)石、抗生素、免疫抑制劑、抗腫瘤藥、非類固醇類抗炎藥、鎮(zhèn)痛劑、重金屬、化學(xué)藥品等等導(dǎo)致。
本申請人發(fā)現(xiàn)，蛋白(包括白蛋白)正常排泄為天然蛋白和在腎通道過程中特定產(chǎn)生的片段的混合物(Osicka，T.M.et al.(1996)Nephrology，2，199-212)。腎通道過程中，由于腎小球后(基底膜)細(xì)胞的作用，蛋白劇烈地降解，所述腎小球后(基底膜)細(xì)胞可包括腎小管細(xì)胞。腎小管細(xì)胞中的溶酶體可能對在腎通道過程中排泄的蛋白的分解起作用(見

圖1)。分解的產(chǎn)物被排泄入腎小管腔。在正常的個體中，尿內(nèi)的多數(shù)蛋白是已斷裂的。
當(dāng)溶酶體活性降低或者把物質(zhì)運(yùn)輸?shù)饺苊阁w的細(xì)胞內(nèi)作用降低時，尿中出現(xiàn)較多高分子量的蛋白，并且它們基本上是全長蛋白。這反映了腎組織中細(xì)胞加工過程的不平衡。
迄今認(rèn)為，常規(guī)的放射免疫分析適用于檢測樣品中特定蛋白的全部。但是，蛋白的總含量不只包括可使用常規(guī)放射免疫(RIA)通過公知抗體識別的那些蛋白的含量。當(dāng)前可行的放射免疫分析法依賴于抗體去檢測蛋白，諸如白蛋白?？贵w檢測非常精確，可達(dá)納克級，但是抗體的特異性影響了蛋白檢測。抗體檢測某些抗原決定簇。如果在白蛋白上特定的抗原決定簇缺失、轉(zhuǎn)變或者被掩蓋，或者以任何其它的方式改變而使抗體不能檢測白蛋白，常規(guī)放射免疫就不能提供尿樣中存在的白蛋白真實(shí)含量。
對包括腎病病征在內(nèi)的病征的早期檢測、測定患者對該病的易感性、防止該病的發(fā)作和盡可能早地治療的方法，以及確定樣品中特定蛋白總含量的方法，是本發(fā)明的目的。
發(fā)明概述本發(fā)明針對腎病和/或疾病的腎并發(fā)癥的早期診斷方法，包括(a)分離尿樣中的所有蛋白；和(b)檢測樣品中蛋白的修飾形式，其中檢測出經(jīng)修飾的蛋白是腎病和/或疾病的腎并發(fā)癥早期的指征。
盡管沒有限于特定的疾病，但根據(jù)本發(fā)明的方法，希望診斷的疾病包括腎性病、尿崩癥、I型糖尿病、II型糖尿病、腎病(腎小球腎炎、細(xì)菌性和病毒性腎小球腎炎、免疫球蛋白A性腎病和過敏性紫癜、膜性增殖性腎小球腎炎、膜性腎病、干燥綜合癥、腎病綜合癥(輕微病變性疾病、局灶性腎小球硬化和相關(guān)疾病)、急性腎功能衰竭、急性腎小管間質(zhì)性腎炎、腎盂腎炎、生殖泌尿道炎癥、丙克拉莫普西癥、腎移植排異、麻風(fēng)病、返流性腎病、腎石病)、遺傳性腎病(髓質(zhì)囊腫、髓質(zhì)海綿腎、多囊腎病(常染色體顯性基因多囊腎病、常染色體隱性基因多囊腎病、結(jié)節(jié)性硬化癥)、馮希二氏綜合癥、家族性薄腎小球基底膜癥、III型膠原腎小球腎病、纖維結(jié)合增殖因子腎小球腎病、阿爾波茨氏綜合癥、磷脂沉著綜合癥、甲髕綜合癥、先天性泌尿系異常)、單克隆免疫球蛋白病(多發(fā)性骨髓瘤、淀粉樣變性病及相關(guān)疾病)、熱性疾病(家族性地中海熱、HIV感染-愛滋病)、炎性疾病(全身性血管炎(結(jié)節(jié)性多動脈炎、韋格納氏壞死性肉芽腫、多動脈炎、壞死性和新月形腎小球腎炎)、多發(fā)性肌炎-皮肌炎、胰腺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、痛風(fēng))、血液疾病(鐮狀細(xì)胞病、血栓性血小板減少性紫癜、溶血性尿毒性綜合癥、急性皮質(zhì)壞死、腎血栓栓塞)、創(chuàng)傷和外科手術(shù)(大范圍損傷、燒傷、腹及血管手術(shù)、輸入麻醉劑)、藥物(青霉胺、類固醇)和藥物濫用、惡性病(上皮癌(肺癌、乳腺癌)、腺癌(腎)、黑素瘤、淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤)、循環(huán)系統(tǒng)疾病(心肌梗塞、心功能衰竭、周圍血管病、高血壓、冠心病、非粥性硬化性心血管病、動脈粥性硬化性心血管病)、皮膚病(牛皮癬、全身性硬皮病)、呼吸系統(tǒng)疾病(COPD、縮窄性睡眠性呼吸暫停、高空無汗癥)及內(nèi)分泌疾病(肢端肥大癥、糖尿病、尿崩癥)。
另外，所述方法可以用任何蛋白實(shí)施，優(yōu)選白蛋白、球蛋白(α球蛋白(α1球蛋白、α2球蛋白)、β球蛋白、γ球蛋白)、優(yōu)球蛋白、I型和II型擬球蛋白、纖維蛋白原、α1酸性糖蛋白(血清類粘蛋白)α1糖蛋白、α1脂蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、α219S糖蛋白、β1轉(zhuǎn)鐵蛋白、β1脂蛋白、免疫球蛋白A、E、G和M、辣根過氧化物酶、乳酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶、肌紅蛋白、溶菌酶、蛋白激素、生長激素、胰島素或甲狀旁腺激素。
本方法可以使用非抗體手段實(shí)施，諸如使用層析、電泳或者沉積等等，這些手段可以進(jìn)一步包括分配層析法、吸附層析法、紙層析法、薄層層析法、氣液色譜法、凝膠色譜法、離子交換層析法、親合層析法、疏水作用層析法、移動界面電泳法、區(qū)帶電泳或者等電點(diǎn)聚焦法。
本發(fā)明的方法特別針對在高壓液相色譜(HPLC)裝置中使用疏水作用層析。
本發(fā)明還針對用于早期診斷腎病和/或疾病的腎并發(fā)癥的抗體檢測方法。本發(fā)明的方法通過檢驗(yàn)在尿樣中用常規(guī)的方法一般不能識別的完整/經(jīng)修飾的蛋白來完成。在可以檢測到天然蛋白前，本發(fā)明的完整/經(jīng)修飾的蛋白就存在于患者的尿樣或者在易感疾病者的尿樣中。因此，在尿樣中檢出完整/經(jīng)修飾的蛋白，在早期指示出受檢對象是患病的或者易感疾病的，盡管這時受檢對象可能在其它方面表現(xiàn)正常。本發(fā)明的檢驗(yàn)方法包括利用對蛋白的修飾和未經(jīng)修飾形式都有特異性的抗體檢測完整/經(jīng)修飾的蛋白。優(yōu)選抗體對于經(jīng)修飾的蛋白是特異的。將抗體與酶、放射性、熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記連接，其中檢測步驟包括放射免疫分析、免疫放射分析、熒光免疫分析、酶聯(lián)免疫分析或A蛋白免疫分析。
在本發(fā)明的方法中，如果在尿中經(jīng)修飾的蛋白的量隨時間增加，就診斷為該病的早期階段，而常規(guī)的放射免疫分析不能檢測經(jīng)修飾的蛋白。
本發(fā)明還針對用于早期診斷腎病和/或疾病的腎并發(fā)癥的一種物品，包括(a)一種容器，含有一種對蛋白的修飾形式特異的標(biāo)記抗體；(b)一種容器，含有用于開展抗體反應(yīng)的試劑；和(c)對如何使用組件(a)和(b)進(jìn)行診斷的指示。
另外，本發(fā)明還針對一種用于確定腎病和/或疾病的腎并發(fā)病的治療劑的方法，包括(a)向需要的人員給予認(rèn)為能治療所述疾病的藥劑；(b)從該人員得到尿樣；和(c)分析尿樣中的蛋白修飾形式，其中，蛋白的修飾形式在尿樣中的存在或缺乏，或者蛋白的修飾形式的量隨著時間的下降，指示該藥劑是所述腎病和/或疾病的腎并發(fā)病的治療劑。
本發(fā)明還針對一種對其病況由特定的蛋白尿指示的疾病患者的治療方法，包括向需要的人員給予有效劑量的根據(jù)上述方法得到的治療劑。優(yōu)選治療劑是溶酶體活化性化合物。
本發(fā)明的另一個目的是確定樣品中特定蛋白的總含量，包括(a)分離樣品中的所有蛋白；(b)測定特定的蛋白的修飾和未經(jīng)修飾形式；和(c)合計(jì)特定蛋白的修飾和未經(jīng)修飾的形式，以測定樣品中特定蛋白的總含量。
優(yōu)選所述樣品是生物樣品，諸如尿。
參照附圖、下面對本發(fā)明的說明和所附權(quán)利要求書，會更加充分地理解本發(fā)明的這些目的和其它目的。
附圖簡述圖1示出經(jīng)過濾的完整白蛋白進(jìn)入腎小管細(xì)胞及白蛋白分解以提供被排泄的白蛋白片段的過程。
圖2a和2b示出通過尺寸排阻層析法做出的從健康志愿者收集的(a)尿中和(b)血漿中(3H)HSA代表性分布圖形。尿主要含斷裂的白蛋白。而血漿主要含完整的白蛋白。
圖3示出從正常健康志愿者收集的尿樣經(jīng)尺寸排阻層析顯示的斷裂的白蛋白峰，而沒有完整的白蛋白峰。
圖4示出一個糖尿病患者的尿經(jīng)尺寸排阻層析顯示的完整的和斷裂的白蛋白的峰圖5單獨(dú)示出白蛋白的HPLC圖形。
圖6示出取自正常健康志愿者的血漿的HPLC分布圖形，顯示白蛋白峰。
圖7示出取自正常健康志愿者的尿的HPLC分布圖形，示出了白蛋白片段峰，而沒有完整的白蛋白峰。
圖8示出正常白蛋白尿糖尿病患者的尿樣HPLC分布圖形，示出白蛋白分解產(chǎn)物，和在約39-44分鐘保留時間處小的經(jīng)修飾的白蛋白的峰。
圖9示出正常白蛋白尿糖尿病患者的尿的HPLC分布圖形，示出腎功能衰竭的征象，和在約39-44分鐘保留時間處特征性白蛋白尖峰的存在。
圖10示出正常糖尿病患者的HPLC分布圖形，顯示腎功能衰竭的征象，和在約39-44分鐘保留時間處特征性白蛋白尖峰的存在。
圖11示出高白蛋白尿糖尿病患者的HPLC圖形，顯示出高含量的正常白蛋白，和在約39-44分鐘保留時間處白蛋白尖峰的存在。
圖12示出一個患者的縱向研究，其中在糖尿病性腎病發(fā)作前的一個時間檢測了經(jīng)修飾的蛋白，指示出易感糖尿病性腎病的傾向和引起的治療的延遲，這些都依賴常規(guī)的RIA方法。
圖13示出一個患者的縱向研究，其中在糖尿病性腎病發(fā)作前的一個時間檢測了經(jīng)修飾的蛋白，指示出易感糖尿病性腎病的傾向和引起的治療的延遲，這些都依賴常規(guī)的RIA方法。
圖14示出一個患者的縱向研究，其中在糖尿病性腎病發(fā)作前的一個時間檢測了經(jīng)修飾的蛋白，指示出易感糖尿病性腎病的傾向和引起的治療的延遲，這些都依賴常規(guī)的RIA方法。
發(fā)明詳述本申請人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)包括主要血漿蛋白如白蛋白和免疫球蛋白在內(nèi)的蛋白通過腎過濾時，這些物質(zhì)在排泄前由腎內(nèi)的細(xì)胞相繼地降解。經(jīng)過濾的蛋白很可能被腎小管細(xì)胞吸收。腎小管細(xì)胞越出了腎濾器的范圍，并且與初級濾液發(fā)生直接接觸。當(dāng)?shù)鞍子赡I小管細(xì)胞內(nèi)化時，它們被導(dǎo)向溶酶體，在此它們部分地分解為不同尺寸的片段，然后返流至細(xì)胞外部?？梢杂扇魏翁囟愋偷鞍桩a(chǎn)生至少有60種不同片段，這些回流片段然后排泄到尿中。
本申請人發(fā)現(xiàn)，在腎病中蛋白片段受到抑制。這意味著在腎病的患者體內(nèi)將排泄出基本被全長過濾的蛋白。從所排泄的蛋白的斷裂過渡到斷裂的抑制，是發(fā)展新藥和診斷檢驗(yàn)的基礎(chǔ)。例如，伴隨糖尿病腎并發(fā)癥發(fā)作的初始變化與所排泄的白蛋白的片段分布圖形相關(guān)。這導(dǎo)致明顯的高白蛋白尿，其是出現(xiàn)糖尿病性腎病的同意語。這很可能是由于在糖尿病患者體內(nèi)溶酶體的活性受到抑制的緣故。因此，可以配制在發(fā)生腎并發(fā)癥的糖尿病患者體內(nèi)刺激溶酶體活性的藥物。所述藥物還可用于在其中溶酶體活性受到影響的其它腎病，或者用于在非腎的組織中關(guān)閉了溶酶體活性的情況下無腎并發(fā)癥的糖尿病中。這些藥物包括抗增生藥物，諸如抗腫瘤藥。
本申請人發(fā)現(xiàn)一種獨(dú)特的檢測特定蛋白的修飾形式的檢驗(yàn)方法，這些修飾形式是在用常規(guī)的檢驗(yàn)如放射免疫分析能夠檢測特定蛋白的未經(jīng)修飾形式之前在某些對象的尿中檢出的。檢出經(jīng)修飾的蛋白是易感腎病的預(yù)兆。定義“斷裂的蛋白或者白蛋白片段”包括在腎通道過程中發(fā)生化學(xué)、酶或者物理分解之后的腎小球后分解產(chǎn)物。這些成分的尺寸變小，和/或疏水性發(fā)生變化。
本文中所用的“完整的白蛋白、經(jīng)修飾的白蛋白或者白蛋白的修飾形式”指，尺寸與天然白蛋白的尺寸相近且結(jié)構(gòu)特征與天然白蛋白的結(jié)構(gòu)特征相似的成分，其氨基酸序列基本上也與天然白蛋白相同。優(yōu)選經(jīng)過濾的完整蛋白。在高壓液相色譜(HPLC)上它和天然白蛋白在相同的位置或者接近相同的位置處洗脫(圖5)。然而，其結(jié)構(gòu)已通過次要酶介導(dǎo)的在其基本結(jié)構(gòu)上的修飾或添加而被生化修飾，和/或在其三維結(jié)構(gòu)上經(jīng)過物理修飾，從而避開了通常使用抗白蛋白抗體的檢測。生化修飾可以由內(nèi)肽酶或外肽酶之類的酶造成。白蛋白的三維結(jié)構(gòu)可以此某種方式發(fā)生變化。配體可能結(jié)合到白蛋白上，白蛋白也可以發(fā)生上述改變的任何組合。用本發(fā)明方法檢測的經(jīng)修飾的白蛋白不能用當(dāng)前常規(guī)的使用可得抗體的放射免疫分析檢測到。
常規(guī)的抗白蛋白抗體可從任何免疫化學(xué)供應(yīng)商處購買。例如目錄號A6684(克隆號HSA-II)和A2672(克隆號HSA-9)的單克隆抗體、液態(tài)全血清、冷凍干燥的級分、液態(tài)IgG級分及腹水形式的單克隆抗體可以從西格榪公司(Sigma，St.Louis，MO)購買，可以在1994年的西格榪-用于研究的生物化學(xué)有機(jī)化合物和診斷試劑目錄的1151-1152頁免疫化學(xué)一節(jié)查到。
如本文中所用，完整/經(jīng)修飾的白蛋白包括基本上全長的、斷裂的、經(jīng)化學(xué)修飾或者物理修飾的白蛋白。如本文中所用，完整的/經(jīng)修飾的白蛋白包括分子量小于、等于或者大于全長白蛋白的白蛋白，并且其在分離介質(zhì)中在天然白蛋白的位置或者接近天然白蛋白的位置洗脫，例如使用層析法進(jìn)行分離，優(yōu)選HPLC，并且最優(yōu)選疏水性HPLC。如本文中所用，斷裂的白蛋白指常規(guī)抗白蛋白抗體不能檢測的白蛋白片段，并且在診斷早期腎病和/或疾病的腎并發(fā)病中檢測到它們的存在。檢出完整/經(jīng)修飾的白蛋白的存在是易感腎病的指征。
本文中“完整蛋白、經(jīng)修飾的蛋白或者蛋白的修飾形式”包括那些常規(guī)放射免疫分析不能檢測出的基本上全長蛋白。所述蛋白包括但是不限于白蛋白、球蛋白(α球蛋白(α1球蛋白、α2球蛋白)、β球蛋白、γ球蛋白)、優(yōu)球蛋白、I型和II型擬球蛋白、纖維蛋白原、α1酸性糖蛋白(血清類粘蛋白)、α1糖蛋白、α1脂蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、α219S糖蛋白、β1轉(zhuǎn)鐵蛋白、β1脂蛋白、免疫球蛋白A、E、G和M、蛋白激素(包括生長激素、胰島素或甲狀旁腺激素)和其它蛋白(包括辣根過氧化物酶、乳酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶、肌紅蛋白、溶菌酶)。
如本文中所用，“腎病”包括任何腎功能失常。腎病可以通過尿中存在完整或者修飾的白蛋白而識別。優(yōu)選地，可以通過檢測在尿中經(jīng)修飾的蛋白的存在或者在尿中經(jīng)修飾的蛋白隨著時間的增加進(jìn)行腎病的早期診斷。
如本文中所用，“低溶酶體活性”是相對溶酶體正常活性水平和/或正常個體中將蛋白運(yùn)輸?shù)饺苊阁w的溶酶體機(jī)構(gòu)而言的。所述活性不足以斷裂蛋白，從而完整蛋白以比正常的低含量更高的量排泄。
如本文中所用，“溶酶體活化性化合物”指有利于溶酶體復(fù)活的化合物。所述化合物可以直接或間接地作用在溶酶體上導(dǎo)致溶酶體功能的活化。這些化合物可以選自但不限于抗癌化合物、抗增生化合物、撲熱息痛、維生素A(視黃酸)或者視黃醇衍生物。
“高白蛋白尿癥”是由常規(guī)放射免疫分析(RIA)測量的個體尿中排泄200微克白蛋白/分鐘以上的情況。
“微量白蛋白尿癥”是由常規(guī)放射免疫分析(RIA)測量的個體尿中排泄至少20微克白蛋白/分鐘的情況。RIA最低測量到15.6納克/毫升并且可以測量清除率低于6微克/分鐘的正常受檢對象尿中的白蛋白。但是，當(dāng)白蛋白的排泄超過20微克/分鐘時，對腎病的治療受限，而且從此難于完全恢復(fù)。
如本文中所用，“微量白蛋白尿”是由常規(guī)放射免疫分析(RIA)測量的尿中排泄至少20微克白蛋白/分鐘的情況。
如本文中所用，“天然的”和“未經(jīng)修飾的”可互換地用于說明被發(fā)現(xiàn)天然存在于生物體中，優(yōu)選人體中，且沒有由腎小球的過濾過程改變的蛋白。
如本文中所用，“正常個體”是未患其指征為在尿中發(fā)現(xiàn)完整蛋白的疾病的個體。優(yōu)選所述疾病是腎病。
“溶酶體活性的正常水平”是在正常個體未患病的腎中發(fā)現(xiàn)的溶酶體活性水平。
如本文中所用，“正常白蛋白尿”是指尿中排泄的白蛋白用RIA無法檢測的情況，或者尿中排泄20微克白蛋白/分鐘以下的情況(用RIA測量)。
如本文中所用，“疾病的傾向”指正如通過測定經(jīng)修飾的白蛋白等經(jīng)修飾的蛋白的存在和排出速率判斷的，疾病可能在個體中產(chǎn)生。
如本文中所用，“蛋白尿”是指尿中存在蛋白，通常是白蛋白的形式，這是一種可溶于水的可以受熱凝固的蛋白。與此相關(guān)，“特定的蛋白尿”指在尿中存在特定的蛋白。
如本文中所用，“放射免疫分析”是一種使用放射性標(biāo)記的特定抗體或抗原檢測和測量物質(zhì)的方法。
本文中“溶酶體復(fù)活”包括對溶酶體活性的激活，從而，與溶酶體的非活化態(tài)相比，提高了蛋白的分解，尤其是白蛋白的分解。
如本文中所用，“恢復(fù)”是指完全或部分恢復(fù)，從而，與其以前的功能相比，正恢復(fù)的化合物的功能有所改善。
如本文中所用，“總蛋白”是指尿中排泄的以天然的、非經(jīng)修飾的、經(jīng)修飾的或者片段形式存在的特定的經(jīng)過濾的蛋白。這包括不能用常規(guī)的放射免疫分析或者當(dāng)前可得到的檢測蛋白的常規(guī)的方法檢測出的蛋白。所述蛋白優(yōu)選是白蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，所治療的疾病包括，但不限于腎病(腎小球性腎炎、細(xì)菌性和病毒性腎小球腎炎、免疫球蛋白A性腎病變和過敏性紫癜、膜性增殖性腎小球腎炎、膜性腎病、干燥綜合癥、糖尿病性腎病、腎病綜合癥(輕微病變性腎小球腎炎、局灶性腎小球硬化和相關(guān)疾病)、急性腎功能衰竭、急性腎小管間質(zhì)性腎炎、腎盂腎炎、生殖泌尿道炎癥、丙克拉莫普西癥、腎移植排異、麻風(fēng)病、返流性腎病、腎石病等)、遺傳性腎病(髓質(zhì)囊腫、髓質(zhì)海綿腎、多囊腎病(常染色體顯性基因多囊腎病、常染色體隱性基因多囊腎病、結(jié)節(jié)性硬化癥)、馮希二氏綜合癥、家族性薄腎小球基底膜癥、III型膠原腎小球腎病、纖維結(jié)合增殖因子腎小球腎病、阿爾波茨氏綜合癥、磷脂沉著綜合癥、甲髕綜合癥、先天性泌尿系異常)。
在本發(fā)明的一個方面，提供有一種測定腎病和/或疾病的腎并發(fā)病傾向或者早期診斷腎病和/或疾病的腎并發(fā)病的方法。所述方法包括確定尿樣中的白蛋白含量的改變。所述疾病可以是腎病，盡管不必限于腎病。
在本發(fā)明的方法中，在本文中白蛋白僅用作將在尿中被檢測的蛋白的一個例子。在用常規(guī)的RIA檢測患者的白蛋白時，預(yù)期正常白蛋白尿的患者或者正常個體的尿中白蛋白的范圍是，年輕人在3-10微克/分鐘，而老年人要更高些。然而，用HPLC測量時，正常白蛋白尿的患者尿中也有一定量的白蛋白。本申請人發(fā)現(xiàn)所述的量在5微克/分鐘的級別。隨著腎病的進(jìn)展，完整/經(jīng)修飾的蛋白的量會增加到由RIA測量的20至200微克的微量白蛋白尿癥水平。當(dāng)用HPLC或者用測定包括經(jīng)修飾的蛋白在內(nèi)的總蛋白的方法測定時，這會高得多。通過監(jiān)測完整/經(jīng)修飾的白蛋白的增加，可以檢測出腎病的早期指征。然而，這樣的量是不能使用當(dāng)前市售的抗體利用當(dāng)前可得的放射免疫分析等方法檢測出的，這可能是因?yàn)榭贵w檢測某些抗原決定簇的緣故。如果白蛋白以上述的任何方式進(jìn)行修飾，所述抗原決定簇就會被破壞，使經(jīng)修飾的白蛋白不能被檢測出。
在用當(dāng)前可得到的方法如RIA方法檢測白蛋白時，被懷疑患糖尿病性腎病的患者只有在10到15年后才表現(xiàn)出腎臟退化的征象。當(dāng)個體進(jìn)入微量白蛋白尿的狀況時，可以通過RIA檢測至少20微克/分鐘的尿排泄速率。另外，通過觀察經(jīng)修飾的白蛋白的排泄，可檢測腎的改變并且有可能檢測到腎病的發(fā)作。
正常白蛋白尿的受檢對象，或者說正常白蛋白尿糖尿病患者，在用RIA檢測時可以許多年連續(xù)地有低于20微克/分鐘的低白蛋白排泄率。尿中存在白蛋白是腎功能可能受損的一個指征。一旦這個量開始變化，就可以開始治療了。
正常個體的尿中可以檢測到少量的白蛋白。總的經(jīng)過濾的白蛋白在尿中主要以斷裂的白蛋白出現(xiàn)。在正常白蛋白尿的個體中可以檢測到一定的白蛋白。但是，在正常白蛋白尿的個體中白蛋白的排泄速率可以低達(dá)5微克/分鐘。此量一般可用RIA檢測。
本發(fā)明經(jīng)修飾的蛋白可以通過領(lǐng)域內(nèi)公知的各種方法檢測，包括但不限于層析法、電泳法和沉積法，或者這些方法的組合，這在下列文獻(xiàn)中進(jìn)行了說明(Karger BL、Hancock WS編輯，生物大分子的高分離度分離和分析。第1部分，酶學(xué)方法基礎(chǔ)(High ResolutionSeparation and Analysis of biological Macromolecules.Part AFundamentals in Methods in Enzymology)，Vol.270，1996，AcademicPress，San Diego，California，USA；Karger BL、Hancock WS編輯，生物大分子的高分度分離和分析。第2部分，酶學(xué)方法的應(yīng)用(HighResolution Separation and Analysis of biological Macromolecules.Part BApplications in Methods in Enzymology)，Vol.271，1996，Academic Press，San Diego，California，USA；或Harding SE，Rowe，AJ，Horton JC編輯，生物化學(xué)和高分子科學(xué)中的分析超速離心(AnalyticalUltracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science)，1992，RoyalSoc.Chemistry，Cambrige，UK)。這些文獻(xiàn)在此全文引作參考。
電泳方法包括，但不限于，移動界面電泳、區(qū)帶電泳和等電點(diǎn)聚焦。
層析法包括，但不限于分配層析、吸附層析、紙層析、薄層層析、氣液層析、凝膠層析、離子交換層析、親合層析和疏水作用層析。所述方法優(yōu)選是定級凝膠層析(sizing gel chromatography)和疏水作用層析。所述方法更優(yōu)選是使用HPLC柱的疏水作用層析。
本申請人發(fā)現(xiàn)，在糖尿病中，如果用常規(guī)的RIA分析，正常白蛋白尿患者幾乎都有不可檢測量的白蛋白。他們看起來正常。但是用HPLC檢測尿時，經(jīng)修飾的白蛋白的含量比在正常個體中所發(fā)現(xiàn)的高得多。這種白蛋白差別可以歸諸于常規(guī)的RIA不足以檢測所有完整的或者經(jīng)修飾的白蛋白(總白蛋白)。因此，優(yōu)選用HPLC產(chǎn)生斷裂分布圖形。HPLC的斷裂分布圖形以一系列代表數(shù)種完整或者經(jīng)修飾的白蛋白的峰為特征。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，測定受檢對象的腎病傾向或者用于腎病早期診斷的方法是在受檢對象出現(xiàn)微量白蛋白尿之前測定的。
通過本發(fā)明的HPLC方法測量白蛋白含量，可提供與通過常規(guī)的RIA測量所不同的結(jié)果。用HPLC技術(shù)，在正常個體中可以觀察到低含量的白蛋白。當(dāng)經(jīng)修飾的白蛋白開始被檢測出并且其含量增加并向微量白蛋白尿發(fā)展時，就可以確定患者有腎病的傾向。
在正常個體中，HPLC產(chǎn)生的斷裂分布圖形是以在全長天然白蛋白洗脫區(qū)域沒有峰為特征的。相反，可以檢測到多個斷裂的白蛋白。純蛋白產(chǎn)物(未修飾的)基本上產(chǎn)生一個單峰。例如，使用疏水性HPLC，可以觀察到白蛋白在39-44分鐘范圍內(nèi)洗脫(圖5)。這樣，正常個體可以提供沒有腎病或者沒有腎病傾向的清楚的斷裂分布圖形。但是，隨著腎病的進(jìn)展，首先，經(jīng)修飾的白蛋白含量增加，以后可以檢測出天然形式的白蛋白。斷裂分布圖形開始改變并且在全長白蛋白顯示范圍內(nèi)更多地產(chǎn)生附加尖峰或者增大的峰，指示在尿中更多的完整/經(jīng)修飾的白蛋白。
由HPLC產(chǎn)生的尿樣的斷裂分布圖形中，經(jīng)修飾的白蛋白可以出現(xiàn)在天然白蛋白洗脫的區(qū)域內(nèi)，但是可以表現(xiàn)出多重峰，指示存在多種形式的經(jīng)修飾的白蛋白。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方式中，可以通過確定至少一種經(jīng)修飾的白蛋白存在或者識別至少一種經(jīng)修飾的白蛋白來測量腎病的傾向。這可以通過在HPLC分布圖形上特定的峰的存在來確定或者識別，優(yōu)選所述峰在相應(yīng)于天然白蛋白的洗脫位置的區(qū)域內(nèi)。
用于檢測經(jīng)修飾的白蛋白或未經(jīng)修飾的白蛋白的HPLC柱可以是疏水柱，例如Zorbax 300 SB-CB(4.6毫米×150毫米)?？梢允褂?0微升的進(jìn)樣環(huán)管。適用于HPLC檢測白蛋白及其斷裂產(chǎn)物的洗脫溶劑可以包括標(biāo)準(zhǔn)洗脫溶劑諸如乙腈溶劑。優(yōu)選可使用水/1％三氟乙酸(TFA)緩沖液，然后用60％乙腈/0.09％TFA的緩沖液。發(fā)現(xiàn)0-100％的60％乙腈/0.9TFA的梯度是適當(dāng)?shù)摹?br> 用于疏水性柱的適合的HPLC條件可以是A溶劑H2O，1％三氟乙酸B溶劑60％乙腈，0.09％TFAA2溶劑99.96＞00.0048.58分鐘壓力9.014兆帕(約1100磅/平方英寸)B2溶劑0.04＞100.049.58分鐘壓力7.154兆帕HPLC中使用的波長可以為約214納米。
經(jīng)修飾的白蛋白可以在39-44分鐘之間洗脫(圖5)。白蛋白片段可以洗脫得早得多，主要在少于20分鐘時洗脫。
所述用于確定腎病傾向的方法可以用于任何個體。腎病可以由數(shù)種因素引起，包括細(xì)菌感染、過敏反應(yīng)、先天缺陷、結(jié)石、腫瘤化學(xué)品，或者由糖尿病引起。優(yōu)選將所述方法用于確定可進(jìn)展為腎病的糖尿病患者的腎病傾向。個體優(yōu)選是正常白蛋白尿的糖尿病患者。然而，可通過確定完整或經(jīng)修飾的白蛋白在尿中的含量增加，檢測正常個體的腎病傾向。
本發(fā)明的方法可以使用如以上所述的非抗體的分離法進(jìn)行。然而，也可以使用經(jīng)修飾的白蛋白的特異性抗體來檢測經(jīng)修飾的蛋白的存在。
經(jīng)修飾的蛋白的抗體可以使用以下方法獲得。此法僅以舉例的方式具體地對白蛋白進(jìn)行說明，并且可以輕易地應(yīng)用于尿中任何其它蛋白的抗體的產(chǎn)生。所述方法的目的是，確定哪個經(jīng)修飾的白蛋白分子是識別例如將發(fā)展成腎并發(fā)癥的糖尿病患者的最敏感的標(biāo)識。
通過定量地分離經(jīng)修飾的白蛋白分子，例如通過制備性HPLC進(jìn)行分離，對經(jīng)修飾的白蛋白加以區(qū)別。對經(jīng)修飾的蛋白與配基的結(jié)合如糖化進(jìn)行分析。然后確定單個經(jīng)修飾的蛋白的氨基酸序列，優(yōu)選使用質(zhì)譜并使用下述文獻(xiàn)中說明的方法Karger BL，Hancock WS編輯，生物大分子的高分離度分離和分析。第1部分，酶學(xué)方法基礎(chǔ)(HighResolution Separation and Analysis of biological Macromolecules.Part AFundamentals in Methods in Enzymology)，Vol.270，1996，AcademicPress，San Diego，California，USA；或Karger BL，Hancock WS編輯，生物大分子的高分離度分離和分析。第2部分，酶學(xué)方法的應(yīng)用(HighResolution Separation and Analysis of biological Macromolecules.Part BApplications in Methods in Enzymology)，Vo1.271，1996，Academic Press，San Diego，California，USA。這些文獻(xiàn)在本文中以全文引作參考。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以有約3至4種修飾的白蛋白。
產(chǎn)生抗經(jīng)修飾的白蛋白的抗體的方法正尋求發(fā)展，用于一種診斷性免疫分析，對預(yù)示例如向腎并發(fā)癥發(fā)展的糖尿病患者的經(jīng)修飾的白蛋白進(jìn)行檢驗(yàn)。為了達(dá)到這個目的，通過HPLC制備足量的經(jīng)修飾的白蛋白。通過向兔子之類的動物連續(xù)地注射經(jīng)修飾的白蛋白得到抗體，以產(chǎn)生好的效價，并使用常規(guī)技術(shù)分離所述抗體，方法例如說明在例如，Goding JW，單克健抗體原理與實(shí)踐。單克隆抗體的產(chǎn)生和在細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)中的應(yīng)用(Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice.Production and Application of MonoclonalAntibodies in Cell Biology，Biochemistry and Immunology)，第二版，1986，Academic Press，London，UK；或Johnstone A，Thorpe R，實(shí)踐中的免疫化學(xué)(Immunochemistry in Practice)，第三版，1996，Blackwell ScienceLtd，Oxford，UK。這些文獻(xiàn)在本文以全文引作參考。得到的抗體可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體。
優(yōu)選地，至少分離并且識別一種經(jīng)修飾的白蛋白，用于確定腎病的傾向性。分離的品種可以用作產(chǎn)生在免疫分析中使用的抗體?？贵w可以標(biāo)以酶、放射性、熒光或者化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。檢測可以包括但不限于放射免疫分析、免疫放射分析、熒光免疫分析、酶聯(lián)免疫分析和A蛋白免疫分析。分析可以用例如下述文獻(xiàn)說明的方式進(jìn)行Goding JW，單克隆抗體原理與實(shí)踐。單克隆抗體的產(chǎn)生和在細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)中的應(yīng)用(Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice.Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology，Biochemistry and Immunology)，第二版，1986，Academic Press，London，UK；Johnstone A，Thorpe R，實(shí)踐中的免疫化學(xué)(Immunochemistry inPractice)，第三版，1996，Blackwell Science Ltd，Oxford，UK；或PriceCP，Newman DJ編輯，免疫分析的原理與實(shí)踐(Principles and Practiceof Immunoassay)，第二版，1997，Stockton Press，New York，NY，USA。這些文獻(xiàn)在本文中以全文引入作參考。
本發(fā)明的一個目的是提供一種物品或者試劑盒，用于快速和準(zhǔn)確地測定樣品中諸如經(jīng)修飾的白蛋白之類的經(jīng)修飾的蛋白的存在或不存在，可按所希望的進(jìn)行定量或者非定量測定。所述試劑盒中的各個部分可以個別地包裝在其各自的適宜的容器中。各個容器還可以以識別內(nèi)含物的方式加上標(biāo)簽。而且，個別包裝的組件可以放置在一個可以裝下所有希望的組件的較大的容器中?？梢杂信c此分析關(guān)聯(lián)的一個說明書，它說明如何使用此試劑盒。此說明書可以寫在或者附著在所述試劑盒上。
本發(fā)明還針對確定腎病和/或疾病的腎并發(fā)病的治療劑的方法，包括(a)向需要的人員給予認(rèn)為能治療所述疾病的藥劑；(b)從該人員得到尿樣；和(c)分析尿樣中蛋白的修飾形式，其中，蛋白的修飾形式在尿樣中的存在或者缺乏，或者蛋白的修飾形式的量隨著時間的下降，指示該藥劑是所述腎病和/或疾病的腎并發(fā)病的治療劑。治療劑可以是溶酶體活化劑，其可以直接或者間接地活化溶酶體，從而引起溶酶體消化腎小球后過濾的蛋白，這正是健康腎的指征。
把蛋白運(yùn)輸?shù)饺苊阁w的過程在糖尿病的白蛋白尿機(jī)制中起一定作用。涉及運(yùn)輸?shù)募?xì)胞內(nèi)分子是蛋白激酶C(PKC)。可以配制活化溶酶體運(yùn)輸或者抑制PKC的藥品或者制劑。
因此，在本發(fā)明的一個方面，提供有一種溶酶體活化性化合物，用于復(fù)活溶酶體或者把底物導(dǎo)向溶酶體或把產(chǎn)物從溶酶體導(dǎo)出的過程。
在本發(fā)明的另一個方面，提供一種包括一種溶酶體活化性化合物和一種載體的組合物。
在本發(fā)明的又一個方面，提供一種預(yù)防或者治療腎病的方法，所述方法包括向受治療對象給予有效量的溶酶體活化性化合物。
在本發(fā)明的再一個方面，提供一種篩選多重化合物的方法，以辨別能夠活化溶酶體或者把底物導(dǎo)向溶酶體或把產(chǎn)物從溶酶體導(dǎo)出的過程的化合物，所述的方法包括以下步驟(a)使所述化合物暴露于溶酶體并且分析所述化合物活化溶酶體的能力，其中所述溶酶體在活化后改變了活性；(b)分析把腎組織內(nèi)的細(xì)胞加工過程恢復(fù)到基本正常水平的能力，其中，所述的腎組織溶酶體活性低下；和/或(c)分析把腎組織內(nèi)的組織代謝恢復(fù)到基本正常水平的能力，其中，所述的腎組織溶酶體活性低下。
溶酶體可以與腎中的蛋白特別是白蛋白的分解相關(guān)。在微量白蛋白尿的情況下，相當(dāng)量的白蛋白避開了溶酶體的分解，可能是由于溶酶體失活造成。溶酶體分解的恢復(fù)可以恢復(fù)腎中細(xì)胞加工過程和組織代謝的平衡。
溶酶體活化性化合物可以是直接或者間接地作用在溶酶體上的化合物。通過間接作用，所述化合物可以作用在影響溶酶體活性的部分上。無論如何，結(jié)果活化了溶酶體，由此加強(qiáng)了蛋白分解。
在本發(fā)明的另一個方面中，提供了包括溶酶體活化性化合物和載體的組合物。
所述組合物可以是生理可接受或者藥理可接受的組合物。然而，這將是讓溶酶體活化性化合物能夠穩(wěn)定儲存的組合物。當(dāng)所述組合物是藥理可接受組合物時，它可以適用于預(yù)防或者治療腎病的方法。
本發(fā)明的另一個方面，提供有一種預(yù)防或治療腎病的方法，所述的方法包括向受治對象給予有效量的溶酶體活化性化合物。
如上所述，溶酶體活化性化合物可以通過復(fù)活溶酶體起作用，從而全部或部分地恢復(fù)細(xì)胞加工過程和組織代謝，結(jié)果完全地或者部分地恢復(fù)了腎功能?？傊?，向患腎病的動物給予溶酶體活化性化合物可以完全或者部分地恢復(fù)溶酶體活性。
給藥的方法可以是口服或胃腸道外給藥?？诜梢园ㄓ闷瑒?、膠囊、粉劑、糖漿等給藥。胃腸道外給藥方法可以包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或者腹膜內(nèi)給藥途徑。
溶酶體活性的改變優(yōu)選地是加強(qiáng)溶酶體活性從而改善白蛋白分解的改變。不僅活化溶酶體還改善細(xì)胞加工過程和/或組織代謝的能力是最希望的溶酶體活化性化合物的特征。優(yōu)選地，希望使用溶酶體活化性化合物恢復(fù)腎功能。
在本發(fā)明的另一個方面，提供一種用于預(yù)防受治療對象腎病的方法，所述方法包括(a)測量尿樣中的總蛋白含量；和(b)檢測尿樣中已被修飾從而不能由常規(guī)的RIA方法檢測的完整白蛋白的量的變化，其中檢測出經(jīng)修飾的蛋白是腎病傾向的指征；并且，在確定所述變化時，治療動物的腎病。
以下實(shí)施例以舉例說明本發(fā)明的方式而不是以限制的方式提供。實(shí)施例實(shí)施例1人血清白蛋白(HSA)的尺寸排阻層析用正常健康的志愿者提供用于分析尿中的白蛋白分布的尿。
把3H[HAS](人血清白蛋白)注射入健康志愿者，收集尿和血漿，然后使用G-100柱通過尺寸排阻層析進(jìn)行分析。在4℃用PBS(pH＝7.4)以20毫升/小時速度洗脫。柱的空隙容積(V0)用T2000藍(lán)右旋糖酐測定，用氚化水測定總?cè)莘e。
氚放射性用3毫升的閃爍體在1毫升水樣中測定，通過Wallac 1410型液閃計(jì)數(shù)器(Wallae Turku，F(xiàn)inland)進(jìn)行測量。
圖2示出尿和血漿中的白蛋白分布。實(shí)施例2正常健康志愿者和糖尿病患者中的白蛋白排泄如把實(shí)施例1中所使用的3H[HAS]注射入正常的健康志愿者和糖尿病患者中，收集尿樣并且如實(shí)施例1中所述測定3H[HAS]。
正常的健康志愿者(圖3)在如實(shí)施例1進(jìn)行的尺寸排阻層析中顯示白蛋白片段的排泄。
糖尿病患者(圖4)在尺寸排阻層析中顯示存在基本上全長的和斷裂的白蛋白。然而，這些方法可檢測的白蛋白排泄速率在5微克/分鐘(對照)和1457微克/分鐘(糖尿病患者)的級別。實(shí)施例3在HPLC上測定總白蛋白和完整/經(jīng)修飾的白蛋白從正常健康志愿者、正常白蛋白尿的糖尿病患者和高白蛋白尿患者收集尿樣。用50的尿樣采集容器收集中段的尿。把尿樣冷凍直至進(jìn)一步使用。進(jìn)行HPLC分析前，把尿樣在5000g下離心。
在HPLC上用疏水柱Zorbax 300 SB-CB(4.6毫米×150毫米)分析樣品。使用50微升的進(jìn)樣環(huán)管。
用以下條件從柱中洗脫樣品
A溶劑H2O，1％三氟乙酸B溶劑60％乙腈，0.09％TFAA2溶劑99.96＞00.0049.58分鐘壓力9.014兆帕(約1100磅/平方英寸)B2溶劑0.04＞100.049.58分鐘壓力7.154兆帕使用214納米波長。結(jié)果圖5單獨(dú)示出白蛋白的HPLC分布圖形。在約39-44分鐘保留時間洗脫出的基本為一單峰。
圖6示出血漿的HPLC分布圖形，在約39-44分鐘顯示一獨(dú)特的白蛋白峰，還有其它峰，對應(yīng)于其它血漿蛋白。
圖7示出正常健康志愿者的尿樣的HPLC分布圖形，顯示無白蛋白峰。此個體可能是通過活性溶酶體將排泄到尿中的白蛋白分解?；旧蠑嗔训漠a(chǎn)物是明顯的，其顯示一些品種占主導(dǎo)，特別是保留時間約短于14.5分鐘的品種占主導(dǎo)。
在分析正常白蛋白尿的糖尿病患者的尿樣(用RIA測量白蛋白排泄速率是8.07微克/分鐘)時(圖8)，在約39-44分鐘保留時間洗脫出少量經(jīng)修飾的白蛋白。盡管常規(guī)的檢測指示在尿樣中存在＜6毫克/升的白蛋白，但用本發(fā)明的方法顯示該尿樣中實(shí)際的白蛋白含量是26.7毫克/升。對該個體原應(yīng)當(dāng)開始進(jìn)行腎病治療。正常、健康的志愿者體內(nèi)存在白蛋白副產(chǎn)物或者斷裂的白蛋白。
分析了取自正常白蛋白尿的糖尿病患者的另一尿樣(白蛋白排泄速率為17.4微克/分鐘)(圖9)。RIA檢測顯示該患者的尿中排泄白蛋白。然而，在HPLC上(圖9)，在約39-44分鐘保留時間顯現(xiàn)一個白蛋白峰或者經(jīng)修飾的白蛋白的峰。常規(guī)的檢測指示在尿樣中存在＜6毫克/升的白蛋白，而用本發(fā)明的方法顯示該尿樣中實(shí)際的白蛋白含量是81.3毫克/升。對該個體原應(yīng)當(dāng)開始進(jìn)行腎病治療。此峰開始顯示多重峰形。相應(yīng)于完整的白蛋白的較小峰顯示，在39-44分鐘保留時間處的峰可能是經(jīng)修飾的白蛋白。這個白蛋白峰的存在與沒有白蛋白峰的正常健康志愿者的分布圖形相比，表示了完整/經(jīng)修飾的白蛋白量的可檢測水平的改變。這可以作為具有腎病傾向的信號。
分析了正常白蛋白尿的糖尿病患者的另一個尿樣(白蛋白排泄速率4.37微克/分鐘)，HPLC分布圖形示于圖10。這里還是，經(jīng)修飾的白蛋白峰在約39-44分鐘保留時間處檢測到，表現(xiàn)為多重峰。這名患者原先用RIA記錄時也是白蛋白正常。常規(guī)的檢測指示在尿樣中存在＜6毫克/升的白蛋白，而用本發(fā)明的方法顯示該尿樣中實(shí)際的白蛋白含量是491毫克/升。對該個體原應(yīng)當(dāng)開始進(jìn)行治療。很清楚，對于分辨這些改變，必須作經(jīng)修飾的白蛋白的分析。該患者可確定為有腎病的傾向。隨著腎病的進(jìn)展，經(jīng)修飾的白蛋白的峰將繼續(xù)增加。
這示于圖11中，圖中分析了高白蛋白尿的糖尿病患者的尿樣。在39-44分鐘保留時間處出現(xiàn)相當(dāng)顯著的白蛋白峰，顯示為多重峰。這名患者的白蛋白含量是1796毫克/升。對該個體的治療正在進(jìn)行中。
如圖12-14的縱向研究所示，本發(fā)明的方法導(dǎo)致了對腎病傾向的早期檢測。圖12至14示出用ACE抑制劑對糖尿病的治療要比本應(yīng)使用本發(fā)明經(jīng)修飾的白蛋白的檢測方法的情況開始得晚。用根據(jù)本發(fā)明的方法檢測經(jīng)修飾的白蛋白，是比用常規(guī)的RIA更加有效地預(yù)示腎病發(fā)作的方法。
本文所提及的全部文獻(xiàn)都以全文引作參考。
最后，應(yīng)當(dāng)理解，可以作出各種其它的修改和/或變化，而不背離如說明書提及的本發(fā)明的精神。
權(quán)利要求
1.腎病和/或疾病的腎病并發(fā)癥的早期診斷方法，包括(a)分離尿樣中的所有蛋白；和(b)檢測樣品中蛋白的修飾形式，其中檢測出經(jīng)修飾的蛋白是腎病和/或疾病的腎病并發(fā)癥的早期指征。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的疾病包括腎病變、尿崩癥、I型糖尿病、II型糖尿病、腎病(腎小球性腎炎、細(xì)菌性和病毒性腎小球腎炎、免疫球蛋白A性腎病變和過敏性紫癜、膜性增殖性腎小球腎炎、膜性腎病、干燥綜合癥、腎病綜合癥(輕微病變性腎小球腎炎、局灶性腎小球硬化和相關(guān)疾病)、急性腎功能衰竭、急性腎小管間質(zhì)性腎炎、腎盂腎炎、生殖泌尿道炎癥、丙克拉莫普西癥、腎移植排異、麻風(fēng)病、返流性腎病、腎石病等)、遺傳性腎病(髓質(zhì)囊腫、髓質(zhì)海綿腎、多囊腎病(常染色體顯性基因多囊腎病、常染色體隱性基因多囊腎病、結(jié)節(jié)性硬化癥)、馮希二氏綜合癥、家族性薄腎小球基底膜癥、III型膠原腎小球腎病、纖維結(jié)合增殖因子腎小球腎病、阿爾波茨氏綜合癥、磷脂沉著綜合癥、甲髕綜合癥、先天性泌尿系異常)、單克隆免疫球蛋白病(多發(fā)性骨髓瘤、淀粉樣變性病及相關(guān)疾病)、熱性疾病(家族性地中海熱、HIV感染-愛滋病)、炎性疾病(全身性血管炎(結(jié)節(jié)性多動脈炎、韋格納氏壞死性肉芽腫、多動脈炎、壞死性和新月形腎小球腎炎)、多發(fā)性肌炎-皮肌炎、胰腺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、痛風(fēng))、血液疾病(鐮狀細(xì)胞病、血栓性血小板減少性紫癜、溶血性-尿毒性綜合癥、急性皮質(zhì)壞死、腎血栓栓塞)、創(chuàng)傷和外科手術(shù)(大范圍損傷、燒傷、腹部及血管手術(shù)、輸入麻醉劑)、藥物(青霉胺、類固醇)和藥物濫用、惡性病(上皮癌(肺癌、乳腺癌)、腺癌(腎)、黑素瘤、淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤)、循環(huán)系統(tǒng)疾病(心肌梗塞、心功能衰竭、周圍血管病、高血壓、冠心病、非粥性硬化性心血管病、動脈粥性硬化性心血管病)、皮膚病(牛皮癬、全身性硬皮病)、呼吸系統(tǒng)疾病(COPD、縮窄性睡眠性呼吸暫停、高空無汗癥)及內(nèi)分泌疾病(肢端肥大癥、糖尿病、尿崩癥)。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白包括白蛋白、球蛋白(α球蛋白(α1球蛋白、α2球蛋白)、β球蛋白、γ球蛋白)、優(yōu)球蛋白、I型和II型擬球蛋白、纖維蛋白原、α1酸性糖蛋白(血清類粘蛋白)、α1糖蛋白、α1脂蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、α219S糖蛋白、β1轉(zhuǎn)鐵蛋白、β1脂蛋白、免疫球蛋白A、E、G和M、辣根過氧化物酶、乳酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶、肌紅蛋白、溶菌酶、蛋白激素、生長激素、胰島素或甲狀旁腺激素。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述蛋白是白蛋白。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，經(jīng)修飾的蛋白用非抗體手段檢測。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述非抗體手段包括層析、電泳或者沉積。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述非抗體手段包括分配層析法、吸附層析法、紙層析法、薄層層析法、氣液色譜法、凝膠色譜法、離子交換層析法、親合層析法、疏水作用層析法、移動界面電泳法、區(qū)帶電泳或者等電點(diǎn)聚焦法。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述非抗體手段包括疏水作用層析法。
9.權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述疏水作用層析法在高壓液相色譜(HPLC)裝置中進(jìn)行。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述經(jīng)修飾的蛋白用對蛋白的未經(jīng)修飾和修飾形式都有特異性的抗體進(jìn)行檢測。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，抗體對經(jīng)修飾的蛋白特異。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，將抗體與酶、放射性、熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記連接，其中檢測步驟包括放射免疫分析、免疫放射分析、熒光免疫分析、酶聯(lián)免疫分析或A蛋白免疫分析。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)尿中存在的經(jīng)修飾的蛋白隨時間增加時，診斷為所述疾病的早期階段。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，常規(guī)的放射免疫方法不能檢測所述經(jīng)修飾的蛋白。
15.一種物品，用于診斷一種疾病的早期，其中在尿中發(fā)現(xiàn)完整的蛋白是所述疾病的指征，包括(a)一種容器，含有一種對蛋白的修飾形式特異的標(biāo)記抗體；(b)一種容器，含有用于開展抗體反應(yīng)的試劑；和(c)對如何使用組件(a)和(b)進(jìn)行診斷的說明書。
16.一種方法，用于確定腎病和/或疾病的腎并發(fā)病的治療劑，包括(a)向需要的人員給予認(rèn)為能治療所述疾病的藥劑；(b)從該人員得到尿樣；和(c)分析尿樣中蛋白的修飾形式，其中，蛋白的修飾形式在尿樣中的存在或者缺乏，或者蛋白的修飾形式的量在尿樣中隨著時間的下降，指示該藥劑是所述腎病和/或疾病的腎并發(fā)病的治療劑。
17.一種方法，用于治療患腎病和/或疾病的腎并發(fā)癥的患者，包括向需要的人員給予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求16所述方法得到的治療劑。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述治療劑是溶酶體活化性化合物。
19.一種方法，用于測定樣品中特定蛋白的總量，包括(a)分離尿樣中的所有蛋白；和(b)檢測特定蛋白的修飾和未經(jīng)修飾形式和(c)合計(jì)特定蛋白的修飾和未經(jīng)修飾形式，以測定樣品中特定蛋白的總量。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述樣品是生物樣品。
全文摘要
公開了一種疾病的早期診斷方法,其中在尿中發(fā)現(xiàn)完整的蛋白是所述疾病的指征。所述方法包括使用免疫學(xué)方法或非免疫學(xué)方法檢驗(yàn)?zāi)驑?以檢測樣品中經(jīng)修飾的蛋白的存在。還公開了預(yù)防和治療所述疾病的方法。
文檔編號A61P21/00GK1331801SQ99814862
公開日2002年1月16日 申請日期1999年12月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月21日
發(fā)明者韋恩·D·康珀 申請人:莫納什大學(xué)