一種用于IgA腎病檢測的系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種用于IgA腎病檢測的系統(tǒng)，包括：尿液采集裝置，以采集尿液；miRNA檢測裝置，以檢測尿液中miRNA的表達量。本實用新型的檢測樣本是尿液，而不是腎組織，最明顯的優(yōu)勢就是具有無創(chuàng)傷檢測的特點，由于檢測時無明顯禁忌癥，可以適用于所有患者的檢測。
【專利說明】—種用于IgA腎病檢測的系統(tǒng)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型涉及醫(yī)療診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種用于IgA腎病檢測的系統(tǒng)。

【背景技術(shù)】
[0002]目前，IgA腎病診斷的主要的檢測方法是腎活檢，特征是腎小球系膜區(qū)IgA團塊樣或顆粒樣沉積，腎活檢時患者呈俯臥位，穿刺針在超聲的引導(dǎo)下于患者背部進針，快速取出腎組織，在一系列固定和染色后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察腎臟變化情況，以診斷腎病類型和判斷預(yù)后，但腎活檢存在著至少下列所述的技術(shù)缺點:
[0003]1、腎活檢為有創(chuàng)性檢查，在早期患者尿常規(guī)正常的情況下，不推薦進行腎活檢。在患者病情加重需要重新評估腎臟病理時，多次穿刺不僅加重腎損傷，還有合并出血、感染等并發(fā)癥的風(fēng)險，難以反復(fù)進行。
[0004]2、腎活檢有許多禁忌癥。如絕對禁忌癥、出血傾向明顯、重度高血壓、精神病或不配合者、孤立腎、小腎等；相對禁忌癥，腎臟感染呈活動期(如活動性腎盂腎炎、腎結(jié)核、腎膿腫)、腎腫瘤或腎動脈瘤、多囊腎、過度肥胖、慢性腎功能衰竭、重度腹水、心功能衰竭、妊娠等。因此，不是每個腎臟病患者都適合做腎活檢檢查。
[0005]3、腎活檢還有許多的并發(fā)癥。最常見的如血尿，腎周圍膿腫，腰痛及腰部不適，發(fā)熱，動靜脈瘺等。
[0006]4、腎活檢從準備穿刺到得到病理結(jié)果耗時較長，準備步驟較多，反應(yīng)較慢。由于是有創(chuàng)檢查，患者需要術(shù)前停用抗凝藥，對于有心血管疾病必須長期使用抗凝藥的患者不利，且患者術(shù)后必須躺在床上24小時絕對臥床，不得下床走動。而從穿刺出腎組織到固定、石蠟包埋、免疫組化染色，直到最后顯微鏡下觀察得出病理結(jié)果，一般需要5-7天時間，對于進展較快的急進性腎小球腎炎等腎病往往會造成診斷不及時，錯診或漏診的情況時有發(fā)生。
[0007]因此，目前IgA腎病的診斷技術(shù)有待進一步改進。
實用新型內(nèi)容
[0008]本實用新型的目的是提供一種用于IgA腎病的系統(tǒng)，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中的檢測時對機體創(chuàng)傷大、檢測時間長、適用范圍小、檢測步驟復(fù)雜的技術(shù)問題。
[0009]本實用新型提出了一種用于IgA腎病檢測方法的系統(tǒng)，包括:
[0010]尿液米集裝置，以米集尿液；
[0011]miRNA檢測裝置，以檢測尿液中miRNA的表達量。
[0012]可選的，所述miRNA 為 miRNA_25、miRNA_144 以及 miRNA_486 中的至少一種。
[0013]可選的，所述miRNA檢測裝置為熒光定量PCR設(shè)備、Taqman探針設(shè)備以及LightCycle探針設(shè)備。
[0014]可選的，所述熒光定量PCR設(shè)備為SYBR Green熒光定量PCR設(shè)備。
[0015]可選的，還包括試劑盒；
[0016]所述試劑盒包括裝有引物的第一試劑瓶和裝有管家基因的第二試劑瓶。
[0017]可選的，所述管家基因為U6-25管家基因。
[0018]可選的，所述引物包括:
[0019]MiRNA-25 的引物為:CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA ；
[0020]和/ 或，MiRNA-144 的引物為:UACAGUAUAGAUGAUGUACU ;
[0021]和/ 或，MiRNA-486 的引物為:UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG。
[0022]可選的，所述引物還包括U6-25管家基因的引物為:AAAGCAGGCUUUAAAGGAACCU。
[0023]根據(jù)本實用新型的用于IgA腎病檢測的系統(tǒng)，可以取得以下所述的至少一種積極技術(shù)效果:
[0024]1、由于檢測的樣本是尿液，而不是腎組織，所以本實用新型的最明顯的優(yōu)勢就是具有無創(chuàng)傷的特點，可以根據(jù)疾病的病情變化需要反復(fù)或連續(xù)留取和測試。另外，所需留取尿液不會給患者帶來任何損傷和風(fēng)險，非常安全可靠。
[0025]2、由于檢測時無明顯禁忌癥，可以適用于所有患者的檢測。
[0026]3、由于所用的光定量PCR、Taqman探針以及LightCycle探針的方法已經(jīng)是常見的技術(shù)手段，并且具有檢測準確、安全可靠、簡單易行等的優(yōu)點，一般的醫(yī)護人員，例如鄉(xiāng)鎮(zhèn)和社區(qū)的基層醫(yī)護人員，經(jīng)I周左右的培訓(xùn)就可完全掌握該方法，大大縮短了培訓(xùn)周期，有效解決了現(xiàn)有腎組織活檢對于醫(yī)院和醫(yī)護人員要求嚴格限制的問題，從而使本實用新型具有更廣闊的應(yīng)用空間和巨大的推廣價值。
[0027]4、與現(xiàn)有腎組織活檢的3000元的費用相比，本實用新型所用試劑盒一套僅需5700元左右，可反復(fù)使用50次，從而大大降低了患者的診斷費用。
[0028]5、現(xiàn)有腎組織活檢從患者入院準備到最后給出診斷報告周期大約為I周，而本實用新型能在24小時內(nèi)給出結(jié)果，且不影響患者的工作、學(xué)習(xí)和生活，不僅大大縮短了患者等待時間，也為患者爭取到了及時對癥治療的寶貴時間，可以有效防止錯診或漏診情況的發(fā)生。
[0029]6、由于患者的尿液簡單易得，且容易保存，還適合偏遠地區(qū)大量篩查患者時的使用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]本實用新型的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0031]圖1是根據(jù)本實用新型實施例中的用于IgA腎病檢測方法的建立的方法流程示意圖；
[0032]圖2是根據(jù)本實用新型實施例中的IgA腎病患者與健康者對照組間MiRNA-25表達量的比較圖，在圖中，橫坐標為分組，I為健康者對照組，2為IgA腎病患者組,縱坐標為MiRNA-25的相對表達量；
[0033]圖3是根據(jù)本實用新型實施例中的IgA腎病患者與健康者對照組間MiRNA-144表達量的比較圖，在圖中，橫坐標為分組，I為健康者對照組，2為IgA腎病患者組,縱坐標為MiRNA-144的相對表達量；
[0034]圖4是根據(jù)本實用新型實施例中的IgA腎病患者與健康者對照組間MiRNA-486表達量的比較圖，在圖中，橫坐標為分組，I為健康者對照組，2為IgA腎病患者組,縱坐標為MiRNA-486的相對表達量；
[0035]圖5是根據(jù)本實用新型實施例中的IgA腎病患者與非IgA型腎病的腎病患者對照組間MiRNA-25表達量的比較圖，在圖中，橫坐標為分組，I為IgA腎病患者組，2為非IgA型腎病的腎病患者對照組，縱坐標為MiRNA-25的相對表達量；
[0036]圖6是根據(jù)本實用新型實施例中的IgA腎病患者與非IgA型腎病的腎病患者對照組間MiRNA-144表達量的比較圖，在圖中，橫坐標為分組，I為IgA腎病患者組，2為非IgA型腎病的腎病患者對照組，縱坐標為MiRNA-25的相對表達量；
[0037]圖7是根據(jù)本實用新型實施例中的IgA腎病患者與非IgA型腎病的腎病患者對照組間MiRNA-486表達量的比較圖，在圖中，橫坐標為分組，I為IgA腎病患者組，2為非IgA型腎病的腎病患者對照組，縱坐標為MiRNA-25的相對表達量；
[0038]圖8是根據(jù)本實用新型實施例中的miRNA表達量的ROC曲線分析圖，在圖中，橫坐標為特異性，縱坐標為敏感性，I為MiRNA-25，2為MiRNA-144，3為MiRNA-486，4為標準參考曲線；
[0039]圖9是根據(jù)本實用新型實施例中的miRNA表達量的ROC曲線分析圖，在圖中，橫坐標為特異性，縱坐標為敏感性，I為聯(lián)合上述3個MiRNA指標,2為標準參考曲線。
[0040]圖10是根據(jù)本實用新型實施例中的用于IgA腎病檢測的系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。

【具體實施方式】
[0041]下文中將參考附圖并結(jié)合實施例來詳細說明本實用新型。需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合，另外，實施例是示例性的，僅用于解釋本實用新型，而不能理解為對本實用新型的限制。
[0042]在本實用新型中，如無特殊說明，所用專業(yè)術(shù)語按照以下所述理解:
[0043](I)腎活檢:通常情況下叫做腎穿刺，是指在超聲的引導(dǎo)下，穿刺針在患者背部穿入腎臟，取出部分腎組織，在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察腎臟組織病變情況的手術(shù)。由于腎臟疾病的種類繁多，病因及發(fā)病機制復(fù)雜，許多腎臟疾病的臨床表現(xiàn)與腎臟的組織學(xué)改變并不完全一致，為了明確疾病的病因病理，進一步確診患者所患的具體病種，這時就需要做腎穿刺活檢術(shù)。
[0044](2) MicroRNA (miRNA):是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20?25個核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。
[0045](3) SYBR Green熒光定量PCR:SYBR Green熒光定量PCR是一種結(jié)合于所有雙鏈DNA(人及大多數(shù)生物細胞內(nèi)都是雙鏈DNA)雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料，在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強。因此，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)定量PCR儀測出的熒光信號強度計算出被測樣本中雙鏈DNA的初始濃度，由于不能計算出目標基因拷貝數(shù)，所以是一種相對定量的方法。
[0046](4)2_“rt相對定量法:是實時定量PCR實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法，該方法可以通過管家基因的表達量(CT值)從而計算出目的基因的相對表達量。即目的基因的相對表達量=2—-
[0047](5)基線(Baseline):是指在PCR擴增反應(yīng)的最初幾個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即為基線。
[0048](6) Ct值:是突光定量PCR技術(shù)中的一個重要概念，C代表Cycle (循環(huán))，t代表threshold (閾值)，具體含義就是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。而CT值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。
[0049](7)尿沉渣:指尿液進過離心機離心后沉淀下來的物質(zhì)，里面大多數(shù)為腎臟固有細胞及尿路上皮細胞。
[0050](8)管家基因:又稱內(nèi)參基因，是指在生物體內(nèi)所有細胞中都恒定表達，并且為維持細胞基本生命活動所需而時刻都在表達的高度保守的基因。管家基因不僅在各種組織中都恒定表達，而且是在各種情況下都穩(wěn)定表達(也即表達水平比較穩(wěn)定)，而且一般不受外界環(huán)境及加入藥物的影響，因此在PCR中經(jīng)常作為內(nèi)部參照物。
[0051](9)敏感性:就是指其在診斷疾病的時候不漏診(假陰性)的機會有多少，敏感性=真陽性/ (真陽性+假陰性)X100%。
[0052](10)特異性:是指該指標在診斷某疾病時，不誤診(假陽性)的機會有多少，特異性=真陰性/ (真陰性+假陽性)X 100%。
[0053](Il)ROC 曲線:又稱受試者工作特征曲線(receiver operator characteristiccurve, ROC曲線)，最初用于評價雷達性能，又稱為接收者操作特性曲線，是根據(jù)一系列不同的二分類方式(臨界值或決定閾)，以真陽性率(敏感性)為縱坐標，假陽性率(特異性)為橫坐標繪制的曲線。醫(yī)學(xué)上主要用于:選擇最佳的疾病診斷模型、舍棄次佳的模型；在同一模型中設(shè)定(臨界值)最佳閾值。
[0054](12)MiRNA芯片:將檢測miRNA物質(zhì)(探針)固定在芯片上，在通過雜交方式，與樣本中miRNA結(jié)合，以鑒定miRNA表達與否及表達量高低。而miRNA芯片采用大規(guī)模微陣列技術(shù)，一張芯片上包含成千上萬個探針，大大提高了篩選的速度和數(shù)量，是快速、全面比較樣本間miRNA差異的首選方法。
[0055](13)平行(聯(lián)合)實驗:即幾個試驗中只要有一個試驗呈現(xiàn)陽性即診斷為陽性。其優(yōu)點是靈敏度增高、漏診率降低；但同時特異度降低、誤診率增高。
[0056]本實用新型的實施例提供了一種用于IgA腎病檢測方法的建立，如圖1所示，該方法包括下列步驟:
[0057]S10、采集IgA型腎病患者、非IgA型腎病的腎病患者以及健康者的尿液。
[0058]在本步驟中，分別采集IgA型腎病患者、非IgA型腎病的腎病患者以及健康者的三組尿液，其中，非IgA型腎病的腎病患者是指患有腎病但不是IgA型腎病的腎病患者。
[0059]根據(jù)本實用新型的實施例，尿液的種類和采集時間不受特別限制。例如根據(jù)本實用新型的實施例，優(yōu)選的，采集晨尿。由于本實用新型檢測的樣本是尿液，而不是腎組織，所以對患者的機體無創(chuàng)傷，還可以根據(jù)疾病病情變化需要反復(fù)或連續(xù)留取和測試。另外，檢測時無明顯禁忌癥，可以適用于所有患者的檢測，所需留取尿液不會給患者帶來任何損傷和風(fēng)險，非常安全可靠。
[0060]S20、檢測尿液中miRNA的表達量。
[0061]在本步驟中，對SlO中所采集尿液中的miRNA的表達量進行檢測。
[0062]本實用新型的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，IgA腎病在發(fā)病過程中，可引起miRNA的表達量的改變，從而檢測miRNAs的表達量可以早期無創(chuàng)預(yù)警IgA腎病。發(fā)明人利用miRNA芯片對IgA型腎病和健康者的尿液中miRNA的表達譜進行了比較，初篩出差異基因100余個，進一步再篩出3個IgA腎病特異性miRNA:miRNA-25、miRNA_144以及miRNA_486，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)當被觀察者的尿液中3個miRNA:miRNA-25、miRNA-144以及miRNA_486的表達量超過一定的量時，就患有IgA型腎病。
[0063]因此，優(yōu)選的，檢測尿液中3個miRNA:miRNA_25、miRNA_144以及miRNA_486的表達量，就可以快速、準確地提示IgA腎病的存在，幫助醫(yī)師在不用腎活檢的情況下，安全可靠的早期發(fā)現(xiàn)IgA腎病患者。此外，還可以隨時無創(chuàng)傷地對IgA腎病患者的病情進行評估，調(diào)整患者用藥，對癥治療，改善患者預(yù)后，從而有利于減輕國家、社會和家庭的負擔(dān)。
[0064]根據(jù)本實用新型的實施例，檢測miRNA-25、miRNA-144和miRNA_486表達量的方法不受特別限制，例如通過選自突光定量PCR、Taqman探針以及LightCycle探針方法進行檢測。
[0065]根據(jù)本實用新型的實施例，優(yōu)選的，選用SYBR Green熒光定量PCR的方法，該方法操作簡單易行、結(jié)果可靠準確，且患者無需做特殊準備，留取尿液即可，所有結(jié)果能在24小時內(nèi)給出，與傳統(tǒng)腎活檢5-7天的時間相比，十分快速方便，臨床應(yīng)用更為廣泛。
[0066]根據(jù)本實用新型的實施例，優(yōu)選的，MiRNA-25的引物為:CAUUGCACU腳CUCG⑶CUGA ；
[0067]和/ 或，MiRNA-144 的引物為:UACAGUAUAGAUGAUGUACU ;
[0068]和/ 或，MiRNA-486 的引物為:UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG。
[0069]S30、利用2_δ Δε?相對定量法比較所述miRNA的表達量。
[0070]在本步驟中，對S20中所檢測的miRNA的表達量進行比較分析，以確定miRNA在IgA腎病患者中的表達量與健康者對照組和非IgA腎病患者對照組相比較，差異是否顯著。
[0071]本實用新型利用2_Λ 相對定量法可以定量分析目的基因的相對表達量，該方法可以通過管家基因的表達量(CT值)從而計算出目的基因的相對表達量，具體如下:
[0072]目的基因的相對表達量=2—-
[0073]由此，可以確定miRNA-25、miRNA-144以及miRNA_486在IgA腎病患者中的表達量與健康者對照組和非IgA腎病患者對照組之間的差異是否顯著。
[0074]根據(jù)本實用新型的實施例，優(yōu)選的，選用U6-25管家基因的，其引物為:AAAGCAGGCUUUAAAGGAACCU。
[0075]S40、對所述miRNA的表達量進行ROC曲線分析。
[0076]在本步驟中，對S30中的miRNA的表達量進行ROC曲線分析，以確定預(yù)警IgA腎病的miRNA表達量的臨界值。
[0077]根據(jù)本實用新型的實施例，當miRNA-25的表達量高于0.058 (臨界值)時，此時預(yù)警IgA腎病的敏感性為81.3%，特異性為100% ；
[0078]和/或，miRNA-144的表達量高于0.007 (臨界值)時，此時預(yù)警IgA腎病的敏感性為80%，特異性為100% ；
[0079]和/或，miRNA-486的表達量高于0.025 (臨界值)時，此時預(yù)警IgA腎病的敏感性為93.8%，特異性為90.9%。
[0080]根據(jù)本實用新型的實施例，優(yōu)選的，當三個miRNA:miRNA-25、miRNA-144以及miRNA-486表達量的三個聯(lián)合指標一起檢測時，當上述三個聯(lián)合指標中有一個高于它們各自的臨界值，即可預(yù)警IgA腎病，而且通過聯(lián)合可進一步提高預(yù)警的敏感性至89.9%，而預(yù)警的特異性為100%。
[0081]需要特別說明的是，本實用新型的上述三個miRNA:miRNA-25、miRNA-144以及miRNA-486的臨界值，是發(fā)明人在付出大量艱苦勞動，通過大量的臨床觀察、實驗推導(dǎo)并證明的。
[0082]本實用新型之所以使用ROC曲線，是因為比起其他觀察指標判斷標準的方法，ROC有著方法簡單、直觀、可通過圖形觀察分析檢測方法的準確性，可準確反映檢測方法的靈敏性和特異性的關(guān)系，以及其評價方法不受群體發(fā)病率的影響等優(yōu)點。最佳臨界值為最靠近左上角ROC曲線的點，這一點是錯誤最少的最好閾值，其假陽性和假陰性的總數(shù)最少。而最佳臨界值所對應(yīng)的敏感性和特異性即為該實驗方法的敏感性和特異性。在本實用新型的三個指標中，miR-25和miR-144的特異性很好，均為100%，但敏感性不高。而miR-486的特異性不高(90.9%)，而敏感性較好(93.8%)。本實用新型的發(fā)明人創(chuàng)造性的采用聯(lián)合檢測試驗，當三個指標中有一個指標升高，高于臨界值即可預(yù)警IgA腎病，可以提高靈敏度，降低漏診率。通過聯(lián)合檢測，將預(yù)警的敏感性提升至89.9%，而預(yù)警的特異性仍為100%，即本實用新型在預(yù)警IgA腎病時不漏診的機率為89.9%，而誤診率為0%，只要預(yù)警檢測顯示該患者為IgA腎病，則可以準確判斷該患者為IgA腎病。盡管本實用新型還有10.1%的漏診機會，但由于本實用新型的檢測方法實施簡單且無創(chuàng)，可大大擴大適用人群范圍，并且可以多次反復(fù)檢測，從而能夠有效地彌補這一不足。
[0083]本實用新型的實施例提供了一種用于IgA腎病檢測的系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用上述的用于IgA腎病檢測方法的建立方法而建立的檢測方法對IgA腎病進行檢測，如圖10所示，該系統(tǒng)包括:
[0084]尿液米集裝置100,以米集尿液；
[0085]miRNA檢測裝置200，以檢測尿液中miRNA的表達量。
[0086]根據(jù)本實用新型實施例的用于IgA腎病檢測的系統(tǒng)，可以取得以下所述的至少一種積極技術(shù)效果:
[0087]1、由于檢測的樣本是尿液，而不是腎組織，所以本實用新型的最明顯的優(yōu)勢就是具有無創(chuàng)傷的特點，可以根據(jù)疾病的病情變化需要反復(fù)或連續(xù)留取和測試。另外，所需留取尿液不會給患者帶來任何損傷和風(fēng)險，非常安全可靠。
[0088]2、由于檢測時無明顯禁忌癥，可以適用于所有患者的檢測。
[0089]3、由于所用的光定量PCR、Taqman探針以及LightCycle探針的方法已經(jīng)是常見的技術(shù)手段，并且具有檢測準確、安全可靠、簡單易行等的優(yōu)點，一般的醫(yī)護人員，例如鄉(xiāng)鎮(zhèn)和社區(qū)的基層醫(yī)護人員，經(jīng)I周左右的培訓(xùn)就可完全掌握該方法，大大縮短了培訓(xùn)周期，有效解決了現(xiàn)有腎組織活檢對于醫(yī)院和醫(yī)護人員要求嚴格限制的問題，從而使本實用新型具有更廣闊的應(yīng)用空間和巨大的推廣價值。
[0090]4、與現(xiàn)有腎組織活檢的3000元的費用相比，本實用新型所用試劑盒一套僅需5700元左右，可反復(fù)使用50次，從而大大降低了患者的診斷費用。
[0091]5、現(xiàn)有腎組織活檢從患者入院準備到最后給出診斷報告周期大約為I周，而本實用新型能在24小時內(nèi)給出結(jié)果，且不影響患者的工作、學(xué)習(xí)和生活，不僅大大縮短了患者等待時間，也為患者爭取到了及時對癥治療的寶貴時間，可以有效防止錯診或漏診情況的發(fā)生。
[0092]6、由于患者的尿液簡單易得，且容易保存，還適合偏遠地區(qū)大量篩查患者時的使用。
[0093]根據(jù)本實用新型的實施例，可選的，所述miRNA為miRNA-25、miRNA-144以及miRNA-486中的至少一種。
[0094]根據(jù)本實用新型的實施例，可選的，所述miRNA檢測裝置為熒光定量PCR設(shè)備、Taqman探針設(shè)備以及LightCycle探針設(shè)備。
[0095]根據(jù)本實用新型的實施例，可選的，所述熒光定量PCR設(shè)備為SYBR Green熒光定量PCR設(shè)備。
[0096]根據(jù)本實用新型的實施例，可選的，還包括試劑盒300 ；
[0097]所述試劑盒包括裝有引物的第一試劑瓶和裝有管家基因的第二試劑瓶。
[0098]根據(jù)本實用新型的實施例，可選的，所述管家基因為U6-25管家基因。
[0099]根據(jù)本實用新型的實施例，可選的，所述引物包括:
[0100]MiRNA-25 的引物為:CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA ；
[0101]和/ 或，MiRNA-144 的引物為:UACAGUAUAGAUGAUGUACU ;
[0102]和/ 或，MiRNA-486 的引物為:UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG。
[0103]根據(jù)本實用新型的實施例，可選的，所述引物還包括U6-25管家基因的引物為:AAAGCAGGCUUUAAAGGAACCU。
[0104]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，前面關(guān)于用于IgA腎病檢測方法的建立所描述的特征和效果，當然地也適用于該用于IgA腎病檢測的系統(tǒng)，在此不再贅述。
[0105]為了進一步詳細闡述本實用新型的技術(shù)方案，結(jié)合附圖1?9，下面通過具體的實施例對本實用新型進行說明，需要說明的是這些實施例僅僅是為了說明目的，而不能以任何方式解釋成對本實用新型的限制。另外，在下列實施例中如果沒有特別說明，則所采用的設(shè)備和材料均為市售可得的。
[0106]實施例1
[0107]1、主要材料:
[0108]DmiRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒:型號KR201，TIANGEN公司制造。
[0109]2) TRIzol: (Carlsbad, C), life technologies 公司制造。
[0110]3)引物:
[0111]MiRNA-25 的引物為:CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA ；
[0112]MiRNA-144 的引物為:UACAGUAUAGAUGAUGUACU ;
[0113]MiRNA-486 的引物為:UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG ；以及
[0114]U6-25 管家基因的引物為 AAAGCAGGCUUUAAAGGAACCU。
[0115]4)IgA型腎病患者:IgA型腎病患者為腎穿前或腎穿后I周以上(無明顯出血等合并癥)。
[0116]2、主要設(shè)備:
[0117]I) PRISM7500Real Time PCR System:Applied B1systems 公司制造。
[0118]2) SPSS 軟件:SPSS13.0。
[0119]3、主要操作步驟如下:
[0120]I)尿沉渣的收集、儲存與記錄:
[0121]分別用無菌離心管采集IgA型腎病患者、非IgA型腎病的腎病患者(膜性腎病，系膜增殖性腎炎，微小病變腎病，局灶節(jié)段性腎小球硬化，膜增生性腎小球腎炎)以及健康者的50?10ml三組晨尿，每組1-2管，放入冰盒或4°C條件保存。
[0122]2)尿沉渣的樣本處理及總RNA的提取:
[0123]將晨尿放入離心機離心4°C、3000g離心30min，將離心后的尿上清液倒掉，尿沉渣加入ImlPBS混勻，加入1.5ml EP管中，將EP管離心4°C、13000g離心lOmin。再次去掉上清液，保留尿沉渣。
[0124]3) TRIzol法提取尿沉渣中總RNA:
[0125]加入Iml TRIzol，混勻，4°C孵育5min，加入200ul三氯甲烷，震蕩混勻，4°C孵育5min, 4°C、12000rpm 離心 1min ；
[0126]小心拿出EP管，可見管內(nèi)液體分為3層，第一層為上層清亮液體一即RNA層，中間層為白色的蛋白質(zhì)層，最下層為紅色的DNA層，轉(zhuǎn)移上層清亮液體入新的EP管內(nèi)，記下轉(zhuǎn)移的總體積，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，4°C孵育1min ；
[0127]離心4°C、12000rpm離心15min，此時可見管底有少量白色沉淀，即為總RNA，倒掉上清液，立即加入lml75%酒精(用無RNA酶的水配置該酒精)；
[0128]離心4°C、12000rpm離心5min，倒掉上清液，再次加入lml75%酒精；
[0129]離心4°C、12000rpm離心5min,倒掉上清液，短暫離心4°C、12000rpm離心Imin,用槍頭吸取剩余的上清液，吸取干凈，打開EP管蓋，室溫放置15min，晾干剩余酒精；
[0130]加入32ul無RNA酶的水，4°C條件放置30min，使RNA完全溶解于水中；取2ul RNA溶液，在NAN0DR0P2000c測出RNA濃度。
[0131]4)樣本cDNA的合成:
[0132]使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA:
[0133]將樣本總RNA質(zhì)量固定為500ng (總體系500ng)，按測出的濃度算出加入RNA溶液(Total RNA)的體積；
[0134]準備新的無RNAm酶的0.5ml EP管，依次加入 2ul 10XPoly (A)Polymerase Buffer>4ul5 XrATP Solut1n、0.4ul E.coli Poly (A),算出的 RNA溶液體積，加入Rnase-Free ddH20使總體積補足為20ul ；
[0135]短暫離心后37°C反應(yīng)60min,即得到Poly(A)反應(yīng)液；
[0136]準備新的無RNAm酶的0.5ml EP管，依次加入Rnase-Free ddH2011.5ul,Poly (A)反應(yīng)液 2ul, 10 X RT Primer (10 μ M) 2ul, 10 X RT Buffer2ul, Super Pure dNTP (2.5mM each) Iul，Rnase (40U/ul) lul, Quant Rtase0.5ul,即得總體積為 20ul 的雙鏈 cDNA 溶液。
[0137]5)檢測miRNA的表達量:
[0138]對上述合成cDNA中待測基因表達水平的檢測基于SYBR Green熒光定量PCR技術(shù)。
[0139]配置反應(yīng)體系如下:2XmiRcutemiRNA PremixlOul, 50XR0X ReferenceDyel.6ul, Reverse Primer0.4ul, ddH205.6ul,特異性引物 0.4ul,上步生成的 cDNA 溶液2ul。
[0140]反應(yīng)在PRISM7500Real Time PCR System中進行，反應(yīng)條件如下:1X(1個循環(huán))一94°C，2min (起始模板變性)；而后35-45X (35到45個循環(huán))一94°C，20sec (PCR循環(huán)中模板變性)和60°C，34sec (退火，延伸)。每個樣本的每個指標都設(shè)有2個副孔(即所有條件不變，多做2次重復(fù)實驗)。反應(yīng)中采用管家基因(U6)與待測樣本同時進行擴增，從而確定樣本中目的基因的表達水平。
[0141]6) 2^ΔΔε?相對定量法比較miRNA的表達量:
[0142]利用SPSS軟件，采用2-Δ μ相對定量法比較miRNA-25、miRNA-144以及miRNA-486
的表達量即2_[(實齡且目6勺翻CT值一魏S霞翻CT Λ)—(對MS g腿H CT值一對照i且tic翻CT Il)] Act表示實驗組目的基因的表達相對于對照組目的基因的變化倍數(shù)，具體操作如下:
[0143]分別將IgA腎病患者與健康者對照組之間的miRNA-25、miRNA-144以及miRNA-486的表達量進行比較，如圖2~4所示。
[0144]分別將IgA腎病患者與非IgA型腎病患者對照組之間的miRNA-25、miRNA-144以及miRNA-486的表達量進行比較,如圖5~7所示。
[0145]從以上的圖2~7可知miRNA-25、miRNA-144以及miRNA-486在IgA腎病患者中的相對表達量顯著高于健康者對照組和非IgA腎病患者對照組，差異顯著。因此，通過檢測miRNA-25、miRNA-144和miRNA-486在尿液中的表達量能夠預(yù)警IgA腎病。
[0146]圖2，健康者對照組(組I) miRNA-25的表達量(2_Λ Λ ct相對定量法)為
0.0272152±0.0145227，IgA 腎病組(組 2)miRNA_25 的表達量為 0.239375±0.3035597，IgA腎病組miRNA-25的表達量顯著高于健康者對照組，P < 0.001。
[0147]圖3，健康者對照組(組I) miRNA-144的表達量為0.002196±0.002328，IgA腎病組(組2)為0.124129±0.246618，IgA腎病組miRNA-144的表達量顯著高于健康者對照組，P < 0.001。
[0148]圖4，健康者對照組(組I) miRNA-486的表達量為0.012846±0.011028，IgA腎病組(組2)為0.272673±0.527395，IgA腎病組miRNA-486的表達量顯著高于健康者對照組，P < 0.001。
[0149]圖5，IgA 腎病組(組 I) miRNA-25 的表達量為 0.239375±0.3035597，而非 IgA 型腎病的腎病患者對照組(組2)為0.064979±0.051222，IgA腎病組miRNA-25的表達量顯著高于非IgA型腎病的腎病患者對照組，P < 0.001。
[0150]圖6，IgA 腎病組(組 I) miRNA-144 的表達量為 0.124129±0.246618，而非 IgA 型腎病的腎病患者對照組(組2)為0.029361 ±0.062052，IgA腎病組miRNA-144的表達量顯著高于非IgA型腎病的腎病患者對照組，P=0.003。
[0151]圖7，IgA 腎病組(組 I) miRNA-486 的表達量為 0.272673±0.527395，而非 IgA 型腎病的腎病患者對照組(組2)為0.050362±0.058641，IgA腎病組miRNA-486的表達量顯著高于非IgA型腎病的腎病患者對照組，P < 0.001。
[0152]如圖2-7可知，IgA腎病組miRNA-25、miRNA-144以及miRNA-486三個指標的表達量均顯著高于健康者對照組和非IgA型腎病的腎病患者對照組，其升高與IgA腎病預(yù)警有很強關(guān)聯(lián)，可以作為IgA腎病特異性預(yù)警指標。
[0153]7) miRNA表達量的ROC曲線分析:
[0154]利用SPSS軟件，將miRNA-25、miRNA-144以及miRNA-486三個指標聯(lián)合做IgA腎病預(yù)警價值的ROC曲線分析，結(jié)果如圖8和下面表1所示。
[0155]表1miRNA表達量的ROC曲線分析統(tǒng)計表
[0156]

【權(quán)利要求】
1.一種用于IgA腎病檢測的系統(tǒng)，其特征在于，包括: 尿液米集裝置，以米集尿液；以及 miRNA檢測裝置，以檢測尿液中miRNA的表達量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于IgA腎病檢測的系統(tǒng)，其特征在于，所述miRNA為miRNA-25、miRNA-144 以及 miRNA_486 中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于IgA腎病檢測的系統(tǒng)，其特征在于，所述miRNA檢測裝置為熒光定量PCR設(shè)備、Taqman探針設(shè)備以及LightCycle探針設(shè)備。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于IgA腎病檢測的系統(tǒng)，其特征在于，所述熒光定量PCR設(shè)備為SYBR Green熒光定量PCR設(shè)備。
5.根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項所述的用于IgA腎病檢測的系統(tǒng)，其特征在于，還包括試劑盒； 所述試劑盒包括裝有引物的第一試劑瓶和裝有管家基因的第二試劑瓶。
【文檔編號】C12M1/34GK203855580SQ201420173292
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月10日
【發(fā)明者】蔡廣研, 陳香美, 段智余 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院