專利名稱：一種檢測糖鏈異常IgA腎病的蛋白芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白芯片領(lǐng)域，特別是一種檢測糖鏈異常IgA腎病的蛋白芯片及糖鏈 異常IgA腎病檢測方法。
背景技術(shù)：
蛋白芯片是通過平面微細加工與生物分子的自組裝技術(shù)相結(jié)合，在微小載體上組 裝成數(shù)目眾多的不同生物分子微陣列，以實現(xiàn)對目標分子信息的大規(guī)模檢測。糖生物學(glycobiology)是研究聚糖及其衍生物的結(jié)構(gòu)、化學、生物合成及生物 功能的科學?？茖W家把研究生物體內(nèi)多糖的科學叫做“糖生物學”，也有人沿襲“基因組學” 和“蛋白質(zhì)組學”的概念把這們學科叫做“糖原組學”。蛋白質(zhì)、核酸和多糖是構(gòu)成生命的三 類大分子，蛋白質(zhì)和核酸的研究已經(jīng)成為生命科學中的熱點問題。隨著蛋白質(zhì)和核酸研究 的深入，糖類的重要性也浮出水面，成為生命科學研究中的新熱點。1990年，有3家實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)當組織受到損傷時，白血球和免疫細胞穿過 血管壁，進入受損組織，以便殺滅入侵的微生物。然而，過多白血球的進入則可能導致炎癥 的產(chǎn)生。并且發(fā)現(xiàn)炎癥過程與糖類和相關(guān)的糖結(jié)合蛋白參與有關(guān)。更進一步的研究表明， 進入血液循環(huán)系統(tǒng)的癌細胞可能借助了糖鏈改變的機制穿過血管，導致癌癥的轉(zhuǎn)移。隨后 又出現(xiàn)了以這一基礎(chǔ)研究成果為依據(jù)，開發(fā)抗炎和抗腫瘤藥物的熱潮。最近的研究結(jié)果表 明，糖復合物表面糖鏈結(jié)構(gòu)的改變和很多疾病的發(fā)生相伴隨。糖生物學之所以落后于基因和蛋白質(zhì)的研究，在于糖分子本身的復雜性以及研究 人員缺乏研究糖類分子的有效工具。近年來在糖類研究方面已取得不少進展。目前研究結(jié) 果表明，糖類作為信息分子在受精、發(fā)生、發(fā)育、分化、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)衡態(tài)的維持等方 面起著重要作用；炎癥和自身免疫疾病、老化、癌細胞的異常增殖和轉(zhuǎn)換、病原體感染等生 理和病理過程都與糖類的參與有關(guān)。糖蛋白是一種結(jié)合蛋白質(zhì)，由短的寡糖鏈與蛋白質(zhì)共價連接構(gòu)成。糖與蛋白質(zhì)之 間以蛋白質(zhì)為主，其一定部位上以共價鍵與若干短的寡糖鏈相連，這些寡糖鏈常常是具分 支的雜糖鏈，不呈現(xiàn)重復的雙糖系列，一般由2 10個單體(少于15)組成，未端成員常常 是唾液酸或L-巖藻糖。通常每個分子的含糖量較少(約4%)。一些糖蛋白只含一個或幾 個糖基，另一些含有多個線性或分支的寡糖側(cè)鏈。糖蛋白包括酶、激素、載體、凝集素、抗體寸。糖蛋白的生物學功能有一、糖蛋白攜帶某些蛋白質(zhì)代謝去向的信息。糖蛋白寡糖鏈末端的唾液酸殘基，決 定著某種蛋白質(zhì)是否在血流中存在或被肝臟除去的信息。二、寡糖鏈在細胞識別、信號傳遞中起關(guān)鍵作用。淋巴細胞正常情況應歸巢到脾 臟，而切去唾液酸后，結(jié)果競歸巢到了肝臟。在原核中表達的真核基因，無法糖基化。糖蛋白可以是胞溶性的，也可以是膜結(jié)合型的，可以存在于細胞內(nèi)在也可存在于 細胞間質(zhì)中。糖蛋白在動植物中較為典型，脊柱動物中糖蛋白尤為豐富，如金屬轉(zhuǎn)運蛋白(轉(zhuǎn)鐵蛋白)、血銅藍蛋白，凝血因子、補體系統(tǒng)、一些激素，RNase、膜結(jié)合蛋白、主要組織 相容性抗原(major histocompatibility antigen)。絕大多數(shù)糖蛋白的寡糖是糖蛋白 的功能中心。有些糖蛋白的糖對于糖蛋白自身及機體起著保護作用或潤滑作用，如牛的 RNaseB(糖蛋白)對熱的抗性大于RNaseA，大量的唾液酸能增強唾液粘蛋白的粘性從而增 強唾液的潤滑性。南極魚抗凍蛋白的糖組分能與水形成氫鍵，阻止冰晶的形成從而提高 了抗凍性。糖蛋白在細胞間信號傳遞方面起著更為復雜的作用。HIV的靶細胞結(jié)合蛋白 GP120是一個糖蛋白，能與人類靶細胞表面的CD4受體結(jié)合從而附著在靶細胞表面，如果去 掉GP120的糖部分則不能與CD4受體結(jié)合從而失去感染能力。細胞表面的糖蛋白形成細胞 的糖萼(糖衣)、參與細胞的粘連，這在胚胎組織的生長、發(fā)育以及分化中起著關(guān)鍵性作用。糖蛋白的異常對于很多疾病具有診斷意義，因此，可通過檢測異常糖蛋白為疾病 的檢測提供新途徑。IgA腎病是一組多病因引起的具有相同免疫病理學特征的慢性腎小球疾病。臨床 上約40% 45%的患者表現(xiàn)為肉眼或顯微鏡下血尿，35% 40%的患者表現(xiàn)為顯微鏡下 血尿伴蛋白尿，其余表現(xiàn)為腎病綜合征和腎功能衰竭。IgA腎病是世界范圍內(nèi)一種常見的腎 小球疾病，IgA腎病的流行在不同洲、不同國家或在一個國家不同地區(qū)的差異很大，如亞洲 的日本、新加坡，IgA腎病腎病的發(fā)病率占原發(fā)性腎小球疾病的50%，而美國西部的印第安 人低發(fā)區(qū)只占2%。一般而言，白人、黃種人明顯高于黑人的發(fā)病率。我國IgA腎病的發(fā)病 率占原發(fā)性腎小球疾病的沈％ 34%。男女之比大約是2 1。目前的診斷依據(jù)有1.發(fā)生于上呼吸道感染后的肉眼血尿或顯微鏡下血尿或無癥狀性蛋白尿(尤其 男性青年)；2.血尿為腎小球性(畸形紅細胞為主)，蛋白尿為高、中分子或混合性蛋白尿，血 清IgA可能升高；3.腎活檢免疫病理檢查腎小球系膜區(qū)可見到顆粒狀I(lǐng)gA為主的免疫熒光；4.除外鏈球菌感染后急性腎小球腎炎、非IgA系膜增生性腎炎、薄基底膜腎病、狼 瘡性腎炎、紫癜性腎炎、肝硬化及酒精性肝病的腎損害等。目前關(guān)于IgA腎病的診斷，市場上已經(jīng)出現(xiàn)了相關(guān)的試劑盒。例如專利申請?zhí)枮?200710107507. 7的發(fā)明申請，公開了一種檢測糖鏈異常IgA腎病的裝置及應用此裝置的試 劑盒。但該發(fā)明的裝置使用較為復雜，同時無法適應對高發(fā)人群進行大規(guī)模篩查的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的在于提出一種檢測糖鏈異常IgA腎病的蛋白芯片。本發(fā)明的又一發(fā)明目的在于提出一種糖鏈異常IgA腎病的檢測方法。為了完成本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采的技術(shù)方案為本發(fā)明涉及一種檢測糖鏈 異常IgA腎病的蛋白芯片，其中，所述蛋白芯片是將凝集素固定在固相載體上，采用標記的 二抗與檢測樣本中IgA結(jié)合。其中，本發(fā)明的第一優(yōu)選方案為所述的凝集素選自蝸牛凝集素或長柔毛野豌豆 凝集素。本發(fā)明的第二優(yōu)選方案為蝸牛凝集素的點樣濃度為0. 2 1. Omg/ml，優(yōu)選為0. 5 1. Omg/ml ；長柔毛野豌豆凝集素的點樣濃度為0. 5 1. 5mg/ml，優(yōu)選為0. 8 1. 2mg/ ml ο本發(fā)明的第三優(yōu)選方案為所述的固相載體包括玻璃硅片、尼龍膜、纖維素膜、金 屬或凝膠，優(yōu)選玻璃硅片或硝酸纖維素膜。本發(fā)明的第四優(yōu)選方案為本發(fā)明糖鏈異常IgA腎病的蛋白芯片上蝸牛凝集素或 長柔毛野豌豆凝集素點樣體積為1 50nl，優(yōu)選10 40nl。本發(fā)明的第五優(yōu)選方案為本發(fā)明糖鏈異常IgA腎病的蛋白芯片上蝸牛凝集素或 長柔毛野豌豆凝集素點樣直徑為1 300微米，優(yōu)選10 200微米。本發(fā)明還涉及一種糖鏈異常IgA腎病的檢測方法，包括以下步驟1)取本發(fā)明檢測糖鏈異常IgA腎病的蛋白芯片加入?yún)⒖计?、陰性對照品、陽性?照品和待測樣品，室溫反應1 3小時，除去芯片孔中的液體，用清洗液清洗；2)加入酶標記的二抗或抗體/抗原，室溫反應1 3小時，除去芯片孔中的液體， 清洗后加入發(fā)光底物液，利用蛋白芯片檢測儀進行檢測，自動分析，得到結(jié)果。其中，參考品為糖鏈異常IgA標準物質(zhì)，濃度為1 lOng/ml，反應時間優(yōu)選為2小 時，反應的緩沖液優(yōu)選為pH為7. 4 0. IM的PBS緩沖液。本發(fā)明所具有的技術(shù)優(yōu)勢為(1)本發(fā)明的蛋白芯片利用凝集素與特定糖鏈蛋白特異性結(jié)合，對IgA腎病來進 行診斷，為疾病的診斷提供新途徑。(2)本發(fā)明的蛋白芯片利用凝集素與糖蛋白的特異性結(jié)合，抗體/抗原特異結(jié)合， 具有更高的特異性行和敏感性。(3)本發(fā)明的蛋白芯片應用酶聯(lián)免疫標記法進行檢測，該方法簡便易行，成本較 低，簡化了操作步驟，縮短了檢測時間。(4)本發(fā)明的蛋白芯片具有集成化、高通量、平行性好，以及微量化、系統(tǒng)化、自動 化的特點，并且具有很高的升級潛力。
具體實施例方式本發(fā)明的具體實施方式
目的在于對本發(fā)明進行進一步的解釋和說明，并不對本發(fā) 明的內(nèi)容進行限制。實施例1利用蛋白芯片檢測糖鏈異常IgA腎炎1.蝸牛凝集素(HAA/HPA)與芯片固定本芯片采用聚碳酸酯材料，蝸牛凝集素HAA溶解于晶芯芯片點樣液，蝸牛凝集素 的點樣濃度為l.Omg/ml，用點樣儀將凝集素點樣于芯片上，點樣體積為10nl，點樣直徑為 50 100微米；點樣完畢后，將芯片置于室溫過夜。2.處理樣本取糖鏈異常IgA腎炎患者血清400份，正常人血清600份，用pH7. 4的0. IM的PBS 緩沖液稀釋；3.采用1-JCY2. O型蛋白芯片檢測儀進行檢測1)取蛋白芯片加入100 μ 1 0. IM Tris-HCl室溫反應1. 5小時進行封閉，并將芯 片以0. IMTris-HCl-Tween20溶液清洗3次，加入?yún)⒖计?、陰性對照品、陽性對照品和待測樣品，室溫反應2小時，除去芯片孔中的液體，用0. IMTris-HCl-Tween20清洗3遍，每次5分 鐘；其中，陽性對照品為IgA腎炎病人血清，過濾除菌后與無菌條件下分裝，于4°C保 存；陰性對照品為正常人血清，經(jīng)鑒定為IgA腎炎陰性，過濾除菌后與無菌條件下分裝，于 4°C保存；參考品為糖鏈異常IgA標準物質(zhì)，其中，糖鏈異常IgA標準物質(zhì)的濃度為2ng/ml。2)加入辣根過氧化物酶標記的羊或兔抗人IgG或IgM，室溫反應2小時，除去芯片 孔中的液體，0. IMTris-HCl-Tween20溶液清洗3次，每次5分鐘；加入辣根過氧化物酶的發(fā) 光底物液，利用蛋白芯片檢測儀進行檢測，自動分析，得到結(jié)果。4.實驗結(jié)果用本方法檢測600例正常人的血清樣品，檢測結(jié)果589例為陰性，11例為假陽性， 特異性為98. 17% ；用本方法檢測400例糖鏈異常IgA腎炎患者血清，395例為陽性，5例為 假陰性，與腎穿刺病理檢測結(jié)果的符合率為98. 75%。實施例2利用蛋白芯片檢測糖鏈異常IgA腎炎1.長柔毛野豌豆凝集素(VVL)與芯片固定本芯片采用聚碳酸酯材料，蝸牛凝集素HAA溶解于晶芯芯片點樣液，長柔毛野豌 豆凝集素的點樣濃度為1. 5mg/ml ；用點樣儀將凝集素點樣于芯片上，點樣體積為40nl，點 樣直徑為100 150微米；點樣完畢后，將芯片室溫過夜。2.處理樣本取糖鏈異常IgA腎炎患者血清400份，正常人血清600份，用0. IM的PBS緩沖液 稀釋；3.采用1-JCY2. 0型蛋白芯片檢測儀進行檢測1)取蛋白芯片加入100 μ 1 0. IM的1Tris-HCl室溫反應1. 5小時進行封閉，并將 芯片以0. TBS-Tween20溶液清洗3次，加入?yún)⒖计?、陰性對照品、陽性對照品和待測樣 品，室溫反應2小時，除去芯片孔中的液體，并用0. IMTris-HCl-Tween20清洗3遍，每次5 分鐘；其中，陽性對照品為IgA腎炎病人血清，過濾除菌后與無菌條件下分裝，于4°C保 存；陰性對照品為正常人血清，經(jīng)鑒定為IgA腎炎陰性，過濾除菌后與無菌條件下分裝，于 4°C保存；參考品為糖鏈異常IgA標準物質(zhì)，其中，糖鏈異常IgA標準物質(zhì)的濃度為5ng/ml。2)加入辣根過氧化物酶標記的羊或兔抗人IgG或IgM，室溫反應2小時，除去芯片 孔中的液體，0. 1MTBS-Tween20溶液清洗3次，每次5分鐘；加入辣根過氧化物酶的發(fā)光底 物液，利用蛋白芯片檢測儀進行檢測，自動分析，得到結(jié)果。4.實驗結(jié)果用本方法檢測600例正常人的血清樣品，檢測結(jié)果585例為陰性，15例為假陽性， 特異性為97. 5% ；用本方法檢測400例糖鏈異常IgA腎炎患者血清，392例為陽性，8例為 假陰性，與腎穿刺病理檢測結(jié)果的符合率為98。權(quán)利要求
1.一種檢測糖鏈異常IgA腎病的蛋白芯片，其特征在于，所述蛋白芯片是將凝集素固 定在固相載體上，采用標記的二抗與檢測樣本中IgA結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測糖鏈異常IgA腎病的蛋白芯片，其特征在于，所述的凝集 素選自蝸牛凝集素或長柔毛野豌豆凝集素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測糖鏈異常IgA腎病的蛋白芯片，其特征在于，所述的蝸牛 凝集素的點樣濃度為0. 2 1. Omg/ml，優(yōu)選0. 5 1. Omg/ml ；長柔毛野豌豆凝集素的點樣 濃度為 0. 5 1. 5mg/ml，優(yōu)選 0. 8 1. 2mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測糖鏈異常IgA腎病的蛋白芯片，其特征在于，所述的固相 載體包括玻璃硅片、尼龍膜、纖維素膜、金屬或凝膠，
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測糖鏈異常IgA腎病的蛋白芯片，其特征在于，所述的固相 載體選自玻璃硅片或硝酸纖維素膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測糖鏈異常IgA腎病的蛋白芯片，其特征在于，所述蛋白芯 片上蝸牛凝集素或長柔毛野豌豆凝集素點樣體積為1 50nl，優(yōu)選10 40nl。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測糖鏈異常IgA腎病的蛋白芯片，其特征在于，所述蛋白芯 片上蝸牛凝集素或長柔毛野豌豆凝集素點樣直徑為1 300微米，優(yōu)選10 200微米。
8.一種糖鏈異常IgA腎病的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟1)取權(quán)利要求1 7所述的檢測糖鏈異常IgA腎病的蛋白芯片加入?yún)⒖计?、陰性對?品、陽性對照品和待測樣品，室溫反應1 3小時，除去芯片孔中的液體，用清洗液清洗；2)加入酶標記的二抗或抗體/抗原，室溫反應1 3小時，除去芯片孔中的液體，清洗 后加入發(fā)光底物液，利用蛋白芯片檢測儀進行檢測，自動分析，得到結(jié)果。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的糖鏈異常IgA腎病的檢測方法，其特征在于，所述參考品為糖 鏈異常IgA標準物質(zhì)，濃度為1 lOng/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白芯片領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測糖鏈異常IgA腎病的蛋白芯片，所述蛋白芯片是將凝集素固定在固相載體上，采用標記的二抗與檢測樣本中IgA結(jié)合，凝集素選自蝸牛凝集素或長柔毛野豌豆凝集素。本發(fā)明的蛋白芯片利用凝集素與特定糖鏈蛋白的特異性結(jié)合來診斷疾病，為疾病的診斷提供了新的途徑。本方法簡便易行，成本較低，簡化了操作步驟，縮短了檢測時間，是一種適宜推廣的新方法。
文檔編號G01N33/543GK102043046SQ20101029913
公開日2011年5月4日 申請日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月13日
發(fā)明者劉睿強 申請人:上海慧普生物醫(yī)藥科技有限公司