專利名稱：一種含有天然成分的食品添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有天然成分的食品添加劑。
冠心病、心肌梗死、中風(fēng)和其它血管栓塞性疾病是威脅健康的主要因素。這類疾病的共同特征是動(dòng)脈的粥樣硬化或者狹窄。血小板是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)生的因素，它釋放生長(zhǎng)因子、化學(xué)聚合物質(zhì)和其它因子，加速動(dòng)脈粥樣硬化過程。另外，血小板在動(dòng)脈損傷部位或附近的聚集導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的形成和急性血小板血栓形成。
低密度脂蛋白(LDL)膽固醇也與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)。已有報(bào)道指出血液循環(huán)中的非致動(dòng)脈粥樣硬化性低密度脂蛋白膽固醇通過多不飽和脂類的氧化轉(zhuǎn)化為致動(dòng)脈粥樣硬化性低密度脂蛋白膽固醇，導(dǎo)致對(duì)脫輔基蛋白質(zhì)的修飾。
醫(yī)生使用各種藥物，如阿司匹林，來治療動(dòng)脈粥樣硬化性疾病。但是，阿司匹林具有副作用，包括胃腸道刺激癥狀等。還有一些介入療法如血管成形術(shù)可以使狹窄的動(dòng)脈擴(kuò)張以增加血流量。但是，介入技術(shù)會(huì)產(chǎn)生動(dòng)脈內(nèi)膜或中層的損傷，并將血栓形成表面暴露。正是這種原因，對(duì)于已知或懷疑有冠心病的病人來說，主要關(guān)心的是血管形成術(shù)后的再狹窄和突發(fā)性冠心病死亡。
鑒于動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重后果和有關(guān)的醫(yī)療費(fèi)用，需要藥物和營養(yǎng)的共同介入，以適用于防止這類疾病的發(fā)生或再發(fā)生。
流行病學(xué)研究表明，在來源于水果和蔬菜的食用黃酮類物質(zhì)攝入量和冠心病死亡之間存在著負(fù)相關(guān)性。這種相關(guān)性被認(rèn)為是水果和蔬菜中的黃酮類物質(zhì)的抗氧化和血小板抑制特性所致。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些黃酮類物質(zhì)，包括存在于葡萄籽和葡萄皮提取物中的黃酮類物質(zhì)，與阿司匹林表現(xiàn)出的有益健康作用相關(guān)，但是沒有阿司匹林的副作用。盡管如此，但是許多黃酮類物質(zhì)來源中的黃酮類物質(zhì)生物利用度或活性較低。鑒于這種原因，某些食品來源的黃酮類物質(zhì)需要大劑量才實(shí)用。結(jié)果是，基于每天可利用的黃酮類物質(zhì)來說，許多黃酮類物質(zhì)來源不切實(shí)用，太昂貴，或者二者兼有。
本發(fā)明涉及如下發(fā)現(xiàn)，即將某些黃酮類物質(zhì)與酶組合制成食品添加劑的形式，可以減少為有效降低哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化所需的添加劑劑量。本發(fā)明還涉及一種與血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化有關(guān)的疾病的治療方法，其通過給藥黃酮類物質(zhì)和酶的組合物以減少血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
一方面，本發(fā)明的特征在于一種食品添加劑，它包括至少一種黃酮類物質(zhì)來源和一種酶，其中該添加劑在以大約30mg/kg或更小劑量能有效抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。根據(jù)本發(fā)明，食品添加劑的一個(gè)例子是PROVEXCVTM。應(yīng)當(dāng)理解為本發(fā)明所使用的添加劑劑量是指黃酮類物質(zhì)來源和酶的結(jié)合重量。另外，作為添加劑還可以包括其它成分如填充劑、潤(rùn)滑劑、載體等。
該食品添加劑中的黃酮類物質(zhì)來源可以是來源于葡萄籽提取物、葡萄皮提取物、越桔(bilberry)提取物、銀杏(ginkgo biloba)提取物或槲皮素。酶可包括真菌蛋白酶、酸穩(wěn)定性蛋白酶、中性穩(wěn)定蛋白酶、堿性穩(wěn)定蛋白酶或菠蘿蛋白酶。
另一方面，本發(fā)明的特征在于提供一種食品添加劑，它包括至少一種黃酮類物質(zhì)來源，其中該添加劑在以大約30mg/kg或更小劑量能有效抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的食品添加劑還包括一種酶，它可以基本上減少達(dá)到這種抑制所需的劑量。
另一方面，本發(fā)明的特征是提供一種抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化或同時(shí)抑制二者的方法，該方法是通過給藥一種包括黃酮類物質(zhì)來源和酶的食品添加劑，其中該添加劑可以在以大約30mg/kg或更小劑量有效減少血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。該方法也可以用來治療與血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化有關(guān)的疾病，該方法是通過給藥一種包括能有效減少血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化的黃酮類物質(zhì)和酶的食品添加劑。
另一方面，本發(fā)明的特征是提供一種包裝在一種包裝材料之中的、含有能有效減少血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化的食品添加劑的產(chǎn)品。其中的包裝材料標(biāo)示有該食品添加劑在大約30mg/kg或更小劑量可以有效減少血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化或抑制二者的標(biāo)記。在該產(chǎn)品的另一個(gè)實(shí)施方案中，包裝材料可以標(biāo)示有該食品添加劑適用于治療與血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化有關(guān)的疾病的標(biāo)記。
除非另有定義，本發(fā)明使用的所有科技術(shù)語和縮寫與本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員所通常理解的含義相同。盡管在實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明的過程中可以使用與本發(fā)明所述相似或相同的方法和材料，但是下面還是描述了合適的方法或材料。本發(fā)明所涉及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他參考文獻(xiàn)均被本發(fā)明作為參考文獻(xiàn)全部引用。如果有所不清楚，本發(fā)明的說明書，包括定義，將用于解釋和說明。通過下面的詳細(xì)描述以及要求保護(hù)的權(quán)利要求書將更清楚地描述本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)。


圖1表示用于制備動(dòng)物模型的示意圖，該模型形成狹窄的動(dòng)脈，用于測(cè)量當(dāng)間歇性血栓形成時(shí)所觀察到的冠狀動(dòng)脈血流變化，以便模仿因動(dòng)脈粥樣硬化所致冠狀動(dòng)脈狹窄的病人體內(nèi)所發(fā)生的疾病。
圖2是一種帶狀記錄圖，表示反復(fù)的血小板介導(dǎo)性血栓形成，之后形成栓塞，通過測(cè)量Folts模型形成的狹窄動(dòng)脈中的血流發(fā)現(xiàn)這種栓塞產(chǎn)生了循環(huán)血流減少(CFR’s)。
圖3是一種帶狀記錄圖，顯示攝入PROVEXCVTM后循環(huán)血流減少消失，這是因?yàn)镻ROVEXCVTM這種本發(fā)明的優(yōu)選食品添加劑在體內(nèi)具有血小板抑制活性。
圖4是一種帶狀記錄圖，顯示在給藥PROVEXCVTM后的2個(gè)半小時(shí)當(dāng)給以腎上腺素時(shí)，通過攝入PROVEXCVTM消除的循環(huán)血流減少不再重新出現(xiàn)。
圖5表示一種描述本發(fā)明用以測(cè)定體外血小板活性的全血集合度計(jì)量方法的示意圖。
圖6是用于表示在維生素E、ProVex PlusTM或PROVEXCVTM存在下于234nm下測(cè)定的低密度脂蛋白膽固醇氧化時(shí)間過程的曲線圖。
圖7是表示由PROVEXCVTM產(chǎn)生的抗低密度脂蛋白膽固醇氧化的預(yù)防水平圖。
圖8是表示低密度脂蛋白膽固醇氧化速率的曲線圖。
本發(fā)明涉及如下發(fā)現(xiàn)，即將某些黃酮類物質(zhì)與酶組合制成食品添加劑的形式，可以減少為有效降低哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化所需的添加劑劑量。本發(fā)明還涉及一種與血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化有關(guān)的疾病的治療方法，其通過給藥黃酮類物質(zhì)、提取物和酶的組合物以減少血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
冠心病、腦血管疾病和外周血管閉塞的特征是動(dòng)脈狹窄。如果動(dòng)脈狹窄再合并血栓栓塞，血流將進(jìn)一步減少，可能會(huì)發(fā)生心肌梗死或中風(fēng)。這些疾病與血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化有關(guān)。目前治療這類血管栓塞性疾病的方法，如血管成形術(shù)，會(huì)引起動(dòng)脈內(nèi)膜和中層的損傷，這會(huì)引起再狹窄、急性血栓形成、心肌梗死和病人突發(fā)性冠心病死亡。而且，血小板介導(dǎo)性血栓形成對(duì)于血管成形術(shù)或動(dòng)脈切除術(shù)后的不穩(wěn)定性心絞痛、心肌梗死和再狹窄的發(fā)生也有一定的作用。本發(fā)明提供了一種防止新生血栓和再形成血栓的食品添加劑和方法，即通過施用一種能抑制血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化的食品添加劑。
評(píng)價(jià)血小板活性的方法1、Folts模型Folts冠脈血栓模型(“Folts模型”)用于研究各種動(dòng)物模型中的血小板聚集和血栓形成。Folts，J.D.，循環(huán)雜志(增刊4)，833-14(1991)；Folts，J.D.，心血管藥物和療法雜志，931-43(1995)；Folts等人，循環(huán)雜志，54365-370(1976)。Folts模型模仿了因動(dòng)脈粥樣硬化引起的冠狀動(dòng)脈狹窄在病人體內(nèi)出現(xiàn)的一些問題。
使用Folts模型時(shí)，需要全部打開麻醉動(dòng)物的胸腔并暴露心臟。雖然本發(fā)明描述的實(shí)驗(yàn)使用的是狗，但是可以建立Folts模型的其它動(dòng)物還包括豬、兔子、猴子和其它類似動(dòng)物。而且，F(xiàn)olts模型是一種模擬不穩(wěn)定性心絞痛臨床癥狀和人體內(nèi)其它血小板介導(dǎo)性血栓疾病的模型。Samama等人，Thromb.Haeost.，68500-05(1992)；Raeder等人，Am.HeartL，104249-253(1983)；Sherry，s.，Cardiovasc.Rev.Rep.，51208-19(1984)；Ikeda等人，J.Am.Coll.Cardiol.，211008-1017(1993)。
如圖1所示，將彎曲冠狀動(dòng)脈切斷，并將冠狀動(dòng)脈流量探針置于動(dòng)脈上。冠狀動(dòng)脈流量探針連續(xù)不斷地測(cè)量通過動(dòng)脈的血流量而不影響該動(dòng)脈。然后將該動(dòng)脈用鉗夾后造成冠狀動(dòng)脈的內(nèi)膜和中層損傷。將一種塑料限制性環(huán)置于在動(dòng)脈損傷處的冠狀動(dòng)脈外環(huán)以減小冠狀動(dòng)脈的內(nèi)徑。使用血管成形氣囊或其它合適的方法改變狹窄程度或由塑料環(huán)造成的內(nèi)徑減小。
用冠狀動(dòng)脈流量探針測(cè)定血栓間歇性形成時(shí)冠狀動(dòng)脈血流的變化。當(dāng)動(dòng)脈狹窄時(shí)，血小板周期性的聚集在狹窄處，并損傷部分冠狀動(dòng)脈。血小板聚集產(chǎn)生血栓(血凝塊)，其形狀增大，并逐漸切斷冠狀動(dòng)脈的血流量。當(dāng)動(dòng)脈變得閉塞時(shí)，血小板聚集后引起血壓升高，這樣可以推動(dòng)血塊迫使其通過狹窄處，引起狹窄動(dòng)脈中冠狀動(dòng)脈血流的突然恢復(fù)。在損傷動(dòng)脈中足以能減少血流量的血小板聚集被稱為急性血小板血栓形成(APTF)。
人體內(nèi)血栓性動(dòng)脈閉塞被認(rèn)為是由動(dòng)脈內(nèi)膜下的血栓形成表面暴露引發(fā)。另外，最新資料提示各種不同的刺激因素激活血小板粘附和聚集在暴露的血栓形成表面。盡管如此，應(yīng)當(dāng)指出的是本發(fā)明的范圍并不受該特定病理理論的限制。
反復(fù)的血小板性血栓形成，之后出現(xiàn)栓塞，和觀察到伴發(fā)血流變化被稱作為循環(huán)血流減少(CFR’s)或循環(huán)血流改變(CFV’s)。本申請(qǐng)文件將使用術(shù)語CFR’s。人體股動(dòng)脈或冠狀動(dòng)脈疾病造成的動(dòng)脈損傷和狹窄也發(fā)現(xiàn)有CFR’s。Folts等人，Tex.Heart Int.J.，919-27(1982)；Eichorn等人，J Am.Coll.Cardiol.，1743-52(1991)。如圖2所示，通過測(cè)量冠狀動(dòng)脈血流可以測(cè)得和監(jiān)測(cè)CFR’s。盡管圖2表示的是由冠脈血流觀察到的CFR’s，但是應(yīng)當(dāng)理解為Folts模型適用于一般的動(dòng)脈血流(例如，股動(dòng)脈血流)。另外，使用Folts模型及其改進(jìn)模型所需的方法記載于Folts，J.D.，循環(huán)雜志(增刊4)，833-14(1991)；Folts，J.D.，心血管藥物和療法雜志，931-43(1995)，本文作為文獻(xiàn)引用。
每單位時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)CFR’s的頻率或次數(shù)是對(duì)體內(nèi)血小板活性的直接測(cè)定。Folts，J.D.，心血管藥物和療法雜志，931-43(1995)。通過測(cè)定狹窄動(dòng)脈中CFR’s的頻率和程度，可以用Folts模型評(píng)價(jià)能夠改變血小板活性的因素，F(xiàn)olts，J.D.，心血管藥物療法雜志，931-43(1995)。正是如此，利用Folts模型可以鑒別血小板抑制因子、抑制因子活性的程度、抑制因子的有效劑量、抑制周期和抑制因子拮抗血小板機(jī)動(dòng)劑的能力。
阿斯匹林提供了一種Folts模型的解釋性舉例。Folts模型顯示阿斯匹林抑制血小板活性并在實(shí)驗(yàn)條件下消除CFR’s。Folts等人，臨床研究雜志，22595(1974)(摘要)；Folts J.，循環(huán)雜志(增刊4)，833-14(1991)；Folts，J.D.，心血管藥物和療法雜志，931-43(1995)。已知阿斯匹林在5mg/kg劑量下抑制血小板活性。當(dāng)在Folts模型中所用條件下使用阿斯匹林抑制血小板活性時(shí)，通過增加血液中的腎上腺素或去鉀腎上腺素濃度可以恢復(fù)血小板活性。當(dāng)人體處于緊張、驚嚇、焦慮或興奮時(shí)，許多人自然出現(xiàn)這種腎上腺素的增加。Folts，J.D. & Rowe，G.G.，Thromb.Res.，50507-516(1988)。另外，動(dòng)脈狹窄的增加也會(huì)使得由阿斯匹林消除的CFR’s再出現(xiàn)。Folts，J.，循環(huán)雜志(増刊4)，833-14(1991)。因此，F(xiàn)olts模型提供了一種評(píng)價(jià)血小板活性抑制的有效工具。
2、血小板集合度試驗(yàn)測(cè)量人體或動(dòng)物體內(nèi)血小板活性的第二種方法是全血血小板集合度試驗(yàn)。本發(fā)明所述和使用的進(jìn)行全血血小板集合度評(píng)價(jià)的設(shè)備和方法記載于Chronolog Inc.，2 West Park Rd.，Haverton，PA 19083。為了進(jìn)行該試驗(yàn)，通過常規(guī)方法抽取血樣，然后將血樣置于塑料試管中。將一對(duì)電極置于血樣中測(cè)量血樣中的電阻。由于血液中存在的大量離子和電解質(zhì)，通常血液中的電阻較低。將一種已知的血小板聚集刺激因子，如腎上腺素二磷酸鹽(ADP)或膠原蛋白，加入到血樣中以激活血小板。激活的血小板粘附在血小板集合度試驗(yàn)中所用的電極上。如圖5所示(右邊)，當(dāng)血小板聚集在電極上時(shí)血樣中的電阻通常會(huì)以S形增加。如果受試者施用一種抑制血小板活性的物質(zhì)，加入血小板刺激因子后出現(xiàn)的電阻增加將會(huì)減小。
阿斯匹林提供一種使用血液集合度試驗(yàn)的說明性舉例。來源于人體的血樣具有一定基礎(chǔ)水平的血小板活性。加入ADP會(huì)增加血樣的電阻。參見圖5，右邊，“ADP”曲線。在人體給藥325mg阿斯匹林片劑后2小時(shí)抽取第二份血樣。加入ADP后的血小板激活不會(huì)使血小板活性增加到開始血樣所觀察到的水平。參見圖5，右邊，“ADP+ASA”曲線。所觀察到的血樣中電阻的降低被表述為由阿斯匹林引起的血小板體外活性降低百分率。當(dāng)一個(gè)服用阿斯匹林的人在抽取血樣之前使其腎上腺素水平升高，所觀察到的阿斯匹林的抑制活性已經(jīng)消失。參見圖5，右邊，“ADP+ASA+EPI”曲線。Folts，J.D.，心血管藥物和療法雜志，931-43(1995)；Ingerman-Wojenski & Silver，Thromb.Haemost.，51154-156(1984)。
當(dāng)使用膠原蛋白刺激血小板活性時(shí)，阿斯匹林也會(huì)有類似的反應(yīng)。當(dāng)在血液集合度試驗(yàn)中使用膠原蛋白激活血小板活性時(shí)，阿斯匹林降低了血小板活性大約30-40％。因此，血液集合度技術(shù)也可以用來作為測(cè)定由藥物或黃酮類物質(zhì)產(chǎn)生的血小板抑制效果的另一種方法。
3、評(píng)價(jià)低密度脂蛋白膽固醇氧化可以通過幾種方法確定低密度脂蛋白膽固醇氧化或?qū)ζ涞念A(yù)防。Kleinveld等人，Clin.Chem.，38(10)2066-2072(1992)描述了本發(fā)明所述和使用的低密度脂蛋白氧化實(shí)驗(yàn)方法。所述該方法的優(yōu)選方式包括使用常規(guī)技術(shù)從受試者采集的全血血樣中提取低密度脂蛋白膽固醇。將提取的低密度脂蛋白膽固醇分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組樣本。通過向每一種低密度脂蛋白膽固醇樣本中加入銅離子溶液催化低密度脂蛋白的氧化。已知銅離子可以催化和加強(qiáng)低密度脂蛋白膽固醇的氧化。
對(duì)照組低密度脂蛋白膽固醇樣本含有提取的低密度脂蛋白膽固醇和銅離子。對(duì)照組樣本提供了一種對(duì)抽取血液的受試者飲食中和由該血液制備的低密度脂蛋白膽固醇中抗氧化劑的基礎(chǔ)測(cè)試。將試驗(yàn)低密度脂蛋白膽固醇樣本在其它可以作為抗氧化劑的化合物如食品添加劑存在或不存在下與銅離子結(jié)合。
另外，在對(duì)受試者采集血樣之前通過常規(guī)方法給藥一種抗氧化劑，這可以有助于體內(nèi)測(cè)定抗氧化劑的活性。為了測(cè)定體內(nèi)的低密度脂蛋白膽固醇抗氧化劑活性，在給藥一種被檢測(cè)的抗氧化劑來源之前或之后采集全血樣本。
銅離子加速低密度脂蛋白膽固醇氧化中共軛二烯的產(chǎn)生，其光譜在234nm處有吸收峰。因此，按照如圖6所示的隨著時(shí)間推移跟蹤234nm處吸收率的增加可以監(jiān)測(cè)低密度脂蛋白膽固醇的氧化?？寡趸瘎┛梢酝蒲拥兔芏戎鞍啄懝檀贾卸┊a(chǎn)生的啟動(dòng)。結(jié)果，可以通過對(duì)低密度脂蛋白膽固醇氧化之前觀察到的時(shí)間推移(延遲時(shí)間)進(jìn)行計(jì)算來比較含有抗氧化劑的低密度脂蛋白膽固醇樣本。參見圖7。延遲時(shí)間是在本發(fā)明所述低密度脂蛋白氧化實(shí)驗(yàn)條件下防止低密度脂蛋白膽固醇被氧化損傷的最佳信號(hào)。延遲時(shí)間越長(zhǎng)表示抗氧化劑性能越好。
抑制血小板活性和減少低密度脂蛋白膽固醇氧化許多復(fù)雜因素導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病和相關(guān)疾病。在這些因素當(dāng)中，已知血小板與動(dòng)脈內(nèi)壁的相互作用會(huì)加速動(dòng)脈粥樣硬化的過程。而且，血小板活性增加是與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展和暫時(shí)性及持續(xù)性血栓形成密切相關(guān)的。因此，基于每天都能減少血小板活性的因素應(yīng)當(dāng)可以抑制動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病和相關(guān)疾病的發(fā)展或發(fā)生。Folts等人，J.Myocard.Ischemia，6(8)33-40(1994)。
流行病學(xué)研究表明在攝入富含抗氧化劑黃酮類物質(zhì)或維生素E食品的消耗和冠心病減少之間存在負(fù)相關(guān)性。Hertog等人，Lancet，342(8878)1007-11，(1993)；Waterhouse等人，HypernutritiousFoods，Agscience，Inc.，Aubumdale，F(xiàn)1.，219-238(1997)。已知含有黃酮類物質(zhì)的食品來源包括紅葡萄酒、啤酒、葡萄汁、水果和蔬菜。從葡萄籽、葡萄皮、銀杏、越桔和其它類似水果、蔬菜和草藥中獲得的提取物也是黃酮類物質(zhì)和抗氧化劑的來源。
盡管如此，為了有效地獲得與黃酮類物質(zhì)和抗氧化劑有關(guān)的益處，還必須克服許多障礙。障礙之一是食品來源的黃酮類物質(zhì)中活性成分的生物利用度。如果生物利用度或活性較低，人體必須消耗大量的血小板抑制劑或抗氧化劑食品添加劑以獲得血小板抑制劑或抗氧化劑帶來的益處。結(jié)果是，低生物利用度會(huì)導(dǎo)致食品添加劑對(duì)于許多消費(fèi)者來說不實(shí)用、太昂貴，或二者兼有。
另外，與不同的黃酮類物質(zhì)有關(guān)的血小板抑制和抗氧化劑特征的有效性在特定的黃酮類物質(zhì)之間也有所不同，例如，來源于葡萄的黃酮類物質(zhì)比來源于柑桔類水果汁的黃酮類物質(zhì)在自愿者人體和動(dòng)物體內(nèi)的是更好的血小板抑制劑。Folts等人，J.Am.Coll.Cardiology，29(2)(增刊A)303A(1997)；Folts，J.D.，J.Am.Coll.Cardiology，29(2)(增干A)226A(1997)；Folts等人，J.Am.Coll.Cardiology，29(2)(增刊A)180A(1997)。
而且，血流中的環(huán)境條件是不穩(wěn)定的。要達(dá)到有效，一種食品添加劑必須在各種條件下，包括不同程度的緊張、興奮和勞累等這些傾向于升高血小板活性水平的條件下，都是有效的。
最后，許多黃酮類物質(zhì)的食品來源，還含有不需要的成分，如葡萄酒和啤酒中的酒精、葡萄汁中的糖分和熱量。對(duì)于各種黃酮類物質(zhì)和藥物還存在相關(guān)的毒性。例如，許多文獻(xiàn)記載阿司匹林具有副作用，包括胃腸道刺激、在腎上腺素存在下有效性的喪失和在極度動(dòng)脈狹窄環(huán)境下不能抑制CFR’s。
因此，希望創(chuàng)制一種實(shí)用和價(jià)值有效而適用的食品添加劑，它能夠在各種不同條件下抑制血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。還希望這種適用的食品添加劑的主要特征是通過含有能增加吸收該食品添加劑活性成分的組分來增加該食品添加劑的生物利用度。本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了這樣一種添加劑，并且本文對(duì)該添加劑進(jìn)行了描述和提請(qǐng)專利保護(hù)。
在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種食品添加劑，它含有至少一種黃酮類化合物來源和一種酶，該食品添加劑給哺乳動(dòng)物以大約30mg/kg或更少的劑量服用時(shí)，可以有效地抑制體內(nèi)血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。該食品添加劑可以進(jìn)一步含有黃酮類物質(zhì)來源，如葡萄籽提取物、葡萄皮提取物、銀杏提取物、槲皮素、越桔提取物或其它任何特定的黃酮類物質(zhì)。“該黃酮類物質(zhì)來源”可以是來源于任何來源，并且可以包括合成或從已知來源中純化的黃酮類物質(zhì)。該黃酮類物質(zhì)來源也可以是，例如，被確定為單獨(dú)或作為結(jié)合物具有高活性的一種或多種黃酮類物質(zhì)，其中該黃酮類物質(zhì)是從含有多種黃酮類物質(zhì)的復(fù)合混合物中，如從一種植物提取物中分離得到的。
雖然不受特定作用理論的限制，應(yīng)當(dāng)相信本發(fā)明公開的食品添加劑通過增加生物利用度或藥理相互作用以發(fā)揮協(xié)同作用，抑制血小板活性和抑制低密度脂蛋白膽固醇氧化。在本發(fā)明的有關(guān)方面，該食品添加劑在血小板激動(dòng)劑(如，腎上腺素)濃度升高的情況下仍能保持有效地降低血小板活性和抑制低密度脂蛋白膽固醇氧化。
食品添加劑的制劑的實(shí)例包括下述一種或多種成分水果提取物、蔬菜提取物、消化酶、草藥、黃酮類物質(zhì)、抗氧化劑和其它類似物。
適用消化酶舉例說明的實(shí)例包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、真菌蛋白酶、酸穩(wěn)定蛋白酶、中性穩(wěn)定蛋白酶、堿性穩(wěn)定蛋白酶和菠蘿蛋白酶。
適用黃酮類物質(zhì)的舉例說明的實(shí)例包括黃酮類物質(zhì)的兒茶素、矢車菊苷配質(zhì)、原花色素、槲皮素、蕓香苷和糖苷的形式。
本發(fā)明的食品添加劑可以作為一種植物類(phytosome)成分通過口服、靜脈內(nèi)、皮下、舌下、胃內(nèi)或通過任何其它可接受的給藥方法給藥。另外，該食品添加劑可以與任何合適的載體結(jié)合使用以便于給藥。本發(fā)明使用Folts模型檢測(cè)的食品添加劑可以通過靜脈內(nèi)或胃內(nèi)給藥。通過胃內(nèi)膜吸收通常需要2-4小時(shí)。因此，胃內(nèi)給藥食品添加劑在該食品添加劑攝入后2-4小時(shí)才會(huì)影響CFR’s。
市場(chǎng)上的食品添加劑一般制成可口服給藥的劑型。適合于食品添加劑的給藥的劑型包括丸劑、膏劑、粉劑、液體制劑和其它普通口服制劑。對(duì)于本發(fā)明所述的各種劑型的食品添加劑可以使用常規(guī)的生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。本發(fā)明所述的食品添加劑另外還可以含有硬脂酸鎂作為潤(rùn)滑劑以便將該食品添加劑制備成膠囊。硬脂酸鎂一般的使用濃度為1-4mg/每膠囊，優(yōu)選1-2mg/每膠囊。
可以用Folts模型來鑒別能夠降低血小板活性的食品添加劑的制劑。按照本發(fā)明所述，制備狗的冠狀動(dòng)脈使其表現(xiàn)出CFR’s。然后通過一種認(rèn)可的方法以測(cè)定的劑量對(duì)狗給藥。監(jiān)測(cè)該食品添加劑的劑量對(duì)觀察到的CFR’的影響。通過使用Folts模型可以確定有效劑量、半衰期和吸收程度。從狗體采集的血樣提供了有關(guān)該添加劑濃度和血流內(nèi)血小板活性水平的信息。
可以使用其它的實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)適用的食品添加劑的特征。例如，通過在給藥食品添加劑后可使狹窄程度增加來確定是否有CFR’s的再出現(xiàn)。另外，通過在給藥食品添加劑之前或之后的不同時(shí)間點(diǎn)施用血小板激動(dòng)劑可以鑒別出能夠在血小板激活條件下保持CFR消除作用的食品添加劑。適用的激動(dòng)劑包括腎上腺素和去鉀腎上腺素。用于此目的的腎上腺素適用劑量包括靜脈內(nèi)以0.2μg/kg/分鐘的劑量給藥腎上腺素15分鐘。
也可以對(duì)患有人類冠心病的自愿者或病人給以本發(fā)明所述的和要求專利保護(hù)的食品添加劑及其類似產(chǎn)品，使用本發(fā)明所述的血小板集合度實(shí)驗(yàn)和低密度脂蛋白膽固醇氧化實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)該食品添加劑的效果。
適用的食品添加劑的制劑可以包括下述一種或幾種成分葡萄籽提取物、葡萄皮提取物、銀杏提取物、越桔提取物、槲皮素和一種酶混合物?？梢园凑障率龅闹亓勘戎苽湓撌称诽砑觿┢咸炎烟崛∥?2％w/w，葡萄皮提取物20％w/w，銀杏提取物10％w/w，越桔提取物10％，槲皮素24％w/w和酶混合物24％w/w。
根據(jù)本發(fā)明含有黃酮類物質(zhì)和酶的適用食品添加劑是PROVEXCVTM。PROVEXCVTM可以從Melaleuca，Inc.，Idaho Falls，Idaho獲得。
PROVEXCVTM每380mg膠囊含有下述組分組分 制劑中％含量 用量葡萄籽提取物 12％ 45mg銀杏提取物 10％ 38mg
越桔提取物 10％ 38mg葡萄皮提取物 20％ 76mg槲皮素 24％ 92mg酶混合物 24％ 91mg總量 100％ 380mg根據(jù)本發(fā)明，制備該添加劑時(shí)也可以包括除酶混合物之外的上述全部組分。
每380mg PROVEXCVTM膠囊中所用的酶混合物含有如下酶組分 占酶混合物的％量 活性單位真菌蛋白酶20053 25％ 11250HUT真菌蛋白酶20054 25％ 11250HUT酸穩(wěn)定性幫蛋白酶25％ 3375SAPU菠蘿蛋白酶 25％ 5760000PU總量100％真菌蛋白酶20053和20054是酸性、中性和堿性蛋白酶的酶混合物。HUT活性是在基于水解變性血紅蛋白的FCC HUT測(cè)試中測(cè)得的一種酶的活性。一個(gè)HUT單位被定義為在一分鐘內(nèi)產(chǎn)生一種水解物(hydrosylate)所用酶的量，且該水解物在275nm的吸收率等于一種1.10mg/ml的酪氨酸的0.006N鹽酸溶液的吸收率。SAPU活性是在基于水解Hammarstan酪蛋白底物的FCC SAPU測(cè)試中測(cè)得的SAPU活性。一個(gè)SAPU單位被定義為在PHU3和37℃條件下每分鐘釋放出1微摩爾酪氨酸所需酶的量。PU活性是在基于水解酪蛋白的FCC PU測(cè)試中測(cè)得的一種酶的活性。一個(gè)PU單位被定義為在PH6.0和40℃條件下每小時(shí)釋放出1微克酪氨酸所需酶的量。關(guān)于上述有關(guān)酶的更多信息可以從National Enzyme Company，F(xiàn)orsyth，Missouri，(417)-546-4796的有關(guān)酶的技術(shù)期刊獲得。
PROVEXCVTM中含有的組分可以從下述來源獲得。使用的實(shí)際來源以下劃線將廠商標(biāo)出。
組分/提取物 來源葡萄籽提取物 Indena-Milan，Italypolyphenolics-Canadaigua，NYInterHealth-Concord，CATri-K Industries-Fanerson，NJ銀杏提取物Indena-Milan，ItalyWeinstein Nutritional-Irvine，CAOptiPure-Los Angles，CABotanicals International-LongBeach，CA越桔提取物Indena-Milan，ItalyOptiPure-Los Angles，CAChemco Industries-Los Angeles，CA葡萄皮提取物 Freeman Industries-Tuckahoe，NYWeinstein Nutritional-Irvine，CABrucia Extracts-Califoenia槲皮素Weinstein Nutritional-Irvine，CABotanicals International-LongBeach，CATriarco Industries-Wayne，NY酶混合物 National Enzyme Co.-Forsyth，MOMakWood-Thiensville，WIBotanicals International-LongBeach，CA柑桔提取物Botanicals International-LongBeach.CA
ProVex PlusTM每125mg膠囊含有下述組分組分制劑中％含量 用量葡萄籽提取物20％ 25mg銀杏提取物 8％10mg越桔提取物 8％10mg葡萄皮提取物24％ 30mg柑桔提取物 40％ 50mg總量 100％ 125mg在使用含有除酶混合物以外的PROVEXCVTM全部組分的添加劑的Folts模型中的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這種添加劑在大約20mg/kg或更少劑量下能夠有效地消除CFR’s。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在Folts模型中觀察到的消除CFR’s所需劑量在將食用黃酮類物質(zhì)與一種酶結(jié)合時(shí)還可以進(jìn)一步減少。將含有等份的兩種真菌蛋白酶、一種酸穩(wěn)定性蛋白酶和菠蘿蛋白酶的酶混合物加入到含有除酶混合物以外全部PROVEXCVTM組分的添加劑當(dāng)中，可以將消除本發(fā)明所用動(dòng)物模型中CFR’s所需的劑量由大約20mg/kg減少到大約10mg/kg。
PROVEXCVTM的效率為它可以將本發(fā)明動(dòng)物模型中消除CFR’s所需的劑量由ProVex PlusTM所需的大約30mg/kg減少到PROVEXCVTM所需的大約10mg/kg。結(jié)果是，本發(fā)明食品添加劑的適用劑量是大約30mg/kg或更少。優(yōu)選的有效劑量是大約20mg/kg或更少。更優(yōu)選的有效劑量是大約10mg/kg或更少。
正是如此，使用具有抗氧化和血小板抑制特性的PROVEXCVTM能夠預(yù)防發(fā)生冠心病、急性栓塞、心肌梗死性死亡和與血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化有關(guān)的疾病。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括一種命名為PROVEXCV2TM的食品添加劑。如同ProVex PlusTM和PROVEXCVTM，PROVEXCV2TM可以被用作一種抑制血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化的食品添加劑。每1638mg的PROVEXCV2TM含有下述組分組分 制劑中％含量 用量酶混合物 4.58％ 75mg葡萄籽提取物 3.30％ 54mg葡萄皮提取物 67.77％ 1,110mg槲皮素 7.32％ 120mg銀杏提取物 9.71％ 159mg越桔提取物 7.32％ 120mg總量 100％ 1,638mg本發(fā)明所述的食品添加劑，包括PROVEXCV2TM的組分可以從任何供貨方獲得。例如，可以從上述所列舉的廠商獲得用于PROVEXCV2TM的全部組分。另外，該組分可以從未經(jīng)發(fā)酵過的來源獲得。例如，未發(fā)酵過的葡萄籽提取物和未發(fā)酵過的葡萄皮提取物可以用作本發(fā)明所述的食品添加劑的組分。這種未發(fā)酵過的組分可以從任何供貨方如Polyphenolics(Canandaigua，NY)獲得。
簡(jiǎn)而言之，在制備葡萄酒的過程中使用了發(fā)酵方法。如果該組分是來源于生產(chǎn)葡萄酒的廠商，那么該組分可是發(fā)酵過的組分，例如，發(fā)酵過的組分，如發(fā)酵過的葡萄籽提取物或發(fā)酵過的葡萄皮提取物，可以是從經(jīng)過發(fā)酵的來源，如葡萄，分離的任何組分。相對(duì)而言，未經(jīng)發(fā)酵過的組分可以是從未經(jīng)發(fā)酵的的來源分離獲得的任何組分。這種未發(fā)酵過的組分與發(fā)酵過的組分相比是更有效的黃酮類物質(zhì)來源。例如，未發(fā)酵過的葡萄籽提取物或未發(fā)酵過的葡萄皮提取物比發(fā)酵過的葡萄籽提取物或發(fā)酵過的葡萄皮提取物能夠更有效地抑制血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化。
應(yīng)當(dāng)指出，ProVex PlusTM、PROVEXCVTM和PROVEXCV2TM中的每一組分的百分含量可以改變，只要最終的組合物能夠抑制血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化。例如，銀杏提取物的百分含量可以增加到大于10％。
另一方面，本發(fā)明提供了一種抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化的方法，該方法是通過給藥一種含有能有效減少血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化或者抑制二者的至少一種黃酮類物質(zhì)來源和一種酶的食品添加劑。
本發(fā)明的另一方面，提供了一種在哺乳動(dòng)物中治療與血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化有關(guān)的疾病的方法。該方法包括給藥一種含有至少一種黃酮類物質(zhì)來源和一種酶的食品添加劑的步驟，該添加劑能在大約30mg/kg或更小劑量有效減少血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
為了實(shí)施所述方法，對(duì)哺乳動(dòng)物通過一種可接受的給藥方法給藥一定劑量的本發(fā)明所述的食品添加劑。該劑量可以根據(jù)情況確定為按小時(shí)、天、周或其部分階段給藥。在給藥食品添加劑后，可以對(duì)該哺乳動(dòng)物的血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化程度進(jìn)行評(píng)價(jià)?？梢詫⑵溲“寤钚院偷兔芏戎鞍啄懝檀佳趸潭扰c給藥該食品添加劑之前的程度加以比較。
本發(fā)明另一方面，提供了一種含有能有效降低血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化的食品添加劑的產(chǎn)品。該產(chǎn)品的包裝材料上標(biāo)示有該食品添加劑適用于在大約30mg/kg或更小劑量能減少哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化或二者的標(biāo)記。在本發(fā)明產(chǎn)品的另一個(gè)實(shí)施方案中，該包裝材料上標(biāo)示有該食品添加劑適用于治療與血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化有關(guān)的疾病的標(biāo)記。
可以使用任何普通的包裝和印刷方法制備該該產(chǎn)品。
參照下述的說明性實(shí)施例可以進(jìn)一步理解本發(fā)明，這些實(shí)施例純屬舉例性的，不應(yīng)當(dāng)理解為限制本發(fā)明權(quán)利要求當(dāng)中所要求保護(hù)的真實(shí)范圍。
實(shí)施例實(shí)施例l-評(píng)價(jià)食品添加劑的血小板抑制活性使用Folts，J.，循環(huán)雜志(增刊4)，833-14(1991)中公開的Folts模型方法建立10只患有冠狀動(dòng)脈狹窄和中層膜損傷的被麻醉的狗模型，以用于進(jìn)行評(píng)價(jià)。連續(xù)監(jiān)控整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程當(dāng)中的血壓和冠狀動(dòng)脈血流情況。如圖2所示，在給藥PROVEXCVTM前，10只狗在30分鐘的時(shí)間段內(nèi)出現(xiàn)了8±3次因急性血小板血栓形成而表現(xiàn)出與圖2中的CFR’s相似的CFR’s。所有表示帶狀記錄圖的數(shù)據(jù)是基于相同水平，即每12個(gè)方格表示10分鐘。給每一只狗通過胃管給藥10mg/kg的PROVEXCVTM。如圖3所示，在10只狗中，有9只狗在174±24分鐘內(nèi)觀察到胃飼給藥10mg/kg PROVEXCVTM可以消除CFR’s。在給藥10mg/kgPROVEXCVTM3小時(shí)后，在30分鐘的時(shí)間段內(nèi)第十只狗中出現(xiàn)的CFR’s減少為2個(gè)CFR’s。PROVEXCVTM中的食用黃酮類物質(zhì)并沒有產(chǎn)生心率和動(dòng)脈血壓的變化。
在Folts模型中的評(píng)價(jià)提示，由阿司匹林抑制的血小板活性在靜脈內(nèi)以0.2μg/kg/分鐘給藥腎上腺素后可以被再激活，F(xiàn)olts，J.，循環(huán)雜志(增刊4)，833-14(1991)。對(duì)于給藥10mg/kg PROVEXCVTM的而消除了CFR’s的8只狗，靜脈內(nèi)以0.2μg/kg/分鐘給藥腎上腺素15分鐘。圖4的右邊顯示，靜脈內(nèi)在以0.2μg/kg/分鐘給藥腎上腺素15分鐘后，所有8只狗中因胃飼給藥10mg/kgPROVEXCVTM消除的CFR’s沒有再出現(xiàn)。
使用本文所述的全血集合度方法確定全部10只狗的體外血小板活性。在給藥10mg/kgPROVEXCVTM之前和之后采集每一只狗的血樣并進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)使用膠原蛋白激活血小板聚集時(shí)，在給藥10mg/kgPROVEXCVTM的所有10只狗的體外全血血小板聚集降低了40％±9％。不象圖5中所示的阿司匹林，因腎上腺素而引起的血小板聚集增加在PROVEXCVTM實(shí)驗(yàn)中沒有出現(xiàn)。
實(shí)施例2-評(píng)價(jià)食品添加劑對(duì)低密度脂蛋白膽固醇氧化的影響如上所述，當(dāng)將低密度脂蛋白膽固醇暴露于氧化條件下時(shí)，通常通過觀察一定時(shí)間內(nèi)234nm處(Abs234nm)的吸收率來測(cè)定低密度脂蛋白膽固醇的氧化。測(cè)定PROVEXCVTM和其它物質(zhì)的抗氧化效率。
從自愿者人體的血樣中制備低密度脂蛋白膽固醇。然后將分離的低密度脂蛋白膽固醇與一種緩沖液、維生素E、ProVex PlusTM(圖6中的“orig”)或PROVEXCVTM(圖6中的“Curr”)混合。將ProVex PlusTM和PROVEXCVTM的實(shí)驗(yàn)溶液制備成0.5和1.0mg/ml的最終濃度。選擇的ProVex PlusTM和PROVEXCVTM的濃度是基于可接受的血液吸收模型而估計(jì)的食品添加劑的預(yù)期血濃度水平。向每一份樣本中加入測(cè)定量的銅離子。所使用的維生素E的量相當(dāng)于以400IU的維生素E給人體給藥而預(yù)期的血中含量。
混合之后，監(jiān)測(cè)一定時(shí)間內(nèi)每種溶液的Abs234nm。如圖6所示，將低密度脂蛋白膽固醇與0.5mg/L或1.0mg/L的ProVex PlusTM或PROVEXCVTM一起孵育，其對(duì)低密度脂蛋白膽固醇氧化的防止作用比5.3IU/L的公知抗氧化劑維生素E觀察到的作用更長(zhǎng)。
如圖7所示，低密度脂蛋白膽固醇在加入銅離子后的45分鐘才表現(xiàn)出可觀的氧化作用。上述濃度的維生素E可以防止低密度脂蛋白膽固醇進(jìn)行氧化的時(shí)間達(dá)大約95分鐘。1.0mg/L的ProVex PlusTM防止低密度脂蛋白膽固醇的氧化超過100分鐘。最后，在這些實(shí)驗(yàn)條件下，1.0mg/L的PROVEXCVTM防止低密度脂蛋白膽固醇氧化超過150分鐘。因此，ProVex PlusTM和PROVEXCVTM是比維生素E更好的抗氧化劑。
實(shí)施例3-對(duì)PROVEXCV2TM的評(píng)價(jià)使用Folts模型評(píng)價(jià)狗體內(nèi)PROVEXCV2TM對(duì)血小板活性的作用，并用全血血小板集合度實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其體外的作用。簡(jiǎn)言之，將10只具有兩種性別的mongrel成年狗麻醉，在第5肋間打開胸腔。將左側(cè)彎曲的冠狀動(dòng)脈切開，并在動(dòng)脈周圍設(shè)置一個(gè)電磁流量探針，以測(cè)定冠狀動(dòng)脈的血流量。在該流量探針的末端，用一種特定的外科鉗夾該動(dòng)脈3次以造成內(nèi)膜和中層膜的損傷。用一個(gè)合適內(nèi)徑的塑料環(huán)置于動(dòng)脈外環(huán)以形成70％的動(dòng)脈內(nèi)徑狹窄。
在CFR’s出現(xiàn)過程中，采集血樣用于體外全血血小板集合度測(cè)試。在監(jiān)測(cè)CFR’s的持續(xù)形成過程20分鐘之后，通過胃管給藥15mg/kg的PROVEXCV2TM。監(jiān)測(cè)CFR’s 3小時(shí)。當(dāng)CFR’s消失后，抽取第二份血樣以重復(fù)體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)。然后輸注腎上腺素(0.2μg/kg/分鐘)20分鐘以觀察CFR’s是否再出現(xiàn)。
患有冠狀動(dòng)脈狹窄和內(nèi)膜損傷的10只狗由于急性血小板血栓形成，以每30分鐘7±3的頻率出現(xiàn)了CFR’s。通過胃管給藥15mg/kg的PROVEXCV2TM后，CFR’s消失了164±29分鐘。靜脈輸注腎上腺素(0.2μg/kg/分鐘給藥20分鐘)不會(huì)使任何狗內(nèi)再出現(xiàn)CFR’s。但是，在5-10mg/kg的阿斯匹林消除CFR’s后輸注腎上腺素會(huì)導(dǎo)致50-60％的實(shí)驗(yàn)狗再出現(xiàn)CFR’s。因此，PROVEXCV2TM似乎比阿斯匹林表現(xiàn)出更強(qiáng)的血小板抑制活性。
使用全血血小板集合度實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)在給藥PROVEXCV2TM前和后所采集的全血血樣中血小板的活性。在給藥PROVEXCV2TM后，由ADP(20微摩爾/毫升)引起的血小板聚集降低了42±10％(P＜0.03)。另外，在PROVEXCV2TM給藥后，由腎上腺素和ADP結(jié)合引起的血小板聚集降低了32±11％(P＜0.05)。
使用全血血小板集合度實(shí)驗(yàn)，也在體外評(píng)價(jià)了PROVEXCV2TM在人體內(nèi)對(duì)血小板活性的影響。具體講，使12名年齡在22-50歲的健康志愿者(8個(gè)男性，4個(gè)女性)充實(shí)體力。在研究之前的1周和研究過程中，受試者均戒除茶、酒精飲料、葡萄產(chǎn)品、黃酮類物質(zhì)和維生素添加劑，以及包括阿斯匹林在內(nèi)的所有醫(yī)藥制劑。素食者從本實(shí)驗(yàn)中排除。
在實(shí)驗(yàn)的第1天上午8點(diǎn)和中午12點(diǎn)之間，采集每一位空腹志愿者的18毫升靜脈血樣用于體外全血血小板集合度測(cè)試。然后，讓每一位志愿者根據(jù)其體重服用5-7個(gè)膠囊(大約20mg/kg/天)的PROVEXCV2TM，共服用7-14天。7-14天之后，每一位志愿者空腹回到實(shí)驗(yàn)室，但是服用當(dāng)天劑量的PROVEXCV2TM，采集第2次血樣。此血樣在最后一次劑量的PROVEXCV2TM后大約2-4小時(shí)之后采集。
簡(jiǎn)言之，將18毫升的全血抽取到裝有2毫升3.8％的檸檬酸鈉作為抗凝劑的注射器中。馬上用等量的不含防腐劑的鹽水稀釋血液。將1毫升的稀釋血液加入到帶有硅化攪拌棒的小杯當(dāng)中，并加熱至37℃保持5分鐘。向小杯中放入一個(gè)電極以測(cè)量電阻的變化，它與血小板聚集成比例。一旦記錄了基準(zhǔn)的血小板活性，便向該預(yù)熱的血樣中加入大劑量的膠原蛋白(12.5微克)，并置于集合度計(jì)中以獲取最大的血小板聚集反應(yīng)。跟蹤由血小板聚集產(chǎn)生的電阻變化7分鐘。使用次高劑量的膠原蛋白(0.5微克/毫升)、12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波醇酯(PMA)(0.5nmol/ml)，和ADP(20微摩爾/毫升)作為血小板激動(dòng)劑。另外在用腎上腺素(0.5微克/毫升)孵育1分鐘的1毫升血樣中也使用ADP(20微摩爾/毫升)作為激動(dòng)劑以聚集血小板。這種聚集反應(yīng)在對(duì)照樣本中重復(fù)檢測(cè)兩次，并與每天服用PROVEXCV2TM7-14天后的反應(yīng)進(jìn)行比較。
在每天服用PROVEXCV2TM7-14天后采集的血樣中，血小板聚集對(duì)膠原蛋白(0.5微克/毫升)、ADP(20微摩爾/毫升)和一種佛波醇酯，12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波醇酯(PMA 0.5nmol/ml)的反應(yīng)表現(xiàn)為分另降低51.6±41.1％(P＜0.005)、39.8±41.5％(P＜0.005)和17.9±10.0％(P＜0.002)。另外，在每天服用PROVEXCV2TM7-14天后采集的血樣中，血小板聚集對(duì)腎上腺素(0.5微克/毫升)和ADP(20微摩爾/毫升)的結(jié)合的反應(yīng)表現(xiàn)為降低了14.9±8.5％(P＜0.05)。這些結(jié)果表明PROVEXCV2TM的血小板活性抑制機(jī)制可能是通過抑制血小板的蛋白激酶C而起作用，因?yàn)樵诿刻旖o藥PROVEXCV2TM7-14天后，PMA誘導(dǎo)的血小板聚集減少。
除了評(píng)價(jià)PROVEXCV2TM對(duì)血小板活性的作用之外，還要研究PROVEXCV2TM對(duì)低密度脂蛋白膽固醇氧化的作用。簡(jiǎn)言之，從健康空腹的自愿者采集的血樣中分離低密度脂蛋白，方法是使用連續(xù)超速離心在1.006g/ml的密度離心去除VLDL/乳糜微粒和在1.063g/ml(KBr)從更高密度的HDL和血清蛋白中分離低密度脂蛋白。使用Beckman Optima系統(tǒng)以100,000rpm(＞4,000,000xg)每次離心3小時(shí)。使用含有EDTA的磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)透析該低密度脂蛋白48小時(shí)，其中更換幾次不同的緩沖液。然后通過電泳(瓊脂凝膠)檢測(cè)透析的物質(zhì)表明已經(jīng)去除了其它的脂蛋白成分和血清蛋白。測(cè)定分離的低密度脂蛋白的蛋白濃度，并用含有EDTA的PBS來稀釋調(diào)節(jié)至0.5g/L。然后將低密度脂蛋白溶液按0.7ml的量分成等份裝入小的玻璃容器內(nèi)，并用旋蓋擰緊。將小瓶和低密度脂蛋白溶液用氮?dú)鉀_洗以去除微量氧氣，以確保穩(wěn)定，并在使用之前儲(chǔ)存于-80℃下。
如上所述使低密度脂蛋白氧化。簡(jiǎn)言之，用不含EDTA的PBS稀釋該低密度脂蛋白，方法是在氧化實(shí)驗(yàn)之前，將100微升融化的低密度脂蛋白與900微升的PBS混合。將新制備的CuCl2(最終濃度5微摩爾/L)10微升加入到低密度脂蛋白溶液中，以啟動(dòng)氧化。在30℃234nm處通過分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)共軛二烯的形成速率，監(jiān)測(cè)5小時(shí)，每3分鐘讀取一次吸收率。該分光光度計(jì)帶有6個(gè)自動(dòng)樣本存放處，可以在一次分析中提供最多6個(gè)樣本的分析。在使用體外實(shí)驗(yàn)直接混合方法測(cè)試PROVEXCV2TM的活性時(shí)，用低密度脂蛋白單獨(dú)與PBS和CuCl2作為對(duì)照。
低密度脂蛋白的氧化時(shí)間過程表現(xiàn)出3個(gè)連續(xù)階段第一是延遲期，其中幾乎沒有任何共軛二烯形成，然后是旺盛期，其中共軛二烯的形成快速增加，最后是分解期。延遲期定義為CuCl2的加入和旺盛期開始之間的時(shí)間段，它被認(rèn)為是反映了低密度脂蛋白對(duì)于氧化作用的敏感性。
低密度脂蛋白膽固醇樣本中共軛二烯的產(chǎn)生速率表示在圖8中。將天然的低密度脂蛋白膽固醇與等量的已經(jīng)與維生素E(5.3mg/L)或PROVEXCV2TM(1.0mg/L)孵育的低密度脂蛋白膽固醇進(jìn)行比較。在氧化開始之前，延遲時(shí)間是通過維生素E來延遲，而通過PROVEXCV2TM可延遲至明顯的較強(qiáng)程度。該結(jié)果表明當(dāng)暴露于銅離子強(qiáng)氧化條件下時(shí)，PROVEXCV2TM是一種比維生素E更強(qiáng)的抗氧化劑。
本發(fā)明的其它方面、優(yōu)點(diǎn)和變化描述在下述的權(quán)利要求書中。
權(quán)利要求
1.一種食品添加劑，其包括至少一種黃酮類物質(zhì)來源和一種酶，所述的添加劑在以大約30mg/kg或更小劑量能有效抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
2.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述的黃酮類物質(zhì)來源包括一種或多種葡萄籽提取物、葡萄皮提取物、越桔提取物、銀杏提取物或槲皮素。
3.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述的酶包括一種或多種真菌蛋白酶、酸性穩(wěn)定蛋白酶或菠蘿蛋白酶。
4.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述的添加劑以大約20mg/kg或更小劑量能有效抑制血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
5.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述的添加劑以大約10mg/kg或更小劑量能有效抑制血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
6.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述的黃酮類物質(zhì)來源包括至少一種葡萄提取物。
7.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述的黃酮類物質(zhì)來源包括越桔提取物。
8.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述的黃酮類物質(zhì)來源包括銀杏提取物。
9.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述的黃酮類物質(zhì)來源包括槲皮素。
10.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述的添加劑在其攝入后能有效地抑制血小板活性至少4小時(shí)。
11.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述的添加劑在以大約0.2μg/kg/分鐘劑量給藥腎上腺素后，在以大約30mg/kg或更小劑量能有效抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性。
12.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述的酶含有所述添加劑重量的大約24％或更少。
13.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述的食品添加劑包括PROVEXCVTM。
14.權(quán)利要求1的添加劑，其中所述的食品添加劑包括PROVEXCV2TM。
15.一種食品添加劑，其包括一種葡萄籽提取物、葡萄皮提取物、銀杏提取物、越桔提取物、槲皮素、真菌蛋白酶、酸性穩(wěn)定蛋白酶、和菠蘿蛋白酶，所述的添加劑在以大約30mg/kg或更小劑量能有效抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
16.權(quán)利要求15的添加劑，其中所述的添加劑是丸劑。
17.權(quán)利要求15的添加劑，所述的添加劑是粉劑。
18.權(quán)利要求15的添加劑，所述的添加劑是液體制劑。
19.權(quán)利要求15的添加劑，所述的添加劑是植物類劑型。
20.權(quán)利要求15的添加劑，其中所述的添加劑以大約20mg/kg或更小劑量能有效抑制血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
21.權(quán)利要求15的添加劑，其中所述的添加劑以大約10mg/kg或更小劑量能有效抑制血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
22.一種食品添加劑，其包括一種未發(fā)酵過的黃酮類物質(zhì)來源和一種酶，所述的添加劑在以大約30mg/kg或更小劑量能有效抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
23.權(quán)利要求22的添加劑，其中所述的添加劑包括多種黃酮類物質(zhì)來源。
24.權(quán)利要求23的添加劑，其中所述的添加劑包括PROVEXCV2TM。
25.一種抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化的方法，其包括給藥一種含有至少一種黃酮類物質(zhì)來源和一種酶的食品添加劑，所述的添加劑在以大約30mg/kg或更小劑量能有效抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述的食品添加劑以大約20mg/kg或更小劑量能減少血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述的食品添加劑以大約10mg/kg或更小劑量能減少血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述的食品添加劑能減少血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
29.一種治療與血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化有關(guān)的疾病的方法，其包括給藥一種含有至少一種黃酮類物質(zhì)來源和一種酶的食品添加劑，所述的添加劑在以大約30mg/kg或更小劑量能有效抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
30.一種產(chǎn)品，其含有一種食品添加劑，該食品添加劑包括至少一種黃酮類物質(zhì)來源和一種酶，所述的添加劑在以大約30mg/kg或更小劑量能有效抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化，該產(chǎn)品包裝在一種包裝材料當(dāng)中，其中所述的包裝材料標(biāo)示有所述的食品添加劑適用于減少血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化或二者的標(biāo)記。
31.權(quán)利要求30的產(chǎn)品，其中所述的包裝材料標(biāo)示有所述的食品添加劑適用于治療與血小板活性或低密度脂蛋白膽固醇氧化或二者有關(guān)的疾病的標(biāo)記。
32.一種食品添加劑，其包括至少一種黃酮類物質(zhì)來源，所述的添加劑在以大約30mg/kg或更小劑量能有效抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
33.權(quán)利要求32的添加劑，其中所述的添加劑以大約20mg/kg劑量能有效抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
34.權(quán)利要求32的添加劑，其進(jìn)一步包括一種酶。
35.一種食品添加劑，其包括一種未發(fā)酵過的黃酮類物質(zhì)來源，所述的添加劑在以大約30mg/kg或更小劑量能有效抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
36.權(quán)利要求35的添加劑，其中所述的添加劑以大約20mg/kg劑量能有效抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)血小板活性和低密度脂蛋白膽固醇氧化。
37.權(quán)利要求35的添加劑，其進(jìn)一步包括一種酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種食品添加劑,它含有至少一種黃酮類物質(zhì)來源和一種酶,該食品添加劑給哺乳動(dòng)物以大約30mg/kg或更少的劑量服用時(shí),可以有效地抑制體內(nèi)血小板活性和LDL膽固醇氧化。該添加劑可以含有來源于葡萄籽提取物、葡萄皮提取物、越桔提取物、銀杏提取物的黃酮類物質(zhì)或黃酮類槲皮素。該添加劑還可以含有真菌蛋白酶、酸穩(wěn)定性蛋白酶和菠蘿蛋白酶。本發(fā)明還提供一種使用該食品添加劑的方法和含有該添加劑的產(chǎn)品。
文檔編號(hào)A61P9/10GK1268891SQ98808675
公開日2000年10月4日 申請(qǐng)日期1998年8月5日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月6日
發(fā)明者林恩·珀克斯 申請(qǐng)人:麥萊琉卡有限公司