專利名稱：糖尿病治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖尿病或高脂血癥治療劑，更詳細的說是涉及含有作為有效成分的神經(jīng)營養(yǎng)因子的糖尿病或高脂血癥治療劑。
背景技術(shù)：
近年來，由于生活水平的提高，隨著飲食生活向歐美型轉(zhuǎn)變或缺乏鍛練傾向的增加，成年人病如糖尿病、糖尿病并發(fā)癥、高脂血癥病的患者也不斷增加。高脂血癥與動脈硬化及其引起的缺血性心臟病有關(guān)，有時也是與急性胰腺炎的發(fā)病有關(guān)的重要基礎(chǔ)性疾病。另外，確認有患者逐步年輕化的趨勢。
糖尿病分為胰島素依賴性(I型、IDDM)和非胰島素依賴性(II型、NIDDM)，糖尿病患者的90％以上屬于后者。IDDM的治療可以選擇注射胰島素，NIDDM的治療可以選擇運動療法、食物療法以及磺酰脲或雙胍類糖尿病口服治療藥(“今日醫(yī)療指南TODAY’S THERAPY 1993”日野原重明、阿部正和主編，醫(yī)學(xué)書院，494～498頁)。為了調(diào)節(jié)糖尿病的治療中最重要的因素——血糖值經(jīng)常使用這些藥物，但是并不能得到理想的效果，其現(xiàn)狀是持續(xù)的高血糖狀態(tài)會引起神經(jīng)障礙、腎病、視網(wǎng)膜病、心血管疾病或者創(chuàng)傷治愈延遲、潰瘍化等各種并發(fā)癥。另外，注射胰島素容易引起血糖迅速降低、胰島素分泌刺激劑磺酰脲容易引起延遲性低血糖、厭氧性糖元酵解類抑制劑雙胍會引起乳酸中毒的危險，從而使糖尿病患者的生活變得不穩(wěn)定。
另外，II型糖尿病經(jīng)常并發(fā)高脂血癥，膽固醇至甘油三酯異常高的值(總膽固醇220mg/dl以上，甘油三酯150mg/ml以上)是包括心肌梗塞在內(nèi)的動脈硬化性疾病乃至急性胰腺炎的危險因素，已成為藥物療法的對象。治療血中膽固醇過高可以使用HMG-CoA還原酶抑制劑(帕伐他丁(Pravastatin)或Simvastatin等)、抑制膽汁酸肝腸循環(huán)的消膽胺(cholestyramine)，治療血中甘油三酯過高主要可以使用作用溫和的fibrate類制劑或煙堿酸制劑。(“今日醫(yī)療指南TODAY’STHERAPY 1995”日野原重明、阿部正和主編，醫(yī)學(xué)書院，515～517頁；以及伴野祥一等“治療”78卷增刊號，標準處方入門，961060～1066頁)。但是，對于高脂血癥的基本藥物療法目前尚未確立，持續(xù)的血清脂類異常引起的動脈硬化、缺血性心臟病等并發(fā)癥仍然是先進國家中主要的死因。HMG-CoA還原酶抑制劑可以經(jīng)口給藥，是具有優(yōu)良作用的藥物，但是已知對肝功能障礙或腎障礙患者會帶來嚴重的副作用，已知的有橫紋肌融解證。
II型糖尿病還多并發(fā)肥胖癥。從流行病學(xué)的研究來看，可以說肥胖與高血壓、腦或心臟的血管病變相關(guān)連，主要可以采用節(jié)食療法和運動療法進行治療。高度肥胖或不能運動的場合，雖然可以使用外科手術(shù)(胃縮小術(shù))或藥物療法(腎上腺素類、5-羥色胺等中樞刺激劑、消化吸收抑制劑)，但目前還僅僅處于試行階段，也可以說對于肥胖癥的基本藥物療法尚未確立〔“肥胖癥”日本臨床，第53卷·1995年特別號，平成7年6月22日發(fā)行，418～492頁，日本臨床社〕。
如上所述，目前的現(xiàn)狀是盡管II型糖尿病、高脂血癥、肥胖是關(guān)系非常密切的病癥，但是為了改善各種癥狀還是可以對癥治療或給藥的。但是節(jié)食等療法、聯(lián)合用藥由于增加了患者的負擔(dān)，因而也不是優(yōu)選的。
另一方面，神經(jīng)營養(yǎng)因子是由生物體內(nèi)的靶細胞或神經(jīng)及神經(jīng)膠質(zhì)細胞·許旺氏細胞(神經(jīng)鞘細胞)供給，具有維持神經(jīng)細胞生存、促進分化等作用的蛋白質(zhì)的總稱，根據(jù)所作用的神經(jīng)或受體可以分為很多種。其中與作為神經(jīng)營養(yǎng)蛋白已知的蛋白組之間有很高的同源性，形成了一個家族。NGF(神經(jīng)生長因子)、BDNF(來自腦的神經(jīng)營養(yǎng)因子)、NT-3(神經(jīng)營養(yǎng)蛋白)、NT-4/5等均是具有代表性的物質(zhì)，已知對作為受體的P-75和trk基因產(chǎn)物具有特異性配體的作用(野

村健、Hiroshi HATANAKA；實驗醫(yī)學(xué)第13卷376頁(1995))。NGF、BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子一直作為阿爾察默病(Alzheimer’s disease)、糖尿病性神經(jīng)病、ALS等神經(jīng)變性疾病的治療藥來研究其醫(yī)藥用途，但是其降低高血糖狀態(tài)生物的血糖值的作用以及對于高脂血癥等脂肪代謝異常的作用尚未報道。例如A.P.Mizisin等，Society for Neuroscience，第20卷1535頁(1995)中說明了BDNF對于糖尿病性末梢神經(jīng)障礙的藥效，該文獻基于BDNF在體內(nèi)可以減輕運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度低下的知識，僅僅可以得知其對于神經(jīng)病的效果，而完全沒有記載其對于糖尿病的根本癥狀高血糖或由其引起的胰島素抵抗性等病癥的改善作用。在特表平7-507053(WO93/15608)中以糖尿病性視網(wǎng)膜病為例說明了BDNF的藥效，該申請是以視網(wǎng)膜的神經(jīng)障礙為對象的。另外，同樣，以前未認識到作為神經(jīng)營養(yǎng)因子對于脂肪代謝系統(tǒng)異常引起的高脂血癥和肥胖、內(nèi)分泌異常引起的高胰島素血癥的改善作用。另外，也并不知道其它神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的下述降血糖作用。也就是說，關(guān)于NGF，在Brainresearch，第634卷，第7-12頁(1994)中記載了對于鏈脲霉素誘發(fā)糖尿病的大鼠模型NGF具有改善末梢知覺障礙的作用，但是對于其降血糖作用并沒有任何研究。關(guān)于NT-3，在特愿平5-161493(WO91/3659)中描述了其對于包括糖尿病性神經(jīng)病在內(nèi)的末梢性神經(jīng)障礙的用途，但是并未記載其降低血糖值的作用。另外，關(guān)于NT-4，在特表平7-509600(WO93/25684)或特表平6-501617(WO92/5254)中描述了其對于包括糖尿病性神經(jīng)病在內(nèi)的末梢性神經(jīng)障礙的用途，但是并未記載其降低血糖值的作用。只有對于CNTF，報道了其血糖值降低作用(Cytokine，第7卷，150-156頁(1995)和cytokine，第8卷，784-793(1996))，其內(nèi)容為發(fā)現(xiàn)靜脈注射10μg/kgCNTF后的正常小鼠其血糖由正常血糖值開始降低(約100mg/dl→約80mg/dl)，另外，通過移植能產(chǎn)生CNTF的細胞可以降低正常血糖值。如同一文獻記載，這種一時將血糖降低到正常以下的作用是細胞因子(cytokine)IL-1樣的作用，但與本發(fā)明的核心——使II型糖尿病模型動物的高血糖顯著降低的神經(jīng)營養(yǎng)因子作用——有著本質(zhì)的區(qū)別。
發(fā)明描述本發(fā)明的目的在于提供一種可以安全地控制糖尿病患者血糖值的新型糖尿病治療劑，以及可以安全地控制高脂血癥患者血中脂肪值的新型高脂血癥治療劑。特別是提供一種可以治療伴隨胰島素作用不足、胰島素抵抗性、胰島素分泌低下或分泌不足產(chǎn)生高血糖、合并葡萄糖毒性、高脂血癥、肥胖或高胰島素血癥多種癥狀的II型糖尿病的糖尿病治療劑。
本發(fā)明者通過各種糖尿病模型動物研究了末梢給藥的神經(jīng)營養(yǎng)因子所帶來的影響，得知對于II型糖尿病模型動物的一種伴有高血糖、肥胖、胰島素抵抗性、高胰島素血癥的自然發(fā)病的糖尿病小鼠(C57db/db小鼠石田均等，最新醫(yī)學(xué)，第48卷，34頁(1993年))通過投給BDNF可以降低血糖值以及血中脂類的濃度。基于這些知識又進一步進行了研究，從而完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明涉及下述藥物。
(1)以神經(jīng)營養(yǎng)因子為有效成分的糖尿病或高脂血癥治療劑。
(2)如(1)的治療劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子選自神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族。
(3)如(1)的治療劑，其特征在于神經(jīng)營養(yǎng)因子為trk受體或p75受體的配體。
(4)如(1)的治療劑，其特征在于神經(jīng)營養(yǎng)因子為trkB或trkC受體的配體。
(5)如(1)的治療劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子為來源于腦的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)。
(6)如(1)的治療劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子為NGF。
(7)如(1)的治療劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子為NT-3或NT-4/5。
(8)如(1)的治療劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子為CNTF。
(9)如(1)的治療劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子為GDNF。
(10)如(1)的治療劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子為HGF。
(11)如(1)至(10)的治療劑，糖尿病為非胰島素依賴性糖尿病(II型，NIDDM)。
(12)如(1)至(10)的治療劑，其特征在于糖尿病為伴有高血糖、高胰島素血癥、高脂血癥和/或肥胖的非胰島素依賴性糖尿病。
(13)如(1)至(12)的治療劑，其特征在于神經(jīng)營養(yǎng)因子通過誘導(dǎo)的體液生理活性物質(zhì)發(fā)揮藥效。
(14)以神經(jīng)營養(yǎng)因子為有效成分的高胰島素血癥的治療劑。
(15)如(14)的治療劑，其特征在于高胰島素血癥伴隨著綜合癥X、死亡四重奏或內(nèi)臟脂肪綜合癥。
(16)如(1)至(10)的高脂血癥治療劑，用于治療伴隨著糖尿病的高脂血癥。
(17)如(1)至(10)的高脂血癥治療劑，用于治療伴隨著肥胖的高脂血癥。
(18)如(1)至(10)的高脂血癥治療劑，高脂血癥治療劑是血中甘油三酯過高的治療劑。
圖面說明

圖1表示對于db/db小鼠血中脂類的調(diào)節(jié)作用。BDNF給藥組與PBS給藥組相比，血中甘油三酯濃度顯著減少。另外，對于總膽固醇，由于投給BDNF其血中濃度也有某些降低趨勢。
圖2表示對于db/db小鼠的抗肥胖作用。BDNF給藥組與PBS給藥組相比，確認體重沒有增加，抑制了肥胖。
圖3表示對于db/db小鼠改善胰島素抵抗性的作用。BDNF給藥組與PBS給藥組相比，血中胰島素濃度顯著降低。
發(fā)明的最佳實施方式以下詳細的說明本發(fā)明。
在本說明書中，“神經(jīng)營養(yǎng)因子”是1950年發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)生長因子(NGF)等具有維持神經(jīng)細胞生存、促進神經(jīng)分化等生理作用的蛋白質(zhì)的總稱。具體的說，是指來源于腦的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，NGF，包括神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3(NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4/5(NT-4/5)和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白6的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族(R.M.Lindsay等，TISN，第17卷182頁(1994)以及R.M.Lindsay，Phil.Trans.R.Ssoc.Lond.B.，第351卷，第365-373頁(1996))，以及睫狀體神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、來源于神經(jīng)膠質(zhì)的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(GGF2)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長因子(AF-1)、肝實質(zhì)細胞增殖因子(HGF)(A.Ebens等，Neuron，第17卷，第1157-1172頁(1996)等)等。而且，采用基因工程的常規(guī)方法使氨基酸序列部分取代、添加、缺失、除去所制成的上述神經(jīng)營養(yǎng)因子的變更產(chǎn)物，只要具有天然型神經(jīng)營養(yǎng)因子的生理活性，可以包括在本發(fā)明的神經(jīng)營養(yǎng)因子中。
“神經(jīng)營養(yǎng)蛋白”是指在生物體內(nèi)由神經(jīng)生長靶細胞分泌，或通過自分泌和旁分泌有助于神經(jīng)元生長、分化、生存并使之形成神經(jīng)回路(神經(jīng)突觸)的神經(jīng)營養(yǎng)因子。目前已知有BDNF、NGF、NT-3、NT-4/5、NT-6，是氨基酸序列有很高同源性并具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組。以后也有可能發(fā)現(xiàn)新的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，根據(jù)本專利申請的實施例所描述的公知的實驗動物模型可以評價其藥效，該神經(jīng)營養(yǎng)蛋白也包括在本發(fā)明所提供的“糖尿病治療劑”的概念中。這些神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族中，作為神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體已知的trk基因(trkA、trkB、trkC)表達產(chǎn)物是很有用的，特別是通過trkB或trkC基因表達產(chǎn)物TrkB或TrkC受體表現(xiàn)其生理活性的BDNF、NT-3、NT-4/5作為糖尿病治療劑是非常有用的。
“糖尿病”是通?？刂圃?00～120mg/dl的血糖值異常升高的疾病。按照現(xiàn)在診斷的基準，負載75g葡萄糖2小時后血糖值為200mg/dl以上，空腹時血糖達到140mg/dl以上。一般，糖尿病分為伴有胰島素產(chǎn)生細胞減少的胰島素依賴性(I型，IDDM)和由胰島素敏感性降低或胰島素分泌降低引起的非胰島素依賴性(II型，NIDDM)，糖尿病患者90％以上屬于后者。前者被認為是基于一定因素造成的病毒感染或自身免疫機制引起的胰島炎，由于胰臟的胰島出現(xiàn)炎癥，胰島素產(chǎn)生細胞被破壞，導(dǎo)致絕對的胰島素缺乏。多數(shù)場合下發(fā)病迅速，酮病的趨勢增強，為了維持生命必需繼續(xù)注射胰島素。
“非胰島素依賴性糖尿病(II型，NIDDM)”是酮病傾向弱、發(fā)展緩慢，并不一定必須進行胰島素治療的糖尿病。其發(fā)病有的被認為是由于對葡萄糖負載胰島素分泌不足、特別是初期分泌不足的遺傳因素，由加上肥胖、過度飲食、缺乏鍛練、年齡增大等環(huán)境因素造成的。另一方面，其發(fā)病也有的被認為是由于胰島素作用不足(胰島素抵抗性)的遺傳因素導(dǎo)致胰臟B細胞負荷過大、疲憊，由加上環(huán)境因素造成的。后一種類型以歐美的患者居多，血中胰島素的濃度很高(高胰島素血癥)、并伴有肥胖的場合較多?？傊翘幱谙鄬Φ囊葝u素缺乏狀態(tài)，但并不一定必須用胰島素進行治療，能夠以食物療法、運動療法作為基礎(chǔ)，在血糖調(diào)節(jié)不良的場合，采用促進胰島素分泌的磺酰尿素藥(SU藥)、抑制小腸吸收糖的藥物進行治療。特別是對于伴有肥胖的患者不能使用US藥，可以考慮使用雙胍進行治療或使用最近上市的可以解除胰島素抵抗性的新藥等。胰島素依賴性糖尿病、非胰島素依賴性糖尿病兩者，在由于血糖調(diào)節(jié)不良而持續(xù)高血糖狀態(tài)時，均可以引起糖尿病性腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、皮膚潰瘍、壞死、心血管障礙等各種并發(fā)癥。
在本發(fā)明、本說明書中，被稱為MODY(maturity-onset type of thediabetes in the young)的青年發(fā)病的非胰島素依賴性糖尿病、胰島素受體異常、與胰島素分泌或胰島素作用等糖代謝有關(guān)的酶或分子等的基因異常引起的糖尿病也包括在II型糖尿病內(nèi)。另外，雖然與糖代謝之間的直接關(guān)系、機理尚不清楚，但伴有作為II型糖尿病發(fā)病基因進行解析的線粒體等基因異常的糖尿病也包括在內(nèi)。而且，糖皮質(zhì)激素等甾體類藥物連續(xù)給藥時所產(chǎn)生的病理高血糖狀態(tài)(甾體類糖尿病)、庫興氏綜合征(Cushing’s syndrome)或肢端肥大癥中的高血糖狀態(tài)，從正常乃至高胰島素狀態(tài)下的糖尿來看，也包括在II型糖尿病內(nèi)。
“高脂血癥治療劑”是指投藥給高脂血癥患者，使由甘油三酯(中性脂肪)和膽固醇組成的血中脂類濃度下降的藥物。
“高脂血癥”是血中脂類濃度持續(xù)處于異常高值的疾病，按照現(xiàn)在的診斷基準，可以說是處于空腹時血清總膽固醇值為220mg/dl以上或血清甘油三酯為150mg/ml以上的狀態(tài)。已知高脂血癥一般是缺血性心臟病等動脈硬化性疾病的危險因素，特別是LDL膽固醇的增加、HDL膽固醇的減少是最危險的。LDL-C值達到100-160mg/ml以上、HDL值不滿40mg/ml的場合即成為“高脂血癥治療劑”的給藥對象?！案咧Y”中有由于家族性血膽固醇過高等遺傳因素引起的，以及由于肥胖或過度飲食、講究飲食引起的，而且按癥狀可以分為高乳糜微粒血癥(I型)、高膽固醇血癥(IIa型高脂血癥)、高甘油三酯血癥(IV型)、其并發(fā)型(IIb型或III型)等。本說明書中的高脂血癥是將這些全部包括在內(nèi)的概念。
“血糖調(diào)節(jié)作用”是指將糖尿病患者的血糖值降低或保持在正常范圍內(nèi)的作用?！把兄愓{(diào)節(jié)作用”是指將高脂血癥患者的血中總膽固醇值或血中總甘油三酯值降低或者保持在正常范圍內(nèi)的作用?！敖M織脂肪蓄積調(diào)節(jié)作用”是指通過使肥胖患者減少能量攝取或減少體內(nèi)脂肪蓄積，從而減少體重的作用。
“胰島素抵抗性”是指為了與健康人同程度的發(fā)揮胰島素作用所必需的胰島素水平比健康人高很多的狀態(tài)。即胰島素的作用、敏感性降低的狀態(tài)。胰島素作用的靶器官，例如肝臟、肌肉(骨骼肌)、脂肪組織。在本發(fā)明、本說明書中，末梢器官是指胰島素作用的肝臟、肌肉(骨骼肌)、脂肪組織。對于肝臟，胰島素具有抑制糖異生、抑制糖釋放等作用。對于肌肉、脂肪組織，胰島素具有促進糖吸收的作用，糖的吸收與從被稱為GLUT4的糖運輸載體由細胞質(zhì)內(nèi)向細胞膜表面移位(translocation)有關(guān)。作為胰島素抵抗性的臨床評價，例如降血糖高胰島素血夾(euglycemic hyperinsulinemic clamp)法等。
雖然胰島素抵抗性的原因并不清楚，但是對于末梢器官即肝臟、肌肉、脂肪組織，胰島素作用不足的原因可以認為有以下幾點。可以認為是以胰島素受體為媒介的信號傳導(dǎo)通路障礙·異常、胰島素對于肌肉·脂肪組織的激素作用所引起的與糖吸收有關(guān)的GLUT4(糖運輸載體)低下·機能異常、向GLUT4的細胞膜轉(zhuǎn)運(translocation)表達低下異常、肌肉·肝臟中糖元合成低下、肝臟的糖異生亢進等。造成胰島素抵抗性的分子并不清楚，但可以指出其與葡萄糖胺、被稱為RAD的低分子G蛋白、Chyroinositol肌醇、TNF-α、游離脂肪酸、被稱為PC-1的膜蛋白等有關(guān)。胰島素受體基因異常引起的胰島素作用不足是已知的胰島素受體異常。
另外，糖尿病中所確認的高血糖，并不是單純的一個檢查結(jié)果，高血糖可以障礙胰島素的分泌造成，使胰島素抵抗性不斷惡化。這樣高血糖可以被認為是助長代謝異常的重要病因“葡萄糖毒性”(參見門脅孝編，糖尿病分子醫(yī)學(xué)，羊土社(1992年)等)。
“胰島素抵抗性的改善作用”是指拮抗末梢組織的糖吸收低下、糖元分解亢進、糖異生亢進等，特別是II型糖尿病中可見的體細胞對于胰島素敏感性鈍化引起的變化(胰島素抵抗性的增大)的藥理作用。顯示該藥理作用的場合，一般降低了血糖值，由于生物體系的反饋血中胰島素濃度也降低。
1988年G.M.Raven提出了綜合癥X(Syndrome X)的概念，即同時患有胰島素抵抗性、耐糖能力低下、高胰島素血癥、高VLDL甘油三酯血癥、低HDL膽固醇血癥、高血壓，容易發(fā)生動脈硬化的綜合癥(G.M.Raven，Diabetes，第37卷第1595-1607頁(1988))。在1994年第15回國際糖尿病學(xué)會的討論會中，對以胰島素抵抗性為基礎(chǔ)的高胰島素血癥發(fā)病后繼續(xù)引起耐糖能力低下、高VLDL甘油三酯血癥、低HDL膽固醇血癥、高血壓最終導(dǎo)致心血管系統(tǒng)障礙的“胰島素抵抗性綜合癥”這一概念展開了討論。另外，在1989年N.M.Kaplan將上半身肥胖、耐糖能力低下、高甘油三酯血癥、高血壓稱為死亡的四重奏(deadlyquartet)，并指出對于同時患有這些病癥的人缺血性心臟病的發(fā)病率很高(N.M.Kaplan，Arch.INtern.Med.第49卷，1514-1520頁(1989))。而且，松澤等由肥胖的病理研究開始著眼于脂肪分布與并發(fā)癥的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)的內(nèi)臟脂肪(腸系膜脂肪或大網(wǎng)膜脂肪)蓄積形成的內(nèi)臟脂肪型肥胖與皮下脂肪肥胖相比多伴有耐糖能力低下、胰島素抵抗性、高脂血癥、心血管障礙。松澤等提出了內(nèi)臟脂肪綜合癥(visceral fat syndrome)的概念，即以內(nèi)臟脂肪蓄積為基礎(chǔ)的耐糖能力低下、胰島素抵抗性、高脂血癥、高血壓等數(shù)個危險因素同時存在容易引起動脈硬化的病態(tài)(中村正等，第12回日本肥胖學(xué)會記錄，第161-162頁(1992)；藤岡滋典、松澤佑次，分子糖尿病學(xué)的進步，第145-151頁(1994))。上述各個概念均是相互關(guān)連的概念，除上述名稱以外，以飲食生活歐美化為病因的可以類似地稱為可口可樂綜合癥(coca-colanization)、文化互滲(Acculturation)、現(xiàn)代化(Modernization)、西化(Westernization)等，也可以稱為“New WordSyndrome”。如本發(fā)明、本說明書的實施例所示，神經(jīng)營養(yǎng)因子的確對于預(yù)防、治療上述概念的綜合癥、疾病、病態(tài)等有效。
在本說明書中，“高胰島素血癥”是血中的胰島素濃度比正常范圍高的病態(tài)、疾患的總稱?！熬C合癥X”是指同時患有胰島素抵抗性、耐糖能力低下、高胰島素血癥、高VLDL甘油三酯血癥、低膽固醇血癥、高血壓容易發(fā)生動脈硬化的綜合癥?！八劳龅乃闹刈?deadly quartet)”是指同時患有上半身肥胖、耐糖能力低下、高甘油三酯血癥、高血壓的疾病?！皟?nèi)臟脂肪綜合癥(visceral fat syndrome)”是指腹腔內(nèi)內(nèi)臟脂肪(腸系膜脂肪或大網(wǎng)膜脂肪)蓄積、以內(nèi)臟脂肪蓄積為基礎(chǔ)的耐糖能力異常、高脂血癥、高血壓等數(shù)個危險因素同時存在，容易引起動脈硬化的病態(tài)。
“神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)的液體生理活性物質(zhì)”是指投給神經(jīng)營養(yǎng)因子后在動物的生物體內(nèi)進行誘導(dǎo)，由末梢血釋放的具有血糖調(diào)節(jié)作用、血中脂類調(diào)節(jié)作用、體內(nèi)脂肪蓄積調(diào)節(jié)作用或改善胰島素抵抗性作用的生理活性物質(zhì)的總稱。
制備方法本發(fā)明的糖尿病或高脂血癥治療劑中所使用的神經(jīng)營養(yǎng)因子，只要具有其各自固有的生理活性即可，無論天然提取物、基因重組產(chǎn)物都可以在純化后用于本發(fā)明。以下說明它們的制備方法。
BDNF的制備方法BDNF是根據(jù)Barde，Y.E(The EMBO J.，第5卷，第549-553頁(1982))從豬腦分離出來之后克隆得到的具有由119個氨基酸構(gòu)成的一級結(jié)構(gòu)的物質(zhì)(Leibrock，J等，Nature，第341卷，第149頁(1989))，N末端具有蛋氨酸殘基的Met-BDNF通過現(xiàn)在公知的手段將上述天然序列的一部分取代、缺失或添加制成的重組BDNF變更產(chǎn)物，只要是具有BDNF活性的藥物制劑均包括在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。
另外，在本說明書中，BDNF的活性是指后根神經(jīng)節(jié)、迷走神經(jīng)下神經(jīng)節(jié)、運動神經(jīng)元、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)、黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元、前腦基底膽堿能神經(jīng)元等維持生存、促進分化的作用等。其在生物體內(nèi)的作用可以通過體外或體內(nèi)進行確認(特開平5-328974、US5180820)。
已經(jīng)報道了多種BDNF的生產(chǎn)方法，采用任何一種方法制得的BDNF均可用于本發(fā)明的制劑。動物組織提取物的場合，只要是純化到可以用作藥物的程度即可(The EMBO J.，第5卷第549-553頁(1982))。另外，也可以培養(yǎng)產(chǎn)生BDNF的原代培養(yǎng)細胞或株化細胞，從培養(yǎng)物(培養(yǎng)上清，培養(yǎng)細胞)分離純化得到BDNF由表，可通過基因工程學(xué)方法將編碼BDNF的基因重合到合適的載體中，然后將它們插入到適宜的宿主中進行轉(zhuǎn)化，從所得轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清中可得到目的重組BDNF(例如Proc.Natl.Acad.Sic.USA，第88卷，961頁(1991)；Biochem.Biophys.Res.Commun.，第186卷，1553頁(1992))，該方法適于均勻且大量的生產(chǎn)BDNF。上述宿主細胞并無特別的限定，可以使用以前在基因工程的手段中使用的各種宿主細胞，例如大腸菌、枯草芽孢桿菌、酵母、植物或動物細胞。
NGF的制備方法NGF與BDNF同樣，可以使之在各種宿主細胞中表達而制得。以動物細胞作為宿主的場合(CHO細胞Schmelzer，C.H.，J.Neurochemistory，59，1675-1983(1992))、以原核細胞作為宿主的場合(大腸桿菌日本專利2637392號)均可以制得具有活性的NGF。
NT-3的制備方法NT-3與BDNF同樣，可以使之在各種宿主細胞中表達而制得。Neuron，第4卷，767-773(1990)或特開平5-161493(WO91/3659)中公開了其制備方法、鑒定方法。
NT-4的制備方法NT-4與BDNF同樣，可以使之在各種宿主細胞中表達而制得。Proc.Natl.Acad.Sic.USA，第89卷，3060-3064頁(1992.4)、特表平7-509600(WO93/25684)或特表平6-501617(WO92/5254)中記載了重組NT-4表達方法以及鑒定方法。
CNTF的制備方法CNTF與BDNF同樣，可以使之在各種宿主細胞中表達而制得。Biochimica et Biochimica Acta，第1090卷，70-80頁(1991)、J.Neurochemistry，第57卷，1003-1012(1991)中記載了重組CNTF表達方法以及鑒定方法。另外，特表平4-502916(WO90/7341)中公開了重組制法和純化方法。
GDNF的制備方法GDNF也與BDNF同樣，可以使之在各種宿主細胞中表達而制得。Science，第260卷，第1130-1132頁(1993.5)、WO97/19694、WO97/19695中公開了制備方法。
HGF的制備方法HGF與BDNF同樣，可以使之在各種宿主細胞中表達而制得。例如可以按照Nature，第342卷，440(1989)、特開平5-111383、特開平4-30000中記載的方法得到重組HGF，并評價其活性。
制劑上述各種神經(jīng)營養(yǎng)因子的制劑，可以使用注射劑、口服劑、液體制劑、冷凍干燥物中的任意一種，特別優(yōu)選皮下給藥用的注射劑。這些藥物制劑中可以使用本領(lǐng)域(藥用蛋白質(zhì)制劑技術(shù))中所公知的穩(wěn)定劑、載體，例如可以使用白蛋白等來源于血漿的蛋白、甘氨酸等氨基酸、甘露醇等糖用于皮下、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥用的冷凍干燥制劑。另外，作為水溶制劑、冷凍干燥制劑使用時，為了防止凝集優(yōu)選添加Tween80等表面活性劑。需要長期的藥效時，也可以使用公知的蛋白質(zhì)緩釋制劑載體來制備。
使用方法本發(fā)明的糖尿病或高脂血癥治療劑的使用方法如下所述。
BDNF的使用方法主成分為BDNF時，1天的用量為成人每公斤0.01μg～100mg，優(yōu)選0.1μg～1mg/kg，經(jīng)靜脈、皮下、皮內(nèi)或肌肉給藥。給藥次數(shù)可以根據(jù)給藥量、給藥途徑或患者的癥狀適當(dāng)增減，并沒有特別的限制，可以1月1次至1日3次給藥，進行給藥治療1日至9個月。經(jīng)過這種治療，血糖值、血中脂類和體內(nèi)脂肪(或體重)減少，可以適度降低血糖值、血中脂類并使之穩(wěn)定。另外，同時考慮日常的飲食生活，為了控制飯后的高血糖，可以在飯前投給本發(fā)明的速效性治療劑；為了增強兩餐之間空腹的時候或睡眠中胰島素基礎(chǔ)分泌帶來的作用，可以投給具有持續(xù)性作用的治療劑。
NGF的使用方法主成分為NGF時，通常1天的用量為成人每公斤0.01μg～10mg，優(yōu)選0.1μg～1mg/kg，經(jīng)靜脈、皮下或肌肉給藥。另外，NGF與BDNF或NT-3等通過trkB、trkC受體作用的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白相比，為了使之顯示降血糖作用還需要更大的給藥量。也就是說，在動物試驗中，其它神經(jīng)營養(yǎng)蛋白20mg/kg即可確認其有效性，而通過trkA受體作用的NGF使用相同用量是無效的，100mg/kg才可以確認其有效性。
NT-3的使用方法主成分為NT-3時，通常1天的用量為成人每公斤0.01μg～40mg，優(yōu)選0.1μg～lmg/kg，經(jīng)靜脈、皮下或肌肉給藥。
NT-4的使用方法主成分為NT-4時，通常1天的用量為成人每公斤0.01μg～40mg，優(yōu)選0.1μg～1mg/kg，經(jīng)靜脈、皮下或肌肉給藥。
CNTF的使用方法主成分為CNTF時，通常1天的用量為成人每公斤0.01μg～40mg，優(yōu)選0.1μg～1mg/kg，經(jīng)靜脈、皮下或肌肉給藥。
GDNF的使用方法主成分為GDNF時，通常1天的用量為成人每公斤0.01μg～40mg，優(yōu)選0.1μg～1mg/kg，經(jīng)靜脈、皮下或肌肉給藥。
HGF的使用方法主成分為HGF時，通常1天的用量為成人每公斤0.01μg～40mg，優(yōu)選0.1μg～1mg/kg，經(jīng)靜脈、皮下或肌肉給藥。
作用機理神經(jīng)營養(yǎng)因子的降血糖作用和治療高脂血癥的作用不能根據(jù)以前的知識來解釋，至少可以認為是與胰島素或IGF的作用或者HMG-CoA還原酶抑制劑(帕伐他丁或Simvastatin等)、抑制膽汁酸肝腸循環(huán)的消膽胺(cholestyramine)，或fibrate類制劑及煙堿酸制劑完全不同，通過新的藥理機制發(fā)生作用。
神經(jīng)營養(yǎng)因子的抗糖尿病作用的機理尚不清楚。但是，可以假定為以下的作用方式。首先，可以考慮通過神經(jīng)細胞特別是trk、p75等受體發(fā)生作用的可能性以及通過非神經(jīng)細胞中存在的含有trk、p75等的受體發(fā)生作用的可能性。也可能由于這些刺激直接的或通過其它第二生物體內(nèi)分子間接的發(fā)生作用。作用部位可以假定為(1)丘腦下部等中樞神經(jīng)或下垂體，(2)肌肉、脂肪、肝臟等末梢組織，以及(3)可以產(chǎn)生胰島素的胰臟3個部位。首先，可以認為是通過丘腦下部或下垂體維持血糖等生物內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的調(diào)節(jié)作用。對于第二末梢組織，可以假定是胰島素抵抗性的緩解、解除。對于胰臟，可以認為是對胰高血糖素的影響。由于已經(jīng)確認了其速效作用，其緩釋作用可以假定為通過投給神經(jīng)營養(yǎng)因子在生物體內(nèi)誘導(dǎo)作為第二活性本體的不穩(wěn)定活性物質(zhì)或液體生理活性物質(zhì)。
毒性、副作用BDNF對大鼠和彌猴分別以BDNF100mg/kg、60mg/kg的量皮下給藥4周，未出現(xiàn)死亡例，另外至于急性毒性，對大鼠和彌猴以200mg/kg以上的給藥量給藥也未發(fā)現(xiàn)死亡，安全性較高。另外，將BDNF投給大鼠等正常動物時，血糖未降低，認為沒有引起低血糖的危險性。將BDNF投給斷食一夜的正常動物時，血糖也未降低。
NGFNGF靜脈注射(i.v.)、皮下注射(s.c.)1次給藥的場合，已有報告指出使用0.1μg/kg以上的用量對于健康正常人志愿者會出現(xiàn)肌肉痛，但即使以最大給藥量1μg/kg給藥也不會有危及生命的嚴重副作用(Ann.Neurol.，第36卷，第244-246頁(1994))。另外，將NGF5mg/kg(s.c.)投給大鼠，每周3次，給藥14周，研究其對知覺神經(jīng)障礙的影響(Brain research，第634卷，第7-12頁(1994))，發(fā)現(xiàn)1天的用量在mg/kg等級不會達到大鼠的致死量。
CTNF對于肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥(ALSAmyotrophic lateralscleorosis)患者皮下注射，1天0.5～30μg/kg，每周3次，給藥12周后，發(fā)現(xiàn)30μg/kg的用量會引起發(fā)熱、干咳、疲勞感(ClinicalNeuropharmacology，第18卷，第515-532頁(1995))，但是并沒有報告說明該用量具有致死作用。另外，對于相同的患者連日皮下給藥2～100μg/kg進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有既往病史的患者以高用量(10μg以上)投給CNT后會出現(xiàn)皰疹口炎、食欲減退、體重減少、咳嗽等(Neurology，第47卷，第1329-1331頁(1996))。
NT-3、NT-4、GDNF和HGF確認這些神經(jīng)營養(yǎng)因子都與BDNF相同，沒有危及生命的副作用、毒性。
以下，結(jié)合實施例說明本發(fā)明。
制劑例在本發(fā)明的神經(jīng)營養(yǎng)因子制劑中，代表性的BDNF皮下給藥用水溶制劑或冷凍干燥制劑，可以按照以下的方法制備。
(1)相對于純化重組BDNF 1mg，加入甘氨酸0.34mg、甘露醇9mg、非離子表面活性劑聚山梨醇酯80 0.2mg，溶解于磷酸緩沖溶液1ml(pH7.4，5mM)，將上述溶液冷凍干燥。
(2)用含有150mM氯化鈉、0.01％Tween80的10mM磷酸緩沖溶液(pH7.0)將BDNF調(diào)節(jié)為5mg/ml，得到BDNF水溶液。
(3)用含有150mM氯化鈉、0.01％Tween80的10mM磷酸緩沖溶液(pH7.0)將BDNF調(diào)節(jié)為5mg/ml。然后加入甘露醇使之達到10mg/ml，得到BDNF水溶液。填充到無菌的小瓶中，冷凍干燥，得到BDNF冷凍干燥制劑。在小瓶中封入氮氣，封口。
實施例1藥理試驗對db/db小鼠的血糖調(diào)節(jié)作用讓非胰島素依賴性糖尿病小鼠“db/db小鼠”(雌性，10周齡，每組10只)自由攝食，投給BDNF 20mg/kg，1日1次，1周5日，共給藥8周(皮下給藥)。給藥前以及給藥后4和8周后由尾靜脈取血，使用Tide血糖測定試劑盒(己糖激酶法，拜耳·三共)測定血中的葡萄糖濃度。給藥前的取血在自由攝食的條件下進行，給藥第4和8周的取血在斷食24小時后進行，以PBS(磷酸緩沖生理鹽水)給藥組作為對照組。
使用BDNF得到的結(jié)果如表1所示。通過Student’s t-檢驗檢定BDNF給藥組與對照組的血糖值之間的顯著差別。
表1

**p＜0.01*p＜0.05如表1所示，BDNF給藥組與對照組相比，血中葡萄糖濃度大幅度減少，血糖值接近正常小鼠的血糖值。而且，對該db/db小鼠的降血糖作用不會降低到正常小鼠(db/m小鼠)的血糖值以下，具有特異性。而已知的口服降血糖藥往往會導(dǎo)致低血糖，與此相比這可以說是一個優(yōu)良的特性。另外，由于BDNF給藥組的攝食量也有所減少，即使將對照組的飼料量調(diào)節(jié)到與BDNF給藥組相同的量(Pair feeding)進行試驗，仍可以見到同樣的血糖值差?？梢哉J為BDNF調(diào)節(jié)血糖值的作用并不僅僅是由于攝食量的減少而造成的。
實施例2藥理試驗BDNF對db/db小鼠的血中脂類調(diào)節(jié)作用讓高血糖以及高脂血癥自然發(fā)病的db/db類小鼠(雌性，7周齡，每組9-10只)自由攝食，投給PBS(磷酸緩沖生理鹽水)或BDNF(20mg/kg)，1日1次，每周7日，皮下給藥2周。最后一次給藥約24小時后，在自由攝食的條件下由尾靜脈取血，測定血漿中脂類濃度。使用和光純藥的甘油三酯測定試劑盒“甘油三酯G-Test wako-”測定血中甘油三酯的濃度，使用和光純藥的總膽固醇測定試劑盒“膽固醇E-Test Wako-”測定血中總膽固醇濃度。另外，以未患有高脂血癥的db/m小鼠的血中脂類濃度作為健康正常動物血中脂類的標準值。
試驗結(jié)果如圖1所示。投給PBS的db/db小鼠的血中脂類為甘油三酯達到約180mg/dl，總膽固醇達到150mg/dl，與db/m小鼠相比分別增加到2.5倍、1.7倍。另一方面，BDNF給藥組顯著抑制了血中脂類濃度的增加，特別是甘油三酯濃度的增加，甘油三酯顯著降低到約75mg/dl(經(jīng)Student’s t-檢驗檢定)?？偰懝檀家灿薪档偷?38mg/dl的趨勢。
實施例3藥理試驗BDNF對db/db小鼠的抗肥胖作用讓高血糖以及肥胖癥自然發(fā)病的db/db系小鼠(雌性，7周齡，每組9-10只)自由攝食，投給PBS(磷酸緩沖生理鹽水)或BDNF(20mg/kg)，1日1次，每天皮下給藥，共給藥4周。7天、14天、28天后于BDNF給藥前測量體重。
試驗結(jié)果如圖2所示。PBS給藥組體重竟增加10g(27g→37g)，而BDNF給藥組4周體重僅增加了1g，確認未出現(xiàn)肥胖(25g→26g)。
實施例4藥理試驗BDNF對db/db小鼠的胰島素抵抗性改善作用讓高血糖以及高胰島素血癥自然發(fā)病的db/db小鼠(雌性，7周齡，每組9-10只)自由攝食，投給PBS(磷酸緩沖生理鹽水)或BDNF(20mg/kg)，1日1次，每日皮下給藥，共給藥4周。最后一次給藥約24小時后，在自由攝食的條件下由尾靜脈取血，測定血漿中的胰島素濃度。使用森永生科學(xué)研究所(株)的胰島素測定試劑盒測定血中胰島素濃度。另外，以未患有高胰島素血癥的db/m小鼠的血中胰島素濃度作為健康正常動物的血中胰島素濃度標準值。
試驗結(jié)果如圖3所示。投給PBS的db/db小鼠的血中胰島素達到約17ng/ml，而BDNF給藥組則顯著抑制了血中胰島素的增加，顯著降低到約9ng/ml(經(jīng)Student’s t-檢驗檢定)。與對照組相比，BDNF給藥組盡管降低了胰島素濃度，也仍然降低了血糖值，說明對于BDNF給藥組db/db小鼠的胰島素抵抗性得到了改善。
實施例5藥理試驗神經(jīng)營養(yǎng)因子對db/db小鼠的血糖調(diào)節(jié)作用讓非胰島素依賴性糖尿病小鼠“db/db小鼠”(雌性，7周齡，每組3-4只)自由攝食，將神經(jīng)營養(yǎng)因子20mg/kg～100mg/kg皮下給藥。給藥前和給藥后1，2，3，4，6小時后由尾靜脈取血，使用アントセンスII(固定化酶膜/過氧化氫電極法，拜耳·三共)測定血中葡萄糖濃度。以PBS(磷酸緩沖生理鹽水)給藥組作為對照組。
結(jié)果如表2所示。通過t-檢驗或Welch檢驗檢定給藥前的值與給藥后的值之間的顯著差別。另外，各種神經(jīng)營養(yǎng)因子使用以下各公司的產(chǎn)品。BDNF(リジエネロン社)、CNTF(リジエネロン社)、HGF(住友制藥)、NT-3(ペプロテツク社)、GDNF(ペプロテツク社)、NGF(セロテツク社)。
表2

工業(yè)實用性如上所述，本發(fā)明的降血糖藥除具有血糖調(diào)節(jié)作用之外，還具有調(diào)節(jié)血中脂類的作用、調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪蓄積的作用、改善胰島素抵抗性的作用，可以綜合治療同時患有高脂血癥、肥胖癥或高胰島素血癥的糖尿病。
權(quán)利要求
1.糖尿病或高脂血癥治療劑，以神經(jīng)營養(yǎng)因子為有效成分。
2.如權(quán)利要求1所述的治療劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子選自神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族。
3.如權(quán)利要求1所述的治療劑，其特征在于神經(jīng)營養(yǎng)因子為trk受體或p75受體的配體。
4.如權(quán)利要求1所述的治療劑，其特征在于神經(jīng)營養(yǎng)因子為trkB或trkC受體的配體。
5.如權(quán)利要求1所述的治療劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子為來源于腦的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)。
6.如權(quán)利要求1所述的治療劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子為NGF。
7.如權(quán)利要求1所述的治療劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子為NT-3或NT-4/5。
8.如權(quán)利要求1所述的治療劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子為CNTF。
9.如權(quán)利要求1所述的治療劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子為GDNF。
10.如權(quán)利要求1所述的治療劑，神經(jīng)營養(yǎng)因子為HGF。
11.如權(quán)利要求1至10任一項所述的治療劑，糖尿病為非胰島素依賴性糖尿病(II型，NIDDM)。
12.如權(quán)利要求1至10任一項所述的治療劑，其特征在于糖尿病為伴有高血糖、高胰島素血癥、高脂血癥和/或肥胖的非胰島素依賴性糖尿病。
13.如權(quán)利要求1至12任一項所述的治療劑，其特征在于神經(jīng)營養(yǎng)因子通過誘導(dǎo)的液體生理活性物質(zhì)發(fā)揮藥效。
14.高胰島素血癥的治療劑，以神經(jīng)營養(yǎng)因子為有效成分。
15.如權(quán)利要求14所述的治療劑，其特征在于高胰島素血癥伴隨著綜合癥X、死亡四重奏或內(nèi)臟脂肪綜合癥。
16.如權(quán)利要求1至10任一項所述的高脂血癥治療劑，用于治療伴隨著糖尿病的高脂血癥。
17.如權(quán)利要求1至10任一項所述的高脂血癥治療劑，用于治療伴隨著肥胖的高脂血癥。
18.如權(quán)利要求1至10任一項所述的高脂血癥治療劑，高脂血癥治療劑是高甘油三酯血癥的治療劑。
全文摘要
提供一種以BDNF(來源于腦的神經(jīng)營養(yǎng)因子)、trkB或trkC受體的配體、NGF、NT－3、NT－4/5、CNTF、GDNF、HGF等神經(jīng)營養(yǎng)因子為有效成分的糖尿病或高脂血癥治療劑,特別是Ⅱ型糖尿病的治療劑。提供一種新型糖尿病或高脂血癥治療劑,它與Ⅱ型糖尿病治療劑的主流——口服降血糖藥不同,除具有血糖調(diào)節(jié)作用以外還具有調(diào)節(jié)血中脂類的作用、調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪蓄積的作用,單獨使用即可改善伴有高脂血癥或肥胖癥的糖尿病的危險因素。
文檔編號A61K38/18GK1250379SQ98803408
公開日2000年4月12日 申請日期1998年1月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月23日
發(fā)明者岸野道子, 中山智加男, 泰地睦夫, 市原準二, 野口浩 申請人:住友制藥株式會社