專(zhuān)利名稱(chēng)：凝血酶突變蛋白質(zhì)作為凝血酶抑制劑的解毒劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的凝血酶突變蛋白質(zhì)，涉及其制備及其用作凝血酶抑制劑的解毒劑。
依據(jù)對(duì)凝血酶直接抑制的原理而起作用的抗凝藥對(duì)于抗凝血治療逐漸變得重要。廣泛應(yīng)用抗凝藥物的必須前提是在過(guò)量情況下，中和其效果的可能性，其中使衰竭減輕或分泌降低，這樣抑制出血的副作用，這些副作用隨后會(huì)很危險(xiǎn)，如腹膜，心包膜，肺膜區(qū)的出血。而已有的肝素高效解毒劑為硫酸魚(yú)精蛋白，聚賴氨酸和血小板因子4，迄今還沒(méi)有用于人類(lèi)的中和凝血酶抑制劑的合適的解毒劑。
文獻(xiàn)中描述了不同的解毒劑原理。Fareed提示活化的血漿部分，如自身復(fù)合產(chǎn)物或FEIBA，作為中和水蛭素的成分然而，由于它們的活性類(lèi)似于凝血酶原激酶而不適合用于中和。(Fareed,Fed Proc 3(1989)A 328；Welenga Sem.凝血.止血.15(1989)316-333)。
Markwardt(血栓形成研究74(1994)1-23)描述了凝血酶和凝血酶衍生物的應(yīng)用。例如凝血酶)，凝血酶/2-巨球蛋白復(fù)合物和meizothrombin。化學(xué)失活的凝血酶如DFP-凝血酶或苯甲酰-凝血酶中和水蛭素的應(yīng)用也有描述(Markwardt，藥學(xué)，44(1989)648-649)。
然而，這些產(chǎn)物均不適于用作人類(lèi)解毒劑，由于其凝血活性及其對(duì)水蛭素低至1000倍的親和活性(F.Doyle酶學(xué)方法；222卷，299頁(yè)，Moriat酶學(xué)方法；80卷，303頁(yè)，Stone等生物化學(xué)26(1987)4617-4624,Markwardt，藥學(xué)，44(1989)648-649)。
人類(lèi)的凝血酶原已由Friezner等了解并描述(生物化學(xué)，22(1983)2087-2097)。人類(lèi)凝血酶原的氨基酸序列也在序列號(hào)NO:14中表示。在文獻(xiàn)中可發(fā)現(xiàn)多種人類(lèi)凝血酶序列編號(hào)方法(zahlweisen)，這就是除非另外指出下文皆用序列號(hào)NO:14編號(hào)方法的原因。
一種基因工程的酶學(xué)失活的凝血酶由Lentz等描述(生物化學(xué)雜志266,15,9598-9604)。這其中，催化必需的位于205(序列號(hào)NO:14中525)位置的絲氨酸殘基被丙氨酸取代，導(dǎo)致酶學(xué)失活的凝血酶變異物，它對(duì)合成底物和天然底物纖維蛋白原無(wú)剪切活性(Lent等，生物化學(xué)雜志266,15,9598-9694)但對(duì)凝血酶抑制劑芐基精氨酸-N-(3-乙基-1,5-二戊烷基)酰胺有弱的結(jié)合活性。
Stone等的研究(生物化學(xué)30,6392-6397)發(fā)現(xiàn)了天然的凝血酶變異體QickⅡ.QuickⅡ凝血酶與天然凝血酶只在位置238有區(qū)別(序列號(hào)NO:14中位置558)。此時(shí)天然凝血酶238位的甘氨酸殘基突變?yōu)槭杷畾埢i氨酸。酶的P1口袋中這一小突變導(dǎo)致纖維蛋白原的剪切速率的顯著下降(原始活性的2％)，同時(shí)，對(duì)低分子量底物和水蛭素的結(jié)合都急劇下降。Stone指出突變蛋白質(zhì)對(duì)水蛭素的結(jié)合常數(shù)退化了1000倍，且通過(guò)結(jié)合空腔的空間阻礙和活性中心的環(huán)境構(gòu)象識(shí)別解釋此結(jié)果。
迄今發(fā)現(xiàn)凝血酶突變蛋白質(zhì)不適用作為凝血酶抑制劑的解毒劑，由于它們對(duì)凝血酶抑制劑的親和力太弱或其對(duì)纖維蛋白原的結(jié)合和酶促活性太高。
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供新的凝血酶突變蛋白質(zhì)，它們是基平地酶活性失活的，與凝血酶抑制劑結(jié)合良好的，同時(shí)，與未修飾的凝血酶相比，其結(jié)合天然底物纖維蛋白原親和力低。
我們已發(fā)現(xiàn)通過(guò)與天然凝血酶相比具有如下序列差異的凝血酶突變蛋白質(zhì)達(dá)到此目的。
(a)Gly被Ala取代，其中Gly位于序列環(huán)境Tyr-Gly-Phe并在天然凝血酶中占據(jù)位置558(序列號(hào)NO:14)；(b)至少如下殘基中的一處被取代或缺失(b1)His，位于序列環(huán)境Ala-His-Cys中，在天然人類(lèi)凝血酶原中占據(jù)位置363(序列號(hào)NO:14)；(b2)Ser，位于序列環(huán)境Arg-Asp-Ile中，在天然人類(lèi)凝血酶原中占據(jù)位置419(序列號(hào)NO:14)；(b3)Ser，位于序列環(huán)境Asp-Ser-Gly中，在天然人類(lèi)凝血酶中占據(jù)位置241(序列號(hào)NO:14)；新的凝血酶突變蛋白質(zhì)可從來(lái)自人類(lèi)或其它哺乳動(dòng)物的已知天然凝血酶開(kāi)始制得，如靈長(zhǎng)類(lèi)，牛，豬，狗，貓，大鼠，小鼠。天然凝血酶是指具有凝血酶活性在生物體內(nèi)天然產(chǎn)生的多肽序列。
凝血酶突變蛋白質(zhì)不僅指二硫鍵連接的兩條鏈分子(A和B鏈)還指單鏈形式的分子如凝血酶原或只含B鏈或部分B鏈，優(yōu)選N-和/或C-端截短B鏈，的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明就凝血酶突變蛋白質(zhì)而言，具有結(jié)合凝血酶抑制劑的活性是非常重要的。
根據(jù)本發(fā)明凝血酶突變蛋白質(zhì)還可從已知的凝血酶蛋白水解產(chǎn)物，如β-凝血酶，γ-凝血酶，ω-凝血酶或其它凝血酶前體如凝血酶原，凝血酶中間體，或其它meizothrombins起始制得，然后它們可通過(guò)合適的剪切方法，例如利用來(lái)自Ecthis carinatus或Oxyranusscutellatus蛇毒級(jí)分因子X(jué)a轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘哪阜肿印?br> 本發(fā)明的凝血酶突變蛋白質(zhì)適用于中和水蛭素，水蛭素衍生物或其它凝血酶抑制劑。
優(yōu)選基因工程制備，其中制備合適的凝血酶突變蛋白質(zhì)基因并將此基因在適合宿主生物中表達(dá)。
新的凝血酶突變蛋白質(zhì)與天然凝血酶至少有兩處序列差別，第一個(gè)序列差別是丙氨酸殘基取代甘氨酸殘基。取代的位置取決于起始天然凝血酶的來(lái)源。而天然人類(lèi)凝血酶原中甘氨酸位置位于序列環(huán)境Tyr-Gly-Phe中且占據(jù)558位(序列號(hào)NO:14)。
序列的第二個(gè)序列差別是形成蛋白酶凝血酶催化三分體(diekatalytisch Triade)的三個(gè)位置(His,Asp,Ser)之一的氨基酸殘基的取代或缺失。天然人類(lèi)凝血酶原中這些位置是His336位，Asp419位，Ser525位。在其它的非人類(lèi)的凝血酶中，這些位置可依據(jù)分子的總長(zhǎng)度而挪動(dòng)。序列環(huán)境，即在相應(yīng)氨基酸之前或之后的氨基酸殘基，在凝血酶中是保守的，因此，在序列環(huán)境的基礎(chǔ)上可容易地確定相應(yīng)氨基酸殘基的精確位置。
根據(jù)本發(fā)明凝血酶突變蛋白質(zhì)可在催化三分體有若干個(gè)改變(刪除或取代)。優(yōu)選在催化三分體上只有一個(gè)改變的凝血酶突變蛋白質(zhì)。
優(yōu)選改變包括催化三分體中氨基酸的取代。優(yōu)選組氨酸殘基被極性或疏水性氨基酸取代，特別是由Phe,Tyr,Ala或Val。天冬氨酸殘基優(yōu)選由其它極性氨基酸如Gln或Asn取代。
特別優(yōu)選凝血酶突變蛋白質(zhì)，其中絲氨酸殘基改變，特別是絲氨酸由無(wú)羥基功能基團(tuán)的氨基酸取代，特別是與絲氨酸有相似體積的氨基酸。特別優(yōu)選由Ala取代Ser。
這些凝血酶突變蛋白質(zhì)的活性可以通過(guò)分子內(nèi)引入其它改變進(jìn)一步提高。這樣，例如，可以想象進(jìn)一步改善蛋白水解穩(wěn)定性以便，例如，使體內(nèi)作用期(die Wirkdauer)變長(zhǎng)成為可能。這是可能的，例如，用另外的非堿性氨基酸取代堿性殘基Arg393,Lys465,Arg390或Arg382(序列號(hào)NO:14)。
本發(fā)明還涉及核苷酸序列，特別是DNA序列，它編碼所述凝血酶突變蛋白質(zhì)。通過(guò)按照遺傳密碼將多肽序列回譯成相應(yīng)的DNA序列這些可很容易確定。優(yōu)選使用密碼子為在所需宿主生物中導(dǎo)致良好表達(dá)的。
核苷酸序列可通過(guò)點(diǎn)特異突變從天然凝血酶基因序列開(kāi)始或完全通過(guò)DNA合成來(lái)制備。
根據(jù)本發(fā)明的凝血酶突變蛋白質(zhì)特別適合用作凝血酶抑制劑的解毒劑，如水蛭素，水蛭素衍生物和低分子量凝血酶抑制劑。
水蛭素是最初分離自水蛭的蛋白質(zhì)，含65個(gè)氨基酸且有極高的對(duì)凝血酶的的親和力(ki=10-12mol/l)和極好選擇性。水蛭素已在動(dòng)物試驗(yàn)和人類(lèi)中顯示有活性。除最初分離的水蛭素還有幾種水蛭素突變蛋白質(zhì)和其序列與天然水蛭素相比有序列改變的異水蛭素。因此水蛭素不僅指天然水蛭素還包括相對(duì)來(lái)自醫(yī)用水蛭序列中一個(gè)或多個(gè)修飾且至少有對(duì)凝血酶同樣高的親和力的水蛭素。
水蛭素易于用基因工程的方法得到，其半衰期在人類(lèi)中約45分鐘。
也已知其中化學(xué)上的修飾改變了水蛭素的藥物動(dòng)力學(xué)的水蛭素衍生物。Markwardt描述了作用時(shí)間延長(zhǎng)的水蛭素與右旋糖苷的綴合物。EP345616,EP502962和EP557199揭示了作用時(shí)間延長(zhǎng)的聚合物綴合體。WO9515183描述了作用時(shí)間延長(zhǎng)的疏水水蛭素衍生物。儲(chǔ)存形式和作用時(shí)間延長(zhǎng)的水蛭素二聚體(WO9504823)類(lèi)似已知。進(jìn)一步的凝血酶抑制劑是所揭示的低分子量凝血酶抑制劑，例如，在EP236164,DE2801478,EP293881或EP185390中。
進(jìn)一步凝血酶抑制劑是重組二硫水蛭素，水蛭素突變蛋白質(zhì)，多聚物修飾的水蛭素如右旋糖苷-水蛭素，PEG-水蛭素，疏水水蛭素衍生物，和具有延長(zhǎng)作用期的水蛭素突變蛋白質(zhì)。新的凝血酶能進(jìn)一步用于拮抗Hirudisin，截?cái)嗟乃嗡睾蛠?lái)自水蛭素類(lèi)似物的部分序列，如hirulog或C端水蛭素多肽。中和其它的凝血酶抑制多肽也是可能的，例如所描述的來(lái)自吸血生物且基因工程制備用于治療的，如rhodniin；infestin。
能夠被中和的凝血酶抑制劑的例子也是合成的，優(yōu)選低分子量，凝血酶抑制劑如三肽D-Phe-Pro-Arg的衍生物，NAPAP的硼酸衍生物，Arginals或芐脒衍生物。本發(fā)明用作上述所有凝血酶抑制劑的解毒劑均可行。
根據(jù)本發(fā)明凝血酶突變蛋白質(zhì)對(duì)凝血酶抑制劑的中和作用優(yōu)于迄今為止所述的用于中和凝血酶抑制劑的方法。根據(jù)本發(fā)明凝血酶應(yīng)用是安全的，甚至在過(guò)量情況下，并且因此使在緊急情況下迅速而有效的中和凝血酶抑制劑成為可能。
根據(jù)本發(fā)明凝血酶突變蛋白質(zhì)以適合非腸道給藥的形式提供，即皮下，肌內(nèi)，或靜脈內(nèi)給藥。優(yōu)選靜脈內(nèi)給藥。在必要的情況下根據(jù)本發(fā)明的凝血酶突變蛋白質(zhì)也能持續(xù)浸漬(Dauerinfusion)給藥。將要給予的失活的凝血酶的數(shù)量取決于，例如過(guò)量程度，體重及所選給藥形式。過(guò)量程度可由熟練人員在給凝血酶之前或者過(guò)程中通過(guò)適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)測(cè)定。
根據(jù)本發(fā)明凝血酶突變蛋白質(zhì)可通過(guò)基因工程方法制備。優(yōu)選以基因工程制備凝血酶突變蛋白質(zhì)的前體形式(與凝血酶原類(lèi)似)，凝血酶突變蛋白質(zhì)可通過(guò)蛋白水解活化從該前體形成獲得。
另一個(gè)優(yōu)選的制備形式，尤其對(duì)于只包含B鏈的凝血酶突變蛋白質(zhì)，是根據(jù)本發(fā)明的修飾的B鏈基因在微生物中表達(dá)，優(yōu)選細(xì)菌如大腸桿菌。
必要的所得的表達(dá)產(chǎn)物必須通過(guò)熟練人員熟悉的方法復(fù)性以獲得有活性的凝血酶突變蛋白質(zhì)分子。在細(xì)菌中表達(dá)B鏈時(shí)，已發(fā)現(xiàn)用另一個(gè)氨基酸殘基，例如Ser或Ala取代Cys殘基是有利的，Cys殘基在天然人類(lèi)凝血酶中，用于形成二硫鍵。
以下實(shí)施例用于進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不限制之。
凝血酶原按照Degen等發(fā)表的方法，克隆自人類(lèi)cDNA庫(kù)(生物化學(xué)22(1983)2087-97)。
根據(jù)本發(fā)明突變蛋白質(zhì)通過(guò)在凝血酶部分中定靶基因突變制備。
實(shí)施例1制備Ala 558-凝血酶原通過(guò)定靶基因突變?nèi)祟?lèi)凝血酶原558位的編碼氨基酸甘氨酸GGC(序列號(hào)No:14)突變成編碼Ala的密碼子GCC。
序列號(hào)No.5的寡核苷酸以基因的有義方向合成，互補(bǔ)的序列號(hào)No:6的寡核苷酸以反義方向，具有適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖儭Ｐ蛄刑?hào)1的寡核苷酸按照凝血酶原基因的5’末端以有義方向合成。Eco R1限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)序列另外附加于其5’末端。序列號(hào)2的寡核苷酸依照凝血酶原基因3’末端以反義方向合成，Rco R1限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)序列加于其5’末端。
50納克人類(lèi)凝血酶原cDNA作為模板，序列號(hào)5和2的寡核苷酸每種50皮摩爾，加入2納摩爾dNTPs，聚合酶緩沖液和Pfu聚合酶(Stratagene)來(lái)進(jìn)行PCR反應(yīng)，35輪，每輪94℃1分鐘，55℃2分鐘和72℃3分鐘。相應(yīng)的，用同樣的模板和序列號(hào)6和序列號(hào)1的寡核苷酸進(jìn)行第二個(gè)PCR反應(yīng)。此法產(chǎn)生的兩種DNA片段用標(biāo)準(zhǔn)方法純化(PCR純化試劑盒，Quiagen,Hilden)。兩種片段各取0.1皮摩爾混合，95℃加熱5分鐘變性，并室溫維持1小時(shí)復(fù)性，以獲得完全的DNA雙鏈，加入2納摩爾dNTPs，聚合酶緩沖液和Pfu聚合酶進(jìn)行10輪反應(yīng)，每輪94℃1分鐘，72℃5分鐘。為擴(kuò)增全長(zhǎng)片段，加入50皮摩爾外邊的寡核苷酸序列號(hào)1和序列號(hào)2，再次加入Pfu聚合酶后，進(jìn)行35輪另一個(gè)PCR反應(yīng)，每輪94℃1分鐘，55℃2分鐘和72℃3分鐘。此法制備的558位Ala取代Gly的突變凝血酶原cDNA用標(biāo)準(zhǔn)方法純化，然后用限制性內(nèi)切酶Eco R1酶切并用標(biāo)準(zhǔn)方法以T4連接酶克隆進(jìn)也用Eco R1酶切的pUC18載體(Pharmacia Biotech Europe GmbH,Friburg)。測(cè)序驗(yàn)證DNA。
實(shí)施例2制備Ala 525,Ala 558凝血酶原進(jìn)行基因定靶突變使人類(lèi)凝血酶原525位(序列號(hào)14)的編碼Ser的密碼子AGT突變?yōu)榫幋aAla的CGT，且558位(序列號(hào)14)的編碼GLY的密碼子GGC突變?yōu)榫幋aAla的密碼子GCC。
為此，在實(shí)施例1凝血酶原突變蛋白質(zhì)DNA基礎(chǔ)上進(jìn)行PCR反應(yīng)，利用以有義方向的具有合適的525位ALA核苷酸取代的序列號(hào)3寡核苷酸及序列號(hào)2寡核苷酸(凝血酶原3’末端)。試驗(yàn)條件依照實(shí)施例1。利用與序列號(hào)3互補(bǔ)的序列號(hào)4寡核苷酸，和序列號(hào)1寡核苷酸(凝血酶原5’末端)進(jìn)行第二個(gè)PCR反應(yīng)。此法獲得的DNA片段變性，雜交，填入以提供雙鏈，并依照實(shí)施例1用外邊的寡核苷酸序列號(hào)1和序列號(hào)2進(jìn)行另一個(gè)PCR反應(yīng)。
純化用此法制備的凝血酶原突變蛋白質(zhì)cDNA，然后用Eco R1酶切，克隆進(jìn)pUC18載體，并測(cè)序驗(yàn)證。
實(shí)施例3制備Ala 363,Ala 558凝血酶原進(jìn)行基因定靶突變使人類(lèi)凝血酶原363位(序列號(hào)14)的編碼His的密碼子AGT突變?yōu)榫幋aAla的GCA，且558位(序列號(hào)14)的編碼GLY的密碼子GGC突變?yōu)锳la的密碼子GCC。
為此，在實(shí)施例1凝血酶原突變蛋白質(zhì)DNA基礎(chǔ)上進(jìn)行PCR反應(yīng)，利用以有義方向的具有合適的363位ALA核苷酸取代的序列號(hào)10寡核苷酸及序列號(hào)2寡核苷酸(3’末端凝血酶原)。試驗(yàn)條件依照實(shí)施例1。利用與序列號(hào)10互補(bǔ)的序列號(hào)11寡核苷酸，和序列號(hào)1寡核苷酸(凝血酶原5’末端)進(jìn)行第二個(gè)PCR反應(yīng)。此法獲得的DNA片段變性，雜交，填入以提供雙鏈，并依照實(shí)施例1用外邊的寡核苷酸序列號(hào)1和序列號(hào)2進(jìn)行另一個(gè)PCR反應(yīng)。
純化用此法制備的凝血酶原突變蛋白質(zhì)cDNA，然后用Eco R1酶切，克隆進(jìn)pUC18載體，并測(cè)序驗(yàn)證。
實(shí)施例4制備Asn 419,Ala 558凝血酶原進(jìn)行基因定靶突變使人類(lèi)凝血酶原419位(序列號(hào)14)的編碼Asp的密碼子GAC突變?yōu)榫幋aAsn的CGA，且558位(序列號(hào)14)的編碼GLY的密碼子GGC突變?yōu)锳LA的密碼子GCC。
為此，在實(shí)施例1凝血酶原突變蛋白質(zhì)DNA基礎(chǔ)上進(jìn)行PCR反應(yīng)，利用以有義方向的具有合適的419位ASN核苷酸取代的序列號(hào)12寡核苷酸及序列號(hào)2寡核苷酸(凝血酶原3’末端)。試驗(yàn)條件依照實(shí)施例1。利用與序列號(hào)12互補(bǔ)的序列號(hào)13寡核苷酸，和序列號(hào)1寡核苷酸(凝血酶原5’末端)進(jìn)行第二個(gè)PCR反應(yīng)。此法獲得的DNA片段變性，雜交，填入以提供雙鏈，并依照實(shí)施例1用外邊的寡核苷酸序列號(hào)1和序列號(hào)2進(jìn)行另一個(gè)PCR反應(yīng)。
純化用此法制備的凝血酶原突變蛋白質(zhì)cDNA，然后用Eco R1酶切，克隆進(jìn)pUC18載體，并測(cè)序驗(yàn)證。
實(shí)施例5制備Ala 525-凝血酶原進(jìn)行基因定靶突變使人類(lèi)凝血酶原525位(序列號(hào)14)的編碼Ser的密碼子AGT突變?yōu)榫幋aAla的GCT。
為此，在凝血酶原突變蛋白質(zhì)DNA基礎(chǔ)上進(jìn)行PCR反應(yīng)，利用以有義方向的具有合適的525位ALA核苷酸取代的序列號(hào)3寡核苷酸及序列號(hào)2寡核苷酸(凝血酶原3’末端)。利用與序列號(hào)3互補(bǔ)的序列號(hào)4寡核苷酸，和序列號(hào)1寡核苷酸(凝血酶原5’末端)進(jìn)行第二個(gè)PCR反應(yīng)。此法獲得的DNA片段變性，雜交，填平以提供雙鏈，并依照實(shí)施例1用外邊的寡核苷酸序列號(hào)1和序列號(hào)2進(jìn)行另一個(gè)PCR反應(yīng)。
純化用此法制備的凝血酶原突變蛋白質(zhì)cDNA，然后用Eeo R1酶切，克隆進(jìn)pUC18載體，并測(cè)序驗(yàn)證。
實(shí)施例6人類(lèi)凝血酶原突變蛋白質(zhì)表達(dá)載體的構(gòu)建為在CHO哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌重組表達(dá)，人類(lèi)tPA基因的分泌引導(dǎo)序列被連到突變凝血酶原cDNA的5’末端(參見(jiàn)實(shí)施例1到5)(Pennica等，自然301(1983)214-221)。從tPA cDNA開(kāi)始，利用合成寡核苷酸序列號(hào)NO:9(tPA引導(dǎo)區(qū)的5’末端和Eco R1切點(diǎn))和序列號(hào)NO:8(tPA引導(dǎo)區(qū)的3’末端，凝血酶原的5’末端)進(jìn)行PCR基礎(chǔ)上的tPA分泌引導(dǎo)cDNA擴(kuò)增。每條突變的凝血酶原突變蛋白質(zhì)片段用和序列號(hào)NO:8互補(bǔ)的寡核苷酸序列號(hào)NO:7，和序列號(hào)NO:2進(jìn)行擴(kuò)增。tPA引導(dǎo)區(qū)片段加入相關(guān)的凝血酶原突變蛋白質(zhì)片段?；旌衔镒冃?，雜交，填平以產(chǎn)生雙鏈。，相關(guān)tPA引導(dǎo)區(qū)凝血酶原突變蛋白質(zhì)DNA使用寡核苷酸序列號(hào)NO:9和NO:2通過(guò)另一PCR反應(yīng)制備。這些用Eco R1酶切，克隆入pUC18并參見(jiàn)驗(yàn)證。
為在CHO細(xì)胞中表達(dá)，這些DNA從pUC18載體中用Eco R1切出，分離并插入載體pc DNA3 neo(Invitrogen,San Diego,USA)的Eco R1剪切位點(diǎn)，凝血酶原cDNA的翻譯由載體中強(qiáng)的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子控制。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選通過(guò)位于質(zhì)粒上只允許G418-抗性克隆生長(zhǎng)的新霉素抗性基因的方法進(jìn)行。
轉(zhuǎn)染前，用于在CHO細(xì)胞中表達(dá)的適合DNA用限制性內(nèi)切酶PvuI線性化，沉淀并在無(wú)菌條件下溶于10毫摩爾Tris緩沖液(pH8.5)。
實(shí)施例7哺乳動(dòng)物細(xì)胞中凝血酶原突變蛋白質(zhì)的表達(dá)表達(dá)載體的DNA用lipofectamine(從Gibco；Life TechnologiesGmbH；Dieselstraβe 5,76334 Eggenstein，德國(guó)；NO.530-8324SA)轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)胞用CHO-Kl(ATCC CCL 61)；293(ATCC CRL1573)；2×105細(xì)胞/毫升引入6-孔培養(yǎng)板的每一孔中的3毫升培養(yǎng)基。第二天進(jìn)行轉(zhuǎn)染。為此，細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基洗一次。按照制造商Gibco(Focus 15(1993)73-78)的說(shuō)明書(shū)利用Lipofectamine進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔含1微克DNA和6微升Lipofectamine，它們被加入總量1000微升的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基。37℃孵育6小時(shí)后，蒸發(fā)掉轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，將細(xì)胞在正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(含胎牛血清，F(xiàn)CS)過(guò)夜。
實(shí)施例8凝血酶原突變蛋白質(zhì)在293細(xì)胞中的暫時(shí)表達(dá)293細(xì)胞保存在DMEM(Gibco No.41965)+10％FCS(BiowhittakerNo.14601 B)中。
轉(zhuǎn)染按上述描述進(jìn)行。這種情況下，為增加表達(dá)，以質(zhì)粒pAdVantange(來(lái)自Promega E1711號(hào))進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。0.2微克pAdVantange DNA和0.8微克在表達(dá)載體pcDNA3中的特殊凝血酶原突變蛋白質(zhì)的DNA按上述轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后第一天，蒸發(fā)掉含血清的培養(yǎng)基，并用無(wú)血清培養(yǎng)基取代(無(wú)酚紅)。轉(zhuǎn)染后第3天，移去細(xì)胞培養(yǎng)上清并存于-20℃直至測(cè)定。
實(shí)施例9凝血酶原突變蛋白質(zhì)在CHO-K1細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)按以上描述進(jìn)行轉(zhuǎn)染。CHO細(xì)胞在DMEM-F12=1∶1(GibcoNo.21331-020)+10％FCS中保存和培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后第一天，將細(xì)胞分開(kāi)以使從六孔板中的一孔分布到20-100厘米的皮氏培養(yǎng)皿上。同時(shí)，開(kāi)始用G418(來(lái)自Gibco 1200微克/毫升培養(yǎng)基中)處理篩選重組細(xì)胞。所得抗性克隆用克隆圓柱法分離，并進(jìn)一步培養(yǎng)至足夠細(xì)胞數(shù)目后檢查適當(dāng)凝血酶突變蛋白質(zhì)的表達(dá)。通過(guò)從匯合的細(xì)胞中蒸去培養(yǎng)基并用新鮮的，無(wú)血清培養(yǎng)基取代進(jìn)行。經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間，例如24小時(shí)，48小時(shí)，移去孵育細(xì)胞的培養(yǎng)上清并用ELISA檢測(cè)凝血酶原的存在。
某些情況下，通過(guò)微滴定板中分離克隆所得重組細(xì)胞以增加表達(dá)。
為了提供足量的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)上清，顯示良好表達(dá)的CHO細(xì)胞在含10％FCS的培養(yǎng)基中在不同的容器中培養(yǎng)至匯合。細(xì)胞然后用PBS清洗，用無(wú)血清DMEM-12孵育(DMEM:Gibco No.11880-028；F12:GibcoNo.21765-029:混合物包括等體積比)。用于此目的的DMEM不含酚紅。兩至三天后更換培養(yǎng)基以便收獲含凝血酶原突變蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)上清。用此法可能從一個(gè)培養(yǎng)容器中收獲達(dá)十次。結(jié)合來(lái)自不同培養(yǎng)容器中的不同收獲物以保持純化所需的合適體積。
實(shí)施例10重組凝血酶原突變蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)通過(guò)用ELISA檢查來(lái)自匯合細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清中凝血酶原的存在，或凝血酶原剪切后凝血酶活性或凝血酶抗原，來(lái)檢測(cè)表達(dá)凝血酶原并將其分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞中重組凝血酶原的存在。為此，培養(yǎng)不同時(shí)間后移去無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)上清。細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在的凝血酶原剪切用蛇毒(Sigma；cat No.V3129)來(lái)獲得。每一混合物用以下方法進(jìn)行388微升樣品(無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)上清或凝血酶原)63微升蛇毒(0.2毫克/毫升水中)50微升緩沖液(1摩爾NaCl；100毫摩爾CaCl2；200毫摩爾Tris PH7.4)100微升水剪切混合物在室溫孵育45分鐘，所得凝血酶接著在不同試驗(yàn)中表征。
實(shí)施例11用ELISA的方法檢測(cè)凝血酶原突變蛋白質(zhì)和凝血酶突變蛋白質(zhì)測(cè)定凝血酶原和凝血酶的ELISA，按以下方案所示進(jìn)行-用0.1毫升/孔抗-凝血酶抗體包被微滴定板；5微克/毫升0.05 M NaHCO3,pH9.2；16小時(shí)/4℃。
-用1％BSA/PBS飽和；0.3毫升/孔；0.5-1小時(shí)/室溫-用0.05％吐溫20/PBS洗3遍-11標(biāo)準(zhǔn)2倍稀釋人類(lèi)凝血酶(Calbiochem 605195；3.159 NIHU/毫克)，以10納克/毫升0.1％BSA/0.05％吐溫20/PBS開(kāi)始；待測(cè)定樣品平行稀釋?zhuān)?.1毫升/孔；2-4小時(shí)/室溫-如上清洗-0.1毫升/孔生物素化的抗凝血酶抗體1∶200；稀釋于0.1％BSA/0.05％吐溫20/PBS；2-4小時(shí)/室溫-如上清洗-0.1毫升/孔抗生蛋白鏈菌素-過(guò)氧化酶復(fù)合物(B.M.1089153)；1∶10000稀釋于0.1％BSA/0.05％吐溫20/PBS；30分鐘/室溫-如上清洗-0.1毫升/孔過(guò)氧化酶底物-以0.1毫升/孔2M H2SO4停止反應(yīng)-450納米處測(cè)量吸收值過(guò)氧化酶底物將0.1毫升TMB溶液(42mM TMB的DMSO溶液)與10毫升底物緩沖液混合(0.1M乙酸鈉PH 4.9)；然后加入14.7微升3％H2O2實(shí)施例12抗人類(lèi)凝血酶抗體的制備為誘導(dǎo)多克隆抗體，按如下方法免疫兔子第1天200微克人類(lèi)凝血酶于0.5毫升PBS中/完全Freund氏佐劑(Sigma F5881)第14天200微克人類(lèi)凝血酶于0.5毫升PBS中/不完全Freund氏佐劑(Sigma F5506)第28天200微克人類(lèi)凝血酶于0.5毫升PBS中/不完全Freund氏佐劑第42天200微克人類(lèi)凝血酶于0.5毫升PBS中最后一次免疫7天后，從兔耳靜脈中取血。
兔的多克隆抗體在蛋白A Sepharose上從所收集的血清中純化(如Pharmacia制備手冊(cè)規(guī)定)，產(chǎn)率為65毫克IgG/10毫升血清。生物素化前，抗體用0.05MNaHCO3PH9.0(2×21)透析，然后每600微升抗體中加入200微升生物素×NHS酯(Calbiochem 203189；1毫克/毫升水)，室溫振蕩2小時(shí)。
最后混合物用PBS透析3次。
用所得抗體構(gòu)建一個(gè)多層ELISA。
-用0.05M NaCO3，PH9.2中的5微克/毫升抗-凝血酶抗體0.1毫升/孔包被微滴定板；16小時(shí)/4℃-用1％BSA飽和；0.3毫升/孔；0.5小時(shí)/室溫-用0.05％吐溫20/PBS洗3遍-以10納克/毫升0.1％BSA/0.05％吐溫20/PBS開(kāi)始11標(biāo)準(zhǔn)2倍稀釋人類(lèi)凝血酶(Calbiochem 605195；3.159 NIH U/毫克)，待測(cè)定樣品平行稀釋?zhuān)?.1毫升/孔；2小時(shí)/室溫-如上清洗-0.1毫升/孔生物素化的抗凝血酶抗體1∶200；稀釋于0.1％BSA/0.05％吐溫20/PBS；2小時(shí)/室溫-如上清洗-0.1毫升/孔抗生蛋白鏈菌素-過(guò)氧化酶復(fù)合物(B.M.1089153)；1∶10000稀釋于0.1％BSA/0.05％吐溫20/PBS；30分鐘/室溫-如上清洗-0.1毫升/孔過(guò)氧化酶底物-以0.1毫升/孔2M H2SO4停止反應(yīng)-450納米處測(cè)量吸收值(OD)吸收值(OD)對(duì)凝血酶濃度作圖見(jiàn)

圖1.
過(guò)氧化酶底物將0.1毫升TMB溶液(42mM TMB的DMSO溶液)與10毫升底物緩沖液混合(0.1M乙酸鈉PH 4.9)；然后加入14.7微升3％H2O2.
通過(guò)ELISA檢測(cè)凝血酶原突變蛋白和凝血酶突變蛋白的存在。
檢測(cè)凝血酶原突變蛋白和凝血酶突變蛋白的的ELISA按以下所示方案進(jìn)行-用0.1毫升/孔抗-凝血酶抗體包被微滴定板；5微克/毫升0.05 M NaHCO3，pH9.2；16小時(shí)/4℃.
-用1％BSA/PBS飽和；0.3毫升/孔；0.5-1小時(shí)/室溫-用0.05％吐溫20/PBS洗3遍-11標(biāo)準(zhǔn)2倍稀釋人類(lèi)凝血酶(Calbiochem 605195；3.159 NIHU/毫克)，以10納克/毫升0.1％BSA/0.05％吐溫20/PBS開(kāi)始；待測(cè)定樣品平行稀釋?zhuān)?.1毫升/孔；2-4小時(shí)/室溫
-如上清洗-0.1毫升/孔生物素化的抗凝血酶抗體1∶200；稀釋于0.1％BSA/0.05％吐溫20/PBS；2-4小時(shí)/室溫-如上清洗-0.1毫升/孔抗生蛋白鏈菌素-過(guò)氧化酶復(fù)合物(B.M.1089153)；1∶10000稀釋于0.1％BSA/0.05％吐溫20/PBS；30分鐘/室溫-如上清洗-0.1毫升/孔過(guò)氧化酶底物-以0.1毫升/孔2M H2SO4停止反應(yīng)-450納米處測(cè)量吸收值過(guò)氧化酶底物將0.1毫升TMB溶液(42mM TMB的DMSO溶液)與10毫升底物緩沖液混合(0.1M乙酸鈉PH 4.9)；然后加入14.7微升3％H2O2實(shí)施例13a從血漿中純化人類(lèi)凝血酶人類(lèi)凝血酶原按照Henriskson所述(酶學(xué)方法，第222卷，312-3279頁(yè))從加入了檸檬酸鹽的人類(lèi)血漿中純化。凝血酶原剪切和用肝素色譜純化凝血酶，依照實(shí)施例14和15進(jìn)行。含有凝血酶的部分用S2238通過(guò)產(chǎn)色凝血酶試驗(yàn)確認(rèn)并通過(guò)超濾濃縮至1毫克/毫升，用PBS再次過(guò)濾。
用產(chǎn)色底物S2238測(cè)定凝血酶活性凝血酶突變蛋白的活性通過(guò)三肽的斷裂來(lái)測(cè)定。用于此目的的移液方案如下50微升樣品(0.5U/毫升凝血酶；或不同溶液中的剪切的凝血酶原)100微升H2O50微升S2238(1毫克/毫升水溶液；來(lái)自Chromogenix，Molndal；Sweden)。
混合物37℃孵育10-15分鐘。然后在波長(zhǎng)405納米處測(cè)定吸收，凝血酶的量從0.01至1U/毫升的校準(zhǔn)曲線上得到。
實(shí)施例13b通過(guò)陰離子交換色譜純化凝血酶原突變蛋白來(lái)自CHO細(xì)胞培養(yǎng)液的35升含凝血酶原的細(xì)胞培養(yǎng)上清通過(guò)4C(SPS 400 Memberane,Fresenius,St.Wendel)超濾首先濃縮至400毫升，然后用10mM Tris PH 7.5再濾至導(dǎo)電率為1.1mS/厘米。脫鹽濾液上Q-Sepharose FF柱(直徑5厘米，體積530毫升)，流速6毫升/分鐘，柱子以起始緩沖液沖洗(20mM Tris PH 7.5)，然后逐漸以15個(gè)柱體積梯度洗至400mMNaCl。含凝血酶原的部分通過(guò)ELISA確認(rèn)。凝血酶原突變蛋白在280mM NaCl時(shí)洗脫出。從該柱中分離到約150-200毫克蛋白。
實(shí)施例14凝血酶突變蛋白從凝血酶原中釋放在Amicon YM 30(終體積20毫升，175毫克總蛋白)中濃縮的Q-Sepharose色譜部分以2升20mMTris/HCl PH7.5,100mMNaCl透析，通過(guò)加入用于剪切的1mMCaCl2,20mMTris/HCl PH7.5調(diào)節(jié)終濃度至10mM。加入30毫克來(lái)自O(shè)xyranus scutellatus蛇的毒液，然后4℃攪拌下剪切，12小時(shí)后加入2毫升20mMEGTA溶液，PH7.5終止反應(yīng)。
實(shí)施例15通過(guò)肝素色譜純化凝血酶突變蛋白將實(shí)施例14所得的含凝血酶的剪切產(chǎn)物上肝素-Sepharose柱(14厘米×1厘米，Pharmacia)流速38厘米/小時(shí)。以20毫升20mm磷酸鈉，0.1M氯化鈉PH7.5,0.01％Pluriol F68清洗柱子后，用150毫升線性梯度洗至600mm磷酸鈉，20mM氯化鈉PH7.5,0.01％Pluriol F68.然后通過(guò)ELISA檢測(cè)凝血酶突變蛋白。突變蛋白在約400mM NaCl時(shí)洗脫出。得到30-35毫克突變蛋白，加入BSA(1毫克/毫升)后，用PBS,0.01％Pluriol F68透析，存于-20℃。
實(shí)施例16體外系統(tǒng)中水蛭素的中和用凝血酶活性試驗(yàn)檢測(cè)失活重組凝血酶對(duì)水蛭素的解毒效果，通過(guò)一起孵育水蛭素，待試驗(yàn)?zāi)竿蛔兊鞍踪|(zhì)，激活凝血酶和S-2238來(lái)進(jìn)行。此試驗(yàn)所依據(jù)的原理是失活待測(cè)凝血酶中和(或競(jìng)爭(zhēng))水蛭素，和激活凝血酶的所得高活性。
移液方案如下100微升水蛭素HL20(1.5U/毫升)或TBS PH 7.5中的0.1％BSA和100微升凝血酶突變蛋白質(zhì)(實(shí)施例2制備)在室溫前孵育5分鐘。加入50微升活化凝血酶(0.5U/毫升)后，通過(guò)加入50微升S-2238(1毫克/毫升水中；來(lái)自Chromogenix,Molndal，瑞典)開(kāi)始反應(yīng)。混合物37℃孵育15分鐘。接著，在波長(zhǎng)410納米處測(cè)定吸收，失活凝血酶突變蛋白質(zhì)中和水蛭素導(dǎo)致吸收增加(圖2)。
實(shí)施例17在狗中中和PEG-水蛭素Beagle狗(9.8-13.5公斤)以10毫克/千克的劑量接受PEG-水蛭素皮下給藥。注射PEG-水蛭素180分鐘后，實(shí)施例2中制備的凝血酶突變蛋白(Thrombinmut#3)在50分鐘內(nèi)以20克/千克的劑量靜脈輸注。血樣通過(guò)穿刺肱靜脈在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)從狗采得，在150長(zhǎng)達(dá)6小時(shí)的時(shí)間后再次采樣。通過(guò)2000g離心20分鐘從枸掾酸化的血中獲得血漿，并儲(chǔ)存于-20℃至分析。
血漿樣品中的抗凝血酶活性按Spannagel等所述測(cè)定，血凝纖溶2(1991)121-127?？鼓钚?aPTT)用Pathromtin系統(tǒng)(Behring)測(cè)定。
結(jié)果總結(jié)于圖3。鑒于對(duì)照動(dòng)物給予PEG-水蛭素后抗凝血酶活性迅速升高，在用解毒劑處理的動(dòng)物中阻止抗凝血酶活性(圖3B)的升高是可能的。解毒劑注入完成后，PEG-水蛭素血漿水平以與對(duì)照動(dòng)物可比的速率進(jìn)一步上升。定量地在aPTT中也觀察到了類(lèi)似情況(圖3A)。
序列列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)者(A)姓名BASF Aktiengesellschaft(B)街Carl-Boseh-Strasse 38(C)城市Ludwigshafen(E)國(guó)家Federal Republic of Germany(F)郵編67056(G)電話0621/6048526(H)電傳0621/6043123(I)TELEX1762175170(ⅱ)申請(qǐng)題新的凝白酶突變蛋白質(zhì)和其解毒劑應(yīng)用(ⅲ)序列數(shù)量14(ⅳ)計(jì)算機(jī)可清形式(A)介質(zhì)軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.25(EPA)(2)序列號(hào)NO:1信息(ⅰ)序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度33bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€性(ⅱ)分子類(lèi)型mRNA的cDNA(ⅲ)假說(shuō)非(ⅹⅰ)序列描述序列號(hào)NO:1:
GGGGGGGAAT TCGCCAACAC CTTCTTGGAG GAG(2)序列號(hào)NO:2信息(ⅰ)序列特點(diǎn)
(A)長(zhǎng)度33bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€性(ⅱ)分子類(lèi)型mRNA的cDNA(ⅲ)假說(shuō)非(ⅳ)反義非(ⅹⅰ)序列描述序列號(hào)NO:2GGGGGGGAAT TCCTACTCTC CAAACTGATC AAT(2)序列號(hào)NO:3信息(ⅰ)序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度40bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€性(ⅱ)分子類(lèi)型mRNA的cDNA(ⅲ)假說(shuō)非(ⅲ)反義非(ⅹⅰ)序列描述序列號(hào)NO:3GGATGCCTGT GAAGGTGACG CTGGGGGACC CTTTGTCATG(2)序列號(hào)NO:4信息(ⅰ)序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度40bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€性(ⅱ)分子類(lèi)型mRNA的cDNA(ⅲ)假說(shuō)非(ⅲ)反義非(ⅹⅰ)序列描述序列個(gè)NO:4CATGACAAAG GGTCCCCCAG CGTCACCTTC ACAGGCATCC(2)序列號(hào)NO:5信息(ⅰ)序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度40bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€性(ⅱ)分子類(lèi)型mRNA的cDNA(ⅲ)假說(shuō)非(ⅲ)反義非(ⅹⅰ)序列描述序列個(gè)NO:5GACCGGGATG GGAAATATGC CTTCTACACA CATGTGTTCC(2)序列號(hào)NO:6信息(ⅰ)序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度40bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€性(ⅱ)分子類(lèi)型mRNA的cDNA(ⅲ)假說(shuō)非(ⅲ)反義非(ⅹⅰ)序列描述序列個(gè)NO:6GGAACACATG TGTGTAGAAG GCATATTTCC CATCCCGGTC(2)序列號(hào)NO:7信息(ⅰ)序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度40bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€性(ⅱ)分子類(lèi)型mRNA的cDNA(ⅲ)假說(shuō)非(ⅲ)反義非
(ⅹⅰ)序列描述序列個(gè)NO:7TCCATGCCCG ATTCAGACGC GCCAACACCT TCTTGGAGGA(2)序列號(hào)NO:8信息(ⅰ)序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度40bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€性(ⅱ)分子類(lèi)型mRNA的cDNA(ⅲ)假說(shuō)非(ⅲ)反義非(ⅹⅰ)序列描述序列個(gè)NO:8TCCTCCAAGA AGGTGTTGGC GCGTCTGAAT CGGGCATGGA(2)序列號(hào)NO:9信息(ⅰ)序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度27bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€性(ⅱ)分子類(lèi)型mRNA的cDNA(ⅲ)假說(shuō)非(ⅲ)反義非(ⅹⅰ)序列描述序列個(gè)NO:9GGGGGGGAAT TCGTGAAGCA ATCATGG(2)序列號(hào)NO:10信息(ⅰ)序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度30bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€性(ⅱ)分子類(lèi)型mRNA的cDNA
(ⅲ)假說(shuō)非(ⅲ)反義非(ⅹⅰ)序列描述序列個(gè)NO:10CTCACCGCCG CCGCATGCCT CCTGTACCCG(2)序列號(hào)NO:11信息(ⅰ)序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度30bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€性(ⅱ)分子類(lèi)型mRNA的cDNA(ⅲ)假說(shuō)非(ⅲ)反義非(ⅹⅰ)序列描述序列個(gè)NO:11CGGGTACAGG AGGCACACGG CGGCGGTGAG(2)序列號(hào)NO:12信息(ⅰ)序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度27bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€性(ⅱ)分子類(lèi)型mRNA的cDNA(ⅲ)假說(shuō)非(ⅲ)反義非(ⅹⅰ)序列描述序列個(gè)NO:12GAACCTGGAC CGGAACATTG CCCTGAT(2)序列號(hào)NO:13信息(ⅰ)序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度27bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單
(D)拓?fù)湫途€性(ⅱ)分子類(lèi)型mRNA的cDNA(ⅲ)假說(shuō)非(ⅲ)反義非(ⅹⅰ)序列描述序列個(gè)NO:13ATCAGGGCAA TGTTCCGGTC CAGGTTC(2)序列號(hào)NO:14信息(ⅰ)序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度579aa(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€性(ⅱ)分子類(lèi)型蛋白(ⅵ)來(lái)源生物人類(lèi)(ⅹⅰ)序列描述序列NO:14Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala Leu Glu20 25 30Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala Cys Glu35 40 45Thr Ala Arg Thr Pro Arg Asp Lys Leu Ala Ala Cys Leu Glu Gly Asn50 55 60Cys Ala Glu Gly Leu Gly Thr Asn Tyr Arg Gly His Val Asn Ile Thr65 70 75 80Arg Ser Gly Ile Glu Cys Gln Leu Trp Arg Ser Arg Tyr Pro His Lys85 90 95Pro Glu Ile Asn Ser Thr Thr His Pro Gly Ala Asp Leu Gln Glu Asn100 105 110Phe Cys Arg Asn Pro Asp Ser Ser Thr Thr Gly Pro Trp Cys Tyr Thr115 120 125Thr Asp Pro Thr Val Arg Arg Gln Glu Cys Ser Ile Pro Val Cys Gly130 135 140Gln Asp Gln Val Thr Val Ala Met Thr Pro Arg Ser Glu Gly Ser Ser145 150 155 160Val Asn Leu Ser Pro Pro Leu Glu Gln Cys Val Pro Asp Arg Gly Gln165 170 175Gln Tyr Gln Gly Arg Leu Ala Val Thr Thr His Gly Leu Pro Cys Leu180 185 190Ala Trp Ala Ser Ala Gln Ala Lys Ala Leu Ser Lys His Gln Asp Phe195 200 205Asn Ser Ala Val Gln Leu Val Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Gly210 215 220Asp Glu Glu Gly Val Trp Cys Tyr Val Ala Gly Lys Pro Gly Asp Phe225 230 235 240Gly Tyr Cys Asp Leu Asn Tyr Cys Glu Glu Ala Val Glu Glu Glu Thr245 250 255Gly Asp Gly Leu Asp Glu Asp Ser Asp Arg Ala Ile Glu Gly Arg Thr260 265 270Ala Thr Ser Glu Gln Gln Thr Phe Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser275 280 285Gly Glu Ala Asp Cys Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Lys Ser Leu290 295 300Glu Asp Lys Thr Glu Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly Arg305 310 315 320Ile Val Glu Gly Ser Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser Pro Trp Gln Val325 330 335Met Leu Phe Arg Lys Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys Gly Ala Ser Leu340 345 350Ile Ser Asp Arg Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Leu Tyr Pro355 360 365Pro Trp Asp Lys Asn Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu Val Arg Ile Gly370 375 380Lys His Ser Arg Thr Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ser Met385 390 395 400Leu Glu Lys Ile Tyr Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp Arg Glu Asn Leu405 410 415Asp Arg Asp Ile Ala Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro Val Ala Phe Ser420 425 430Asp Tyr Ile His Pro Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala Ser435 440 445Leu Leu Gln Ala Gly Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn Leu450 455 460Lys Glu Thr Trp Thr Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val Leu465 470 475 480Gln Val Val Asn Leu Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp Ser485 490 495Thr Arg Ile Arg Ile Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro500 505 510Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro515 520 525Phe Val Met Lys Ser Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly Ile530 535 540Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Tyr545 550 555 550Thr His Val Phe Arg Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys Val Ile Asp Gln565 570 575Phe Gly Glu
權(quán)利要求
1．與天然凝血酶序列有以下序列區(qū)別的一種凝血酶突變蛋白質(zhì)(a)Ala取代Gly,Gly位于序列環(huán)境Tyr-Gly-Phe中，并占據(jù)天然人類(lèi)凝血酶原第558位(序列號(hào)14)；(b)下列殘基中至少一個(gè)取代或缺失(b1)位于序列環(huán)境Ala-His-Cys中，并占據(jù)天然人類(lèi)凝血酶原第363位(序列號(hào)14)的His；(b2)位于序列環(huán)境Arg-Asp-Ile中，并占據(jù)天然人類(lèi)凝血酶原第419位(序列號(hào)14)的Asp；(b3)位于序列環(huán)境Asp-Ser-Gly中，并占據(jù)天然人類(lèi)凝血酶原第525位(序列號(hào)14)的Ser；
2．權(quán)利要求1所要求的凝血酶突變蛋白質(zhì)，它與天然人類(lèi)凝血酶原(序列號(hào)14)相比有下列序列區(qū)別(序列號(hào)14)(a)558位Gly被Ala取代并(b)如下殘基中至少一處取代或缺失(b1)363位的His；(b2)419位的Asp；(b3)525為的Ser。
3．權(quán)利要求2所要求的凝血酶突變蛋白質(zhì)，其中序列區(qū)別(b)為525位的取代。
4．權(quán)利要求3所要求的凝血酶突變蛋白質(zhì)，其中序列區(qū)別(b)為Ser被Ala取代。
5．編碼權(quán)利要求1到4中任一所要求的凝血酶突變蛋白質(zhì)的核酸序列。
6．權(quán)利要求1到4中任一所要求的凝血酶突變蛋白質(zhì)治療凝血障礙的應(yīng)用。
7．權(quán)利要求6所要求的作為凝血酶抑制劑的解毒劑的應(yīng)用。
8．權(quán)利要求7所要求的作為水蛭素，水蛭素突變蛋白質(zhì)或水蛭素衍生物的解毒劑的應(yīng)用。
9．權(quán)利要求8所要求的作為聚乙二醇修飾的水蛭素衍生物的解毒劑的應(yīng)用。
10．包含權(quán)利要求1到4中任一所要求的凝血酶突變蛋白質(zhì)和藥用助劑的凝血酶抑制劑的解毒劑。
全文摘要
與天然凝血酶相比在序列上有如下不同的凝血酶突變蛋白質(zhì)(a)Ala取代Gly,Gly位于序列環(huán)境Tyr-Gly-Phe并占據(jù)天然人類(lèi)凝血酶原第558位(序列號(hào)14);(b)下列殘基中至少一個(gè)取代或缺失(b1)位于序列環(huán)境Ala-His-Cys并占據(jù)天然人類(lèi)凝血酶原第363位(序列號(hào)14)的His;(b2)位于序列環(huán)境Arg-Asp-Ile并占據(jù)天然人類(lèi)凝血酶原第419位(序列號(hào)14)的Asp;(b3)位于序列環(huán)境Asp-Ser-Gly并占據(jù)天然人類(lèi)凝血酶原第525位(序列號(hào)14)的Ser;用作解毒劑。
文檔編號(hào)A61P7/00GK1211280SQ97192210
公開(kāi)日1999年3月17日 申請(qǐng)日期1997年2月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月12日
發(fā)明者M·拉迪施, T·弗里德里希, C·波爾施維勒, M·施密德特, H·W·黑夫肯, J·施維登, K·呂布薩門(mén) 申請(qǐng)人:Basf公司