專利名稱：重組人肝細(xì)胞生成素的生產(chǎn)方法及其治療嚴(yán)重肝病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程產(chǎn)品的生產(chǎn)方法及用途領(lǐng)域，更具體地說為一種重組人肝細(xì)胞生成素(rHPO)的生產(chǎn)方法及產(chǎn)品在臨床上的治療作用。
肝臟是機(jī)體具有強(qiáng)大再生能力的臟器，有關(guān)其調(diào)控機(jī)理的研究國際上已進(jìn)行百余年，但目前已知的肝再生相關(guān)生長因子如肝細(xì)胞生長因子(HGF)，轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)等，其作用均缺乏肝特異性，難以解釋具有器官特異性的肝再生調(diào)控機(jī)理，因此，尋找新型肝再生調(diào)控因子一直是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。1975年，LaBrecque等首先報(bào)道大鼠再生肝組織中含有一種具熱穩(wěn)定性的促肝增殖因子。80年代中期，我們在人胎肝組織中也發(fā)現(xiàn)同類因子，并對其生物活性、理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)純化及臨床應(yīng)用進(jìn)行了系統(tǒng)研究。由于此類因子應(yīng)用臨床治療嚴(yán)重肝病取得較好療效，因而倍受重視，國內(nèi)外多家實(shí)驗(yàn)室一直致力于此類因子的分子克隆。1995年，我們利用功能篩選法從人胎肝cDNA文庫中分離到人肝細(xì)胞生長素cDNA，完成其核苷酸序列測定并通過構(gòu)建真核、原核表達(dá)質(zhì)粒，對其生物學(xué)活性進(jìn)行了研究，證實(shí)該基因表達(dá)產(chǎn)物在體內(nèi)能刺激肝細(xì)胞增殖，并于1996年3月申請中國發(fā)明專利，申請?zhí)枮?6103203.0。但至今尚未見國內(nèi)外有關(guān)人肝細(xì)胞生成素高效表達(dá)及獲取重組人肝細(xì)胞生成素的系統(tǒng)工藝報(bào)道。近年，國內(nèi)在臨床上應(yīng)用從乳豬肝、新生小牛肝提取的促肝細(xì)胞增殖活性因子治療嚴(yán)重肝病，取得滿意療效，但受材料來源、產(chǎn)品純度、種族差異等限制，其應(yīng)用受到較大限制。重組人肝細(xì)胞生成素的生產(chǎn)克服了這些限制，有望為臨床提供有效的治療嚴(yán)重肝病的藥物。
本發(fā)明的目的是通過原核表達(dá)、純化獲取具有生物活性的重組人肝細(xì)胞生成素及用于臨床上治療嚴(yán)重肝病。
本發(fā)明其主要內(nèi)容是在獲取人肝細(xì)胞生成素cDNA并成功構(gòu)建高效表達(dá)菌株的基礎(chǔ)上，建立了一整套工程菌誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體的分離和裂解、蛋白質(zhì)純化和復(fù)性工藝，以獲得重組人肝細(xì)胞生成素純品，并對重組人肝細(xì)胞生成素的生物學(xué)性能進(jìn)行了描述，表明重組人肝細(xì)胞生成素有在臨床上治療嚴(yán)重肝病的用途。
本發(fā)明在自行克隆人肝細(xì)胞生成素cDNA并成功構(gòu)建高效表達(dá)菌株的基礎(chǔ)上；建立并優(yōu)化了一整套工程菌發(fā)酵、包涵體的分離和裂解、蛋白質(zhì)純化和復(fù)性工藝，其特征為1)對工程菌低密度發(fā)酵，其最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為細(xì)胞密度OD600＝0.3-0.4；2)包涵體變性劑是8M尿素或用0.05mol/L NH4AC緩沖液配制的含1％巰基乙醇的7mol/L鹽酸胍；3)采用復(fù)性溶液(2mol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L還原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HCl pH8.0)或稀釋復(fù)性溶液(100mmol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L還原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HCl pH8.0)進(jìn)行復(fù)性；4)柱層析純化可采用復(fù)性蛋白的柱層析純化或包涵體在變性條件下進(jìn)行柱層析純化，其流程如圖3；其中sp-FF柱上樣后乙酸鈉緩沖液洗脫未結(jié)合相、用300mmol/LNacl階段洗脫rHPO在第一峰；DEAE-Sepharose FF(Pharmacia)陰離子交換柱用50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液洗脫未結(jié)合相。用350mmol/L NaCl階段洗脫，rHPO在第一峰；5)柱層析純化可采用包涵體在變性條件下進(jìn)行柱層析純化，其流程如圖4；其中AcA44凝腔過濾柱層析上樣后用2mol/L鹽酸胍洗脫，rHPO在第二峰中；MONO Q離子交換層析上樣后用0.05mol/L NaCl(0.05mol/L NH4Ac配制)將rHPO洗脫下來，rHPO在主峰中；通過該方法獲得人肝細(xì)胞生成素純品，純度達(dá)99％，其N-端氨基酸序列(圖2)測定與依據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列(圖1)一致；人肝細(xì)胞生成素等電點(diǎn)為7.2，分子量為15280道爾頓；在體外能促進(jìn)原代培養(yǎng)肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞的增殖，在體內(nèi)能促進(jìn)CCL4致?lián)p肝細(xì)胞DNA合成，并能顯著提高CCL4誘導(dǎo)肝功能衰竭大鼠存活率，因而提示重組人肝細(xì)胞生成素能應(yīng)用臨床治療嚴(yán)重肝病。
結(jié)合


本發(fā)明的具體實(shí)施方法如下圖1為依據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)的rHPO氨基酸序列圖2為測定的人rHPO N-端氨基酸序列圖3為本發(fā)明的工藝流程4為本發(fā)明實(shí)施例二的工藝流程圖5為工程菌誘導(dǎo)表達(dá)水平的SDS-PAGE檢測結(jié)果圖6為rHPO純化產(chǎn)物SDS-PAGE結(jié)果圖中從左至右分別為蛋白標(biāo)準(zhǔn)、全菌裂解液、純化HPO實(shí)施例一一、本實(shí)施例的技術(shù)要點(diǎn)1.細(xì)菌發(fā)酵為低密度高表達(dá)2.包涵體變性劑為尿素3.包涵體復(fù)性后再進(jìn)行柱層析純化(兩步法)4.包涵體變性條件下進(jìn)行柱層析純化(一步法)二、實(shí)施例實(shí)驗(yàn)操作步驟(圖3)1.工程菌種重組pBV-rHPO-1/JM109本室構(gòu)建。從4℃保存的工程菌平皿中挑取單菌落接種于5ml LB培養(yǎng)液試管中(含氨芐青霉素100ug/ml)，30℃、200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后，按5％比例接種于搖瓶中(含氨芐青霉素100ug/ml)30℃、200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后可作為種子液。
2.發(fā)酵 以2％濃度將種子液接種于500ml LB培養(yǎng)液中(含氨芐青霉素100ug/ml，pH7.2)，30℃、200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)3-5小時(shí)。待其菌密度達(dá)到OD600＝0.3-0.4時(shí)，迅速升高溫度至42℃誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)。離心收集細(xì)菌、電泳鑒定目的蛋白表達(dá)含量。濕菌收獲量約5g/L。5升發(fā)酵罐發(fā)酵條件為通氣量2L/min，溶解氧50％(DO調(diào)節(jié))，攪拌速度300-600轉(zhuǎn)/分，每次LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素100ug/ml，pH7.2)投料量4升。種子液濃度2％，生長溫度30℃，待其菌密度達(dá)到OD600＝0.3-0.4時(shí)，升高溫度至42℃誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)。離心收集細(xì)菌、電泳鑒定目的蛋白表達(dá)含量(圖5)。濕菌收獲量約5g/L。
3.細(xì)菌細(xì)胞裂解4℃ 3,000rpm離心30分鐘，棄去上清。稱量細(xì)菌濕重量，按10g菌/100ml的濃度加裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA，1mg/ml)溶菌酶，0℃作用30分鐘。然后冰浴超聲30-45秒，間歇2分鐘，共超聲三次。超聲完畢，4℃ 8,000rpm離心30分鐘，棄去上清，收集包涵體。以100mmol/L Tris-HClpH8.0洗滌一次。
4.包涵體洗滌和純化(1)以0.5％ Triton X-100(100mmol/L Tris-HCl pH8.0配制)重懸沉淀(20g/100ml)，室溫?cái)嚢?0分鐘。10,000rpm，離心30分鐘，棄去上清。沉淀用100mmol/L Tris-HCl pH8.0洗滌一次，稱重；(2)以2mol/L NaCl(100mmol/L Tri-HCl pH8.0配制)重懸步驟(1)沉淀(20g/100ml)，室溫?cái)嚢?20分鐘，10,000rpm，離心30分鐘，棄去上清。沉淀用100mmol/L Tris-HCl pH8.0洗滌一次，稱重；(3)以4mol/L尿素(100mmol/L Tris-HCl pH8.0配制)重懸步驟(2)沉淀(20g/100ml)，室溫?cái)嚢?0分鐘。10,000rpm，離心30分鐘，棄去上清。沉淀用100mmol/L Tris-HClpH8.0洗滌一次，稱重。
5.包涵體裂解采用8mol/L尿素裂解已純化的包涵體。8mol/L尿素(100mmol/L Tris-HClpH8.0配制)，0.5-1％巰基乙醇重懸純化的包涵體(20-30g/100ml)，室溫?cái)嚢柽^夜。10,000rpm離心30分鐘，上清即為包涵體裂解溶液，溶液應(yīng)為清亮透明、淡黃色。沉淀可用8mol/L尿素再萃取一次。
6.包涵體復(fù)性(1)2mol/L尿素復(fù)性步驟5，包涵體裂解液，用100mmol/L Tris，pH8.0，將尿素由8mol/L稀釋至2mol/L，同時(shí)調(diào)節(jié)總蛋白量不超過500ug/ml。并在此復(fù)性體系中加入終濃度0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽和終濃度1mmol/L還原型谷胱甘肽。4℃復(fù)性8-10小時(shí)。復(fù)性后溶液應(yīng)清亮透明無沉淀。用100mmol/L Tris-HClpH8.0緩沖液(含氧化還原體系)多次透析除去尿素，每次尿素濃度降低25％。
(2)稀釋復(fù)性方法 將變性蛋白液逐滴加入復(fù)性溶液中(100mol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L還原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HClpH8.0)。總蛋白量不超過1mg/mg充分復(fù)性后，離心去除沉淀，經(jīng)Millipore濃縮儀(分子量截留5000)濃縮，再經(jīng)100mmol/L Tris-HCl pH8.0緩)中液充分透析，去除殘留尿素。
7.復(fù)性蛋白的柱層析純化(1)強(qiáng)陽離子交換層析結(jié)合分子篩層析法 選用丙磺基-瓊脂糖強(qiáng)陽離子快流速交換柱(SP-FF Pharmacia)。用pH5.5 50mmol/L乙酸鈉緩沖液平衡SP-FF柱(2.620cm)。包涵體復(fù)性液在乙酸鈉緩沖液中充分透析后上樣。每次上樣10ml(1mg/ml)。乙酸鈉緩沖液洗脫未結(jié)合相。用300mmol/L NaCl階段洗脫，280nm檢測洗脫蛋白峰，SDS-PAGE鑒定各峰蛋白分布情況，rHPO在第一峰。將以上第一峰樣品用50mmol/L Tris-HCl pH8.0充分透析除去NaCl后上樣于50mmol/L Tris-HCl pH8.0平衡的Sephacryl S-100快速柱(802.6cm)，280nm檢測洗脫蛋白峰，SDS-PAGE鑒定各峰蛋白分布情況。rhHPO在主峰中。
(2)陰離子交換層析結(jié)合分子篩層析法 選用DEAE-Sepharose FF(Pharmacia)陰離子交換柱。柱先用50mmol/L Tris-HCl pH8.0流洗平衡。包涵體復(fù)性液直接上樣，上樣濃度1mg/ml，體積15ml。50mmol/L Tris-HClpH8.0緩沖液洗脫未結(jié)合相。用350mmol/L NaCl階段洗脫，280nm檢測洗脫蛋白峰，SDS-PAGE鑒定各峰蛋白分布情況，rHPO-I在第一峰。
將以上第一峰樣品用50mmol/L Tris-HCl pH8.0充分透析除去NaCl后上樣于50mmol/L Tris-HCl pH8.0平衡的Sephacryl S-100快速柱(802.6cm)，280nm檢測洗脫蛋白峰，SDS-PAGE鑒定各峰蛋白分布情況。rHPO在最后主峰中。
(3)包涵體裂解液在變性狀態(tài)下的分子篩層析法Sephacryl S-100快速柱(802.6cm)。8mol/L尿素變性包涵體樣品直接上樣于經(jīng)8mol/L尿素(100mM Tris-HCl pH8.0)平衡后的柱。280nm檢測洗脫蛋白峰，SDS-PAGE鑒定各峰蛋白分布情況，r HPO在最后峰。
實(shí)施例二.
一、本實(shí)施例的技術(shù)要點(diǎn)1.細(xì)菌發(fā)酵為低密度高表達(dá)2.包涵體變性劑為鹽酸胍3.包涵體在變性條件下進(jìn)行柱層析純化，目的蛋白復(fù)性后再進(jìn)行第二步柱層析純化二.本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)操作步驟(圖4)1.細(xì)菌發(fā)酵 與實(shí)施例1相同2.細(xì)菌細(xì)胞裂解 與實(shí)施例1相同3.包涵體洗滌和純化 與實(shí)施例1相同4.包涵體裂解 洗滌后的包涵體用0.05mol/L NH4Ac緩沖液配制的含1％巰基乙醇的7mol/L鹽酸胍裂解，8,000rpm離心10分鐘，回收裂解上清，將此上清用于下述純化。
5.AcA44凝膠過濾柱層析 用2mol/L鹽酸胍(0.05mol/L NH4Ac配制)平衡的AcA44凝膠過濾柱(1.6×80cm)。將步驟4裂解上清 上此凝膠柱，每次上樣量為3ml。然后用2mol/L鹽酸胍洗脫，280nm檢測洗脫蛋白峰。SDS-PAGE檢查各峰中的蛋白，rHPD在第二峰中。
6.rHPO的復(fù)性 將步驟5得到的rHPO樣品，用2mol/L鹽酸胍調(diào)至蛋白濃度低于500ug/ml，然后用0.05mol/L NH4Ac作10倍稀釋，并向稀釋后的樣品溶液中加還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，使其終濃度分別為1mmol/L和0.2mmol/L。稀釋后的樣品置4℃的層析柜中過夜。此日，將此稀釋樣品對0.05mol/L NH4Ac充分透析。然后將透析后的樣品離心，上清即為復(fù)性后的rHPO樣品。
7.MONO Q離子交換層析 將復(fù)性后的rHPO樣品流經(jīng)0.05mol/L NH4Ac平衡的Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱(1.6×10cm)，用同樣的緩沖液洗脫未結(jié)合蛋白。再用0.05mol/L NaCl(0.05mol/L NH4Ac配制)將rHPO洗脫下來。經(jīng)SDS-PAGE鑒定rHPO在主峰中。rHPO純化產(chǎn)物SDS-PAGE結(jié)果見圖6。測定的人肝細(xì)胞生成素N- 端氨基酸序列見圖2。等電點(diǎn)為7.2，分子量為15280道爾頓。實(shí)施例三一、本實(shí)施例的技術(shù)要點(diǎn)1.rHPO促原代培養(yǎng)肝細(xì)胞及HTC肝癌細(xì)胞DNA合成2.rHPO體內(nèi)促肝細(xì)胞DNA合成二、本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)操作步驟1.體內(nèi)促肝細(xì)胞增殖活性測定 以原代肝細(xì)胞及HTC肝癌細(xì)胞為體外生物活性檢測靶細(xì)胞。肝細(xì)胞的分離采用Seglaen的方法。Wistar大鼠禁食過夜，自由飲水。早900-1100行手術(shù)分離肝細(xì)胞。用0.4％戊巴比妥腹腔給藥麻醉，75％酒精浸泡全身，通過肝門靜脈用無鈣PBS罐流5分鐘，改用事先預(yù)熱37℃的0.06％膠原酶液，以10ml/min的速度罐流，同時(shí)將肝與周圍組織分離，移至平皿繼續(xù)罐流，剝離肝包膜，輕輕抖落肝實(shí)質(zhì)部分，去除血管、脂肪后，過200目銅網(wǎng)及紗布過濾細(xì)胞，用PBS沖洗三次。調(diào)整細(xì)胞濃度6×106/ml，取100ul接種96孔培養(yǎng)板，以含5％胎牛血清的1640培培養(yǎng)液于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)12h，加入純化的rHPO(濃度4-10ug/ml)。同時(shí)以胰島素、人胎肝肝臟刺激物為陽性對照，JM109轉(zhuǎn)染PBV220空質(zhì)粒全菌裂解液(4-10ug/ml)為對照。連續(xù)培養(yǎng)24h每孔加入1.85×104Bq3H-TdR。3h后胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞并進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)。刺激活性以刺激指數(shù)表示。刺激指數(shù)＝實(shí)驗(yàn)組cpm/至白組cpm。
取HTC細(xì)胞懸液(4×105/ml)100ul，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，以含5％小牛血清的1640培養(yǎng)液在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)6h后，加入待測樣品(每樣四孔)，繼續(xù)培養(yǎng)20h，每孔加1.85×104Bq3H-TdR，3h后，收集細(xì)胞于濾紙，并進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)，活性以cpm值表示。結(jié)果表明提純r(jià)HPO在體外能促進(jìn)原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞及HTC肝癌細(xì)胞DNA合成。
2.rHPO體內(nèi)促肝細(xì)胞DNA合成 采用大鼠1/3肝部分切除模型進(jìn)行。按Higgins和Anderson介紹的方法建立鼠1/3肝葉切除模型。Wistar大白鼠行1/3肝葉切除術(shù)，術(shù)后立即腹腔注射rHPO(0.1mg/mI)1ml，同時(shí)設(shè)生理鹽水及荷空質(zhì)粒受體菌裂解液(0.1mg/ml)對照組；20h后按100u ci/kg體重腹腔注射3H-TdR，2h后，處死大鼠于肝固定部位取肝組織，按Morley(6)介紹的方法進(jìn)行DNA提取及3H-TdR摻入計(jì)數(shù)，結(jié)果以cpm/ug DMA計(jì)算.結(jié)果表明rHPO在體內(nèi)能促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。實(shí)例四一、本實(shí)施例的技術(shù)要點(diǎn)rHPO抗肝損傷活性二、本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)操作步驟1.體外CCl4肝損傷模型的建立 按Seglaen介紹的原位灌注法分離Balb/c小鼠肝細(xì)胞。分離的細(xì)胞用含10％小牛血清，10-9mol/L胰島素及含青霉素，鏈霉素的1640培養(yǎng)液懸浮，按每孔100ul(細(xì)胞數(shù)3×104)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)10小時(shí)后，換含5mM CCl4，10％小牛血清及不同濃度rHPO的1640培養(yǎng)液，分別于換液后不同時(shí)間進(jìn)行LDH釋放實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞存活狀態(tài)觀察。
2.LDH釋放實(shí)驗(yàn) 于換液后不同時(shí)間收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，按Cytox96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay操作指南進(jìn)行測定。
LDH釋放率＝實(shí)際釋放數(shù)-自然釋放數(shù)/最大釋放數(shù)-自然釋放數(shù)3.細(xì)胞存活狀況 采用MTS法評價(jià)肝細(xì)胞存活狀況。每組4孔，共三次實(shí)驗(yàn)，用酶聯(lián)檢測儀檢測各孔490nm OD值。
4.體內(nèi)肝損傷模型的建立首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，依據(jù)病死率、病理改變等確定4ml/kg(1體積CCl4∶1體積豆油)為最佳致死劑量，2ml/kg為最佳致傷劑量。取40只小鼠分別一次性每只腹腔注射CCl4(4ml/kg)，4h后隨機(jī)分組，每組20只，治療組每12小時(shí)腹腔注射rHPO 40ug，同時(shí)設(shè)生理鹽水對照組，每日記錄動物死亡情況，存活超過96h計(jì)為存活動物。共進(jìn)行3批實(shí)驗(yàn)，以觀察rHPO對CCl4中毒肝衰竭動物的救治作用。
取18只小鼠，按2ml/Kg腹腔注射CCl4，4小時(shí)后隨機(jī)分為3組，1組靜脈注射rHPO 10ug；2組靜脈注射rHPO 40ug； 3組靜脈注射生理鹽水；每12小時(shí)注射一次，中毒后48小時(shí)，進(jìn)行DNA增殖測定，同時(shí)取外周血清測定ALT、LDH水平；取肝組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。
5.DNA增殖測定 以5-氟尿嘧啶標(biāo)記法進(jìn)行肝細(xì)胞增殖檢測。主要過程最后一次注射rHPO后12小時(shí)，按1.0ml/Kg腹腔注射標(biāo)記液，2小時(shí)后活殺動物，于肝固定部位取肝組織于甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，二甲苯脫蠟，系列酒精脫水后，切片以PBS液洗滌三次，抗5-氟尿嘧啶單克隆抗體室溫孵育60分鐘，PBS洗滌二次，切片以過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG室溫孵育30分鐘，洗滌三次后，顯色10min，脫水、透明、封片，顯微鏡下隨機(jī)挑出5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。
6.病理學(xué)檢查 于肝右葉固定部位取肝組織置10％甲醛溶液，常規(guī)石蠟切片，病理檢查。
7.結(jié)果 為觀察rHPO在體外是否對CCl4損傷肝細(xì)胞有保護(hù)作用，我們在原代培養(yǎng)肝細(xì)胞體系中加入5mMol/L CCl4模擬體內(nèi)肝損傷情況，并選擇LDH釋放及肝細(xì)胞存活狀況為指標(biāo)進(jìn)行了觀察。如所示，rHPO對正常肝細(xì)胞LDH釋放無明顯影響，但具有明顯抑制CCl4誘導(dǎo)損傷的肝細(xì)胞LDH的釋放，這種作用在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均存在且具有劑量效應(yīng)正相關(guān)。為較客觀評價(jià)CCl4致?lián)p后培養(yǎng)肝細(xì)胞的存活狀況，以MTS法檢測之。在含5Mol/L CCl4條件下，培養(yǎng)24h后細(xì)胞存活數(shù)明顯下降，但rHPO組存活數(shù)均高于對照組(p＜0.05)。
以4ml/Kg劑量CCl4，成功誘導(dǎo)小鼠發(fā)生肝功能衰竭，生理鹽水組存活率為10％，rHPO治療組為30％，兩組差別顯著(p＜0.01)；以2ml/Kg劑量CCl4誘導(dǎo)小鼠發(fā)生實(shí)驗(yàn)性肝炎，并以rHPO(10ug、40ug)和生理鹽水進(jìn)行治療，損傷后48h，兩組動物外周血ALT、LDH水平均明顯升高，但rHPO治療組水平較對照組降低，其中40ug組LDH水平降低34％，ALT水平降低38.3％；光鏡下病理學(xué)檢查顯示未治療組肝細(xì)胞廣泛腫脹、變性，中央靜脈周圍可見多處壞死，10ug治療組與未治療組比較無明顯差別，但40ug治療組變性及壞死均較未治療組明顯減輕；免疫組化檢測CCl4誘導(dǎo)肝損傷后肝細(xì)胞DNA合成狀況。表明rHPO-I具有促進(jìn)DNA合成的作用，其中10ug組標(biāo)記細(xì)胞較對照增加1.7倍，40ug組增加4.7倍。表明rHPO具有阻止肝細(xì)胞壞死，促進(jìn)肝細(xì)胞再生的作用。
總之，本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)rHPO的方法，包括工程菌誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體的分離和裂解、蛋白質(zhì)純化和復(fù)性等系列工藝，并提供了生產(chǎn)產(chǎn)物的理化性質(zhì)、生物活性檢測方法。
本發(fā)明的純化產(chǎn)物可做為一種抗原，用于免疫動物以制備相應(yīng)抗體，也可作為一種試劑，用于固體組織、液體標(biāo)本的檢測；該產(chǎn)品還可望應(yīng)用臨床治療嚴(yán)重肝病(如急性肝功能衰竭)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)重組人肝細(xì)胞生成素(rHPO，原名肝增殖素)的生產(chǎn)方法及其治療嚴(yán)重肝病的用途，包括工程菌發(fā)酵、包涵體的分離裂解、蛋白質(zhì)純化和復(fù)性工藝及表達(dá)產(chǎn)物的生物活性；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征為對工程菌低密度發(fā)酵，其最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為細(xì)胞密度OD600＝0.3-0.4時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征為包涵體變性劑可以是用0.1MTris，pH8.0緩沖液配制的8M尿素或用0.05mol/L NH4AC緩沖液配制的含1％巰基乙醇的7mol/L鹽酸胍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征為采用復(fù)性溶液，其組份可以為2mol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L還原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HCl pH8.0或稀釋復(fù)性溶液，其組份可以為100mmol/L尿素、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mol/L還原型谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征為柱層析純化可采用復(fù)性蛋白的柱層析純化，其流程如圖3，其中SP-FF陽離子交換柱上樣后乙酸鈉緩沖液洗脫未結(jié)合相，用300mmol/L NaCl階段洗脫，rHPO在第一峰；DEAE-Sepharose FF(Pharmacia)陰離子交換柱用50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液洗脫未結(jié)合相，用350mmol/L NaCl階段洗脫，rHPO在第一峰。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征為柱層析純化可采用包涵體在變性條件下進(jìn)行柱層析純化，其流程如圖4；其中AcA44凝膠過濾柱層析上樣后用2mol/L鹽酸胍洗脫，rHPO在第二峰中；MONO Q離子交換層析上樣后用0.05mol/LNaCl(0.05mol/L NH4Ac配制)將rHPO洗脫下來，rHPO在主峰中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，生產(chǎn)的rHPO具有以下生物學(xué)特性具有附圖1氨基酸序列；等電點(diǎn)為7.2，分子量為15280道爾頓；在體外能促進(jìn)原代培養(yǎng)肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞的增殖，在體內(nèi)能促進(jìn)1/3肝部分切除后及CCl4致?lián)p后大鼠肝細(xì)胞DNA合成，并能顯著提高CCCL4誘導(dǎo)肝功能衰竭大鼠存活率。
全文摘要
本發(fā)明為重組人肝細(xì)胞生成素(rHPO)的生產(chǎn)方法及其治療嚴(yán)重肝病的用途;屬生物產(chǎn)品生產(chǎn)方法及用途領(lǐng)域。在獲取hHPOcDNA并成功構(gòu)建高效表達(dá)菌株的基礎(chǔ)上,建立了一整套工程菌誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體的分離和裂解、蛋白質(zhì)純化和復(fù)性工藝,以獲得重組人肝細(xì)胞生成素純品;其生物特征為等電點(diǎn)7.2,分子量15280道爾頓;在體外能促進(jìn)原代培養(yǎng)肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞的增殖,在體內(nèi)能促進(jìn)1/3肝部分切除后及CCl
文檔編號A61K38/16GK1194308SQ9710193
公開日1998年9月30日 申請日期1997年3月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月21日
發(fā)明者賀福初, 楊曉明, 何浩, 王清明, 魏漢東, 李志紅, 陳惠鵬, 吳祖澤 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所