專利名稱：海藻酸鈉硫酸酯及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新化合物—海藻酸鈉硫酸酯及其制備方法和用途，它屬于再生資源化學生物學領域，也屬于有機化學領域。
背景技術：
肝素是一種抗凝血藥物，已使用50多年(Crafoord，C.；Jorpes E.1941，JAMA 1162831)。它是一種線性多糖，主鏈主要是由α-D-氨基葡萄糖和α-L-艾杜糖醛酸組成的二糖重復單元構成，包含一些硫酸酯基和羧基(Paulo，A.S.M.；Mariana，S.P.，1999，TCM，9(8)，227～232)。但由于來源不足，價格非常昂貴。海藻酸鈉是從褐藻里面提出的一種多糖，來源廣，價格便宜，廣泛用于藥物緩釋體系中微球，微囊及片劑等制備，具有長效緩釋作用，并能減小某些藥物的副作用(Kaneko，K.；Kanada，K.；Miyagi，M.；et al.，1998，Chem.Pharm.Bull Tokyo 46(2)，728)。海藻酸鈉是唯一在每個糖單元中都包含羧基的天然多糖，由1，4-β-D-甘露糖醛和α-L-古洛糖醛酸組成的二糖重復單元構成(Ikeda，A.；Takemura，A.；Ono，H.，2000，Carbohydr.Polym.42，421)。經(jīng)過硫酸酯化后，同肝素一樣分子中既含有硫酸酯基，又含有羧基，具有與肝素非常相似的結構。因而具備抗凝血活性，有望取代肝素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具備抗凝血活性的新化合物—海藻酸鈉硫酸酯及其制備方法和用途。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術措施如下海藻酸鈉硫酸酯，其結構式為 其中R1，R2，R3，R4為SO3Na或H，每糖醛酸單元SO3Na取代度為0.41～1.71；m，n，g，h為整數(shù)，15＜m+n+g+h＜40。
本發(fā)明還提供了上述海藻酸鈉硫酸酯的制備方法將海藻酸鈉加入硫酸酯化試劑中，在40～70℃攪拌反應，得到棕紅色溶液，經(jīng)過透析，濃縮即得海藻酸鈉硫酸酯；所述的硫酸酯化試劑由體積比為75～85％的溶劑、5～30％的絡合劑和10～30％的ClSO3H組成，溶劑為甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜，絡合劑為甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、吡啶等含烷基的有機胺類化合物。其中ClSO3H的用量最好為20～25％(體積比)。
硫酸酯化試劑按下法制備，在0～5℃，緩慢滴加ClSO3H于無水溶劑和絡合劑的混合液中，得乳白色粘稠液體，即為硫酸酯化試劑。
將得到的海藻酸鈉硫酸酯進行體外凝血實驗，表現(xiàn)出很高的抗凝血活性?？勺鳛榭鼓獎┰谥苽淇鼓幬镏袘?。
本發(fā)明進行的體外凝血實驗包括活化部分凝血活酶時間(APTT)測試，凝血酶時間(TT)測試，凝血酶原時間(PT)測試。測試時以貧血小板人血漿為底物，加入測試試劑和不同濃度的海藻酸鈉硫酸酯，得到其對APTT，TT，PT的延長效果，即可知道其抗凝血活性的高低。
本發(fā)明有以下技術特點和優(yōu)點1.為國內(nèi)外首次提出海藻酸鈉經(jīng)硫酸酯制備硫酸酯化海藻酸鈉的方法。
2.利用海藻酸鈉硫酸酯作為抗凝血劑，進行體外凝血實驗，表現(xiàn)出很高的抗凝血活性。
在相同濃度下其APTT值達到肝素的水平。據(jù)報導肝素在10μg/mL時，APTT為226s(Hirano，S.，Tanaka，Y.，Hasegawa，M.，et al.，1985，Carbohydr.Res.，137，205)。當海藻酸鈉硫酸酯的濃度從33μg/mL上升到67μg/mL，APTT為455s上升到～24min。
具體實施例方式
下面結合實施例，對本發(fā)明技術作進一步詳述。
實施例110g海藻酸鈉加入含有80ml甲酰胺和20mlClSO3H的硫酸酯化試劑中，60℃攪拌4小時，得到棕紅色溶液，加入適量去離子水，透析3d，溶溶縮至干即得硫酸酯化海藻酸鈉15g。樣品S％為13.21％，C％，H％分別為21.05％和1.93％。計算硫酸酯基團取代度為1.41/糖醛酸單元(假設硫酸酯基和羧基均形成鈉鹽)。紅外檢測出現(xiàn)1250cm-1和800cm-1的硫酸酯基團振動峰。滲透凝膠色譜測試其保留時間為7.51分鐘，測試條件為凝膠柱TSKG3000-PW，流動相0.1mol/L NaCl水溶液，流速1.0mL/min，柱溫30℃，折射率檢出樣品。樣品濃度0.4％，通過TOSOH公司提供的Pullulan標樣進行校正，所有數(shù)據(jù)均通過江申色譜工作站進行處理。
所用硫酸酯化試劑按下法制備(下同)，在0～5℃，緩慢滴加ClSO3H于無水溶劑和絡合劑的混合液中，得乳白色粘稠液體，即為硫酸酯化試劑。
實施例210g海藻酸鈉加入含有80ml甲酰胺和4mlClSO3H的硫酸酯化試劑中，40℃攪拌4小時，得到棕紅色溶液，加入適量去離子水，透析3d，溶溶縮至干即得硫酸酯化海藻酸鈉12g。樣品S％為5.69％，C％，H％分別為30.78％和3.03％。計算硫酸酯基團取代度為0.41/糖醛酸單元(假設硫酸酯基和羧基均形成鈉鹽)。紅外檢測出現(xiàn)1250cm-1和800cm-1的硫酸酯基團振動峰。滲透凝膠色譜測試其保留時間為7.21分鐘，測試條件為凝膠柱TSKG3000-PW，流動相0.1mol/L NaCl水溶液，流速1.0mL/min，柱溫30℃，折射率檢出樣品。樣品濃度0.4％，通過TOSOH公司提供的Pullulan標樣進行校正，所有數(shù)據(jù)均通過江申色譜工作站進行處理。
實施例310g海藻酸鈉加入含有80ml甲酰胺和30mlClSO3H的硫酸酯化試劑中，60℃攪拌4小時，得到棕紅色溶液，加入適量去離子水，透析3d，溶溶縮至干即得硫酸酯化海藻酸鈉15g。樣品S％為14.28％，C％，H％分別為19.75％和1.90％。計算硫酸酯基團取代度為1.63/糖醛酸單元(假設硫酸酯基和羧基均形成鈉鹽)。紅外檢測出現(xiàn)1250cm-1和800cm-1的硫酸酯基團振動峰。滲透凝膠色譜測試其保留時間為7.71分鐘，測試條件為凝膠柱TSKG3000-PW，流動相0.1mol/LNaCl水溶液，流速1.0mL/min，柱溫30℃，折射率檢出樣品。樣品濃度0.4％，通過TOSOH公司提供的Pullulan標樣進行校正，所有數(shù)據(jù)均通過江申色譜工作站進行處理。
實施例410g海藻酸鈉加入含有70ml N，N-二甲基甲酰胺，和20mlClSO3H的硫酸酯化試劑中，70℃攪拌4小時，得到棕紅色溶液，加入適量去離子水，透析3d，溶溶縮至干即得硫酸酯化海藻酸鈉13.89g。樣品S％為14.86％，C％，H％分別為19.20％和1.90％。計算硫酸酯基團取代度為1.71/糖醛酸單元(假設硫酸酯基和羧基均形成鈉鹽)。紅外檢測出現(xiàn)1250cm-1和800cm-1的硫酸酯基團振動峰。滲透凝膠色譜測試其保留時間為7.78分鐘，測試條件為凝膠柱TSKG3000-PW，流動相0.1mol/L NaCl水溶液，流速1.0mL/min，柱溫30℃，折射率檢出樣品。樣品濃度0.4％，通過TOSOH公司提供的Pullulan標樣進行校正，所有數(shù)據(jù)均通過江申色譜工作站進行處理。
實施例510g海藻酸鈉加入含有90ml二甲基亞砜，8ml吡啶和10mlClSO3H的硫酸酯化試劑中，70℃攪拌4小時，得到紅色溶液，加入適量去離子水，透析3d，溶溶縮至干即得硫酸酯化海藻酸鈉12.99g。樣品S％為8.57％，C％，H％分別為26.43％和2.57％。計算硫酸酯基團取代度為0.73/糖醛酸單元(假設硫酸酯基和羧基均形成鈉鹽)。紅外檢測出現(xiàn)1250cm-1和800cm-1的硫酸酯基團振動峰。滲透凝膠色譜測試其保留時間為7.78分鐘，測試條件為凝膠柱TSKG3000-PW，流動相0.1mol/L NaCl水溶液，流速1.0mL/min，柱溫30℃，折射率檢出樣品。樣品濃度0.4％，通過TOSOH公司提供的Pullulan標樣進行校正，所有數(shù)據(jù)均通過江申色譜工作站進行處理。
采用實施例1提供的海藻酸鈉硫酸酯樣品進行體外凝血試驗。測試活化部分凝血活酶時間APTT、凝血酶原時間PT、凝血酶時間TT，測試前血漿中加入不同濃度的樣品?？瞻讓φ諡椴患訕悠方M的APTT、TT、和PT分別為58s、1388s和16.13s。所有的數(shù)據(jù)均為四次測試的平均值，誤差＜0.5s。海藻酸鈉硫酸酯表現(xiàn)出明顯的抗凝血活性特別是APTT活性，當濃度從16.7μg/mL上升到33μg/mL和67μg/mL，APTT為266s，455s和～24min，而相同濃度下TT、和PT分別為30s和19s。其APTT活性同文獻報道的肝素水平相當。據(jù)報導肝素在10μg/mL時，APTT為226s(Hirano，S.，Tanaka，Y.，Hasegawa，M.，et al.， ，Carbohydr.Res.，137，205-215；)。
權利要求
1.海藻酸鈉硫酸酯，其結構式為 其中R1，R2，R3，R4為SO3Na或H，每糖醛酸單元SO3Na取代度為0.41～1.71；m，n，g，h為整數(shù)，15＜m+n+g+h＜40。
2.權利要求1所述海藻酸鈉硫酸酯的制備方法，其特征是將海藻酸鈉加入硫酸酯化試劑中，在40～70℃攪拌反應，得到棕紅色溶液，經(jīng)過透析，濃縮即得海藻酸鈉硫酸酯；所述的硫酸酯化試劑由體積比為60～85％的溶劑、5～30％絡合劑的和10～30％的ClSO3H組成，溶劑為甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜，絡合劑為含烷基的有機胺類化合物。
3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征是絡合劑為甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺或吡啶。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的制備方法，其特征是硫酸酯化試劑中ClSO3H的用量為體積比20～25％。
5.根據(jù)權利要求2或3所述的制備方法，其特征是硫酸酯化試劑按下法制備，在0～5℃，緩慢滴加ClSO3H于無水溶劑和絡合劑的混合液中，得乳白色粘稠液體，即為硫酸酯化試劑。
6.權利要求1所述海藻酸鈉硫酸酯作為抗凝血劑在制備抗凝血藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新化合物海藻酸鈉硫酸酯，其結構式為上式，其中R
文檔編號C08B37/00GK1542021SQ200310111330
公開日2004年11月3日 申請日期2003年11月4日 優(yōu)先權日2003年11月4日
發(fā)明者杜予民, 黃榮華, 楊建紅 申請人:武漢大學