專利名稱:腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗及其工業(yè)化生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗以及該純化疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
腎綜合征出血熱(流行性出血熱)是一種病毒性急性傳染病，對人類的健康危害極大。在中國，具有代表性的腎綜合征出血熱病毒株有，例如，腎綜合征出血熱病毒流行株P(guān)S-6(I型)、L99(II型)、JR-C-1等等。
長期以來，人們一直致力于研制腎綜合征出血熱的疫苗，特別是針對I型和II型腎綜合征出血熱的雙價或多價疫苗。
中國專利申請，公開號CN1236646A，公開了一種流行性出血熱原代地鼠腎細(xì)胞多價純化疫苗(長春生物制品研究所)，其中用原代地鼠腎細(xì)胞來制備流行性出血熱的多價純化疫苗。盡管該發(fā)明提供了一種安全有效的流行性出血熱的多價純化疫苗，但是，由于需要使用地鼠腎細(xì)胞來培養(yǎng)病毒，使得生產(chǎn)工藝略顯復(fù)雜。
Vero細(xì)胞是非洲綠猴腎傳代細(xì)胞，20世紀(jì)80年代初世界衛(wèi)生組織(WHO)批準(zhǔn)用于生產(chǎn)人用疫苗，具有生物學(xué)性狀穩(wěn)定、可無限繁殖傳代、質(zhì)量容易控制、可結(jié)合微載體技術(shù)進(jìn)行高密度培養(yǎng)等優(yōu)點，已成功應(yīng)用于人用狂犬病疫苗、乙型腦炎疫苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗的生產(chǎn)。
中國專利申請，公開號CN1237456A，介紹了一種流行性出血熱傳代細(xì)胞多價純化疫苗(中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所)，其中用Vero細(xì)胞通過終末稀釋及乳小白鼠腦交替?zhèn)鞔姆椒▉碇苽洳《径痉N，以生產(chǎn)流行性出血熱的多價純化疫苗，但用該方法選育的病毒毒種毒力僅為7.0LgCCID50/ml，而且病毒液的收獲次數(shù)很少(3次)，使得工業(yè)化生產(chǎn)疫苗的成本過高。
長期以來，人們一直期望得到一種腎綜合征出血熱病毒毒種，其病毒毒力更高，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)， 同時也期望找到一種成本低、操作簡單的工業(yè)化生產(chǎn)腎綜合征出血熱純化疫苗的方法。

發(fā)明內(nèi)容為了尋找病毒毒力高的腎綜合征出血熱病毒毒種和更適合于工業(yè)化生產(chǎn)腎綜合征出血熱雙價純化疫苗的方法，本申請人作了大量的研究。
本申請人采用在Vero細(xì)胞中經(jīng)空斑克隆選育腎綜合征出血熱PS-6(I型)病毒和L99(II型)病毒，分別得到了高病毒滴度的PS-6(C-3)(I型)和L99(C-2)(II型)病毒毒種。
本申請人還發(fā)現(xiàn)了一種成本低、操作簡單的工業(yè)化生產(chǎn)腎綜合征出血熱雙價純化疫苗的方法。在本方法中，采用先培養(yǎng)Vero細(xì)胞，后接種本發(fā)明的病毒株，接種后，病毒在Vero細(xì)胞中培養(yǎng)，收獲病毒培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)病毒，以便多次收獲病毒培養(yǎng)液，病毒培養(yǎng)液或合并后的病毒培養(yǎng)液，經(jīng)后續(xù)純化工藝，生產(chǎn)出腎綜合征出血熱雙價純化疫苗。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供一種腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗，以有效控制腎綜合征出血熱的流行和降低發(fā)病率。
本發(fā)明的另一目的是提供一種工業(yè)化生產(chǎn)腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗的方法。
本發(fā)明的又一目的是提供高病毒滴度的腎綜合征出血熱病毒毒種，用于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的其他目的體現(xiàn)于對本發(fā)明的詳細(xì)描述之中。
圖1為本發(fā)明工業(yè)化生產(chǎn)腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗的一種實施方案的流程示意圖。
本申請人經(jīng)多年研究，選育分離得到了高毒力滴度的腎綜合征出血熱病毒毒種PS-6(C-3)(I型)和L99(C-2)(II型)病毒毒種。
本發(fā)明的PS-6(C-3)(I型)病毒毒種，是采用空斑克隆的方法，在Vero細(xì)胞中選育腎綜合征出血熱病毒PS-6(I型)得到的，PS-6(C-3)(I型)病毒毒種的毒力滴度≥8.0LgCCID50/ml。PS-6(C-3)(I型)病毒株已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢的武漢大學(xué)，其保藏號為CCTCC-V200503，保藏日期為2005年4月24日。
本發(fā)明的L99(C-2)(II型)病毒毒種，是采用空斑克隆的方法，在Vero細(xì)胞中選育腎綜合征出血熱病毒L99(II型)得到的，L99(C-2)(II型)病毒毒種的毒力滴度≥8.5LgCCID50/ml。L99(C-2)(II型)已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢的武漢大學(xué)，其保藏號為CCTCC-V200504，保藏日期為2005年4月24日。
PS-6(C-3)(I型)病毒毒種和L99(C-2)(II型)病毒毒種，經(jīng)做一系列檢測，包括無菌試驗、病毒外源因子檢查、純毒試驗、抗原性、免疫源性等，各項檢查結(jié)果均符合規(guī)程要求標(biāo)準(zhǔn)，表明這兩毒種可以選定為生產(chǎn)疫苗用毒種。
PS-6(C-3)和L99(C-2)均為腎綜合征出血熱病毒，屬于布尼亞病毒科、漢坦病毒屬。
中國流行的腎綜合征出血熱病毒主要屬于黑線姬鼠型(國際上稱“漢灘型”或I型)和褐家鼠型(國際上稱“漢城型”或II型)兩個血清型，PS-6(C3)和L99(C2)分別屬于I型和II型。
PS-6(C3)和L99(C2)病毒株，在Vero細(xì)胞上傳代適應(yīng)性強(qiáng)，毒力上升快，并且穩(wěn)定。PS-6(C3)從第3代至第5代，L99(C2)從第2代至第5代毒力均穩(wěn)定在8.5lgCCID50/ml。將PS-6(C3)和L99(C2)病毒在Vero細(xì)胞上傳代的第3、4、5代，用甲醛滅活，按常規(guī)方法免疫家兔，檢測家兔血清中和抗體，結(jié)果中和抗體滴度均≥1∶10，表明兩株病毒具有良好的免疫原性。
根據(jù)本發(fā)明，一種工業(yè)化生產(chǎn)腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗的方法，包括以下步驟一、分別制備腎綜合征出血熱病毒PS-6(C-3)，CCTCC-V200503和L99(C-2)，CCTCC-V200504的疫苗原液，包括1.在生長液的存在下，培養(yǎng)Vero細(xì)胞；2.將腎綜合征出血熱病毒PS-6(C-3)，CCTCC-V200503或L99(C-2)，CCTCC-V200504，接種于Vero細(xì)胞；
3.在維持液的存在下，在Vero細(xì)胞中培養(yǎng)該病毒，收獲病毒液；4.用甲醛處理收獲的病毒液，以滅活病毒，得到疫苗原液；二、將分別得到的PS-6(C-3)疫苗原液和L99(C-2)疫苗原液合并；三、合并后的疫苗原液經(jīng)純化處理后，加入佐劑，得到雙價純化疫苗。
該純化處理包括離心分離、超濾濃縮、醋酸鋅沉淀和柱層析。
本發(fā)明采用的Vero細(xì)胞可以從市場上得到，例如，從美國典型培養(yǎng)物保藏中心得到?？梢杂觅彽玫腣ero細(xì)胞，建立Vero細(xì)胞庫，以提供生產(chǎn)所需的Vero細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，PS-6(C-3)或L99(C-2)病毒在Vero細(xì)胞中培養(yǎng)，收獲病毒液后，可以通過添加維持液繼續(xù)培養(yǎng)病毒來再次收獲病毒液。這種過程可以重復(fù)進(jìn)行，以達(dá)到多次收獲病毒液的目的。因此，本發(fā)明步驟3可以重復(fù)多次，而各次收獲的病毒液，可以合并后再用甲醛進(jìn)行滅活處理。
采用本發(fā)明的腎綜合征出血熱病毒PS-6(C-3)，CCTCC-V200503和L99(C-2)，CCTCC-V200504，在本發(fā)明的工業(yè)化生產(chǎn)腎綜合征出血熱雙價純化疫苗的方法中，可以多次收獲高毒力滴度的病毒液，能很好地降低腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗的成本。
根據(jù)本發(fā)明的一種實施方案，在接種病毒時，選用長成單層的質(zhì)量好的Vero細(xì)胞感染病毒，可以保證用于純化疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞質(zhì)量，并使細(xì)胞維持時間長，在Vero細(xì)胞中培養(yǎng)該病毒，可多次收獲毒力滴≥8.0LgCCID50/ml的病毒液，收獲病毒液的次數(shù)可至少為8次。
用于本發(fā)明的生長液可以是含8％-10％小牛血清的199或MEM。
本發(fā)明的維持液可以是含1％-2％小牛血清的199或MEM。
在本發(fā)明的方法中，維持液采用含小牛血清的培養(yǎng)基，這樣，在批量生產(chǎn)疫苗時，可節(jié)省大量人血白蛋白。由于人血白蛋白的價格昂貴，用本發(fā)明的生產(chǎn)方法可以極大地降低成本。
本發(fā)明的純化方法包括離心分離、超濾濃縮、醋酸鋅沉淀和柱層析等步驟。根據(jù)本發(fā)明，純化方法中的離心分離和超濾濃縮，可以采用常規(guī)的離心分離和超濾濃縮方法。
在本發(fā)明的純化方法中，采用了醋酸鋅沉淀步驟。本申請人發(fā)現(xiàn)，采用醋酸鋅沉淀步驟，不僅可以除去雜蛋白，而且能很好地去除病毒液中殘留的小牛血清，使得本發(fā)明用小牛血清替代人血白蛋白的方案可以順利實施，進(jìn)一步降低了生產(chǎn)疫苗的成本。
本發(fā)明純化方法中的柱層析，可以采用常規(guī)的柱層析方法，優(yōu)選Sepharose 4FF柱層析方法。
在本發(fā)明的純化方法中，佐劑優(yōu)選采用氫氧化鋁。
用本發(fā)明的方法純化后的疫苗蛋白含量小于90μg/ml。
純化的疫苗經(jīng)分裝和包裝，得到可直接用于臨床的疫苗制劑。
本發(fā)明生產(chǎn)腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗的方法，不僅增加了產(chǎn)量，又因節(jié)省人血白蛋白、減少細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)次數(shù)及數(shù)量而取得明顯的節(jié)約，這無疑是非常符合工業(yè)化生產(chǎn)的。
根據(jù)本發(fā)明，一種腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗，包含有效量的腎綜合征出血熱滅活病毒I型和II型以及疫苗佐劑，該病毒來自PS-6(C-3)株，CCTCC-V200503，和L99(C-2)株，CCTCC-V200504。
在本發(fā)明的雙價純化疫苗中，PS-6(C-3)疫苗原液和L99(C-2)疫苗原液的比例，優(yōu)選為1∶1。疫苗佐劑優(yōu)選采用氫氧化鋁。
根據(jù)本發(fā)明，可以將腎綜合征出血熱病毒株，PS-6(C-3)，CCTCC-V200503和腎綜合征出血熱病毒株，L99(C-2)，CCTCC-V200504，用于制備腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞單/雙價純化疫苗。
具體實施方式以下參照附圖1，舉例闡述本發(fā)明生產(chǎn)腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗的方法。
Vero細(xì)胞接種于轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)2～3天長成單層，生長液為含8％-10％小牛血清的199或MEM。加毒種PS-6(C-3)株(毒力滴度≥8.0LgCCID50/ml)感染細(xì)胞，維持液為含1％-2％小牛血清的199或MEM。培養(yǎng)5～6天收獲病毒液(即疫苗原液)，再加入1％-2％小牛血清的199或MEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)，每3～4天收獲一次，可至少收獲8次，各次收獲的疫苗原液加甲醛滅活。
用上述同樣的方法，但用L99(C-2)株(毒力滴度≥8.5LgCCID50/ml)感染細(xì)胞，來制備病毒液(即疫苗原液)，其中該疫苗原液也是每3～4天收獲一次，可至少收獲8次，各次收獲的疫苗原液加甲醛滅活。
無菌試驗和毒力測定合格后，將滅活的PS-6(C-3)株的疫苗原液和L99(C-2)株的疫苗原液合并，8000～10000轉(zhuǎn)/分連續(xù)流離心分離，超濾濃縮，1％～5％醋酸鋅沉淀，柱層析(Sepharose 4FF)純化。除菌，同時進(jìn)行半成品檢定。合格后，配制疫苗，包括稀釋，加人血白蛋白、硫柳汞和氫氧化鋁。疫苗分裝，成品檢定，合格后，包裝，出品。
檢定項目及質(zhì)量指標(biāo)疫苗原液(1)無菌試驗合格；(2)毒力測定≥6.5LgCCID50/ml；(3)滅活試驗Vero-E6細(xì)胞上盲傳三代，IFAT檢查抗原陰性；(4)支原體檢查陰性半成品檢定(1)無菌試驗合格；(2)抗原量≥1∶128(ELISA)；(3)殘余牛血清蛋白含量＜50ng/ml；(4)蛋白含量≤120μg/ml；(5)細(xì)胞DNA含量≤100pg/劑。
成品檢定(1)無菌試驗合格；(2)異常毒性試驗合格；(3)過敏性試驗合格；(4)熱原質(zhì)試驗合格；(5)硫柳汞含量＜0.10mg/ml；(6) 氫氧化鋁含量≤0.7mg/ml；(7)pH 7.0～8.0；(8)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查＜100EU/劑。
(9)效力試驗每批疫苗免疫4只家兔，血清對I、II型病毒的中和抗體分別≥1∶20。
比較實施例1用本發(fā)明的病毒毒種與用CN1237456A的方法得到的病毒毒種進(jìn)行生產(chǎn)的收獲次數(shù)的比較1.CN1237456A的方法中病毒毒種進(jìn)行生產(chǎn)的收獲次數(shù)生長液含10％小牛血清的MEM；維持液含0.2％人血白蛋白的MEM。
Vero細(xì)胞按1傳3擴(kuò)大培養(yǎng)同時，于生長液中加入出血熱病毒，37℃培養(yǎng)3天，將生長液倒掉。用生理鹽水噴洗后，換維持液，33℃繼續(xù)培養(yǎng)3天，第一次收獲，同時加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3天收獲一次。收獲第3次時，鏡下觀察細(xì)胞已經(jīng)脫落50％～60％，剩余細(xì)胞形態(tài)不好，有許多圓縮細(xì)胞，不能再收獲合格的疫苗原液。收獲的3次疫苗原液進(jìn)行病毒滴定，分別為7.0、8.0、7.67LgCCID50/ml。
2.本發(fā)明的病毒毒種進(jìn)行生產(chǎn)的收獲次數(shù)生長液含10％小牛血清的199或MEM；維持液含1％～2％小牛血清的199或MEM。
Vero細(xì)胞于生長液中按1傳3擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天，將生長液倒掉。換維持液，同時加入出血熱病毒PS-6(C-3)株感染，33℃繼續(xù)培養(yǎng)5天，第一次收獲，同時加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3天收獲一次。收獲第8次時，鏡下觀察細(xì)胞，有30％～50％脫落，剩余細(xì)胞形態(tài)不好，不再加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)。收獲的8次疫苗原液進(jìn)行病毒滴定，毒力分別為8.0、8.50、8.33、8.50、8.50、8.33、8.50、7.50LgCCID50/ml。
另一次試驗中加入出血熱病毒L99(C-2)株感染，收獲10次疫苗原液，毒力分別為8.0、8.50、8.50、8.50、8.00、8.33、7.50、7.50、8.33、6.67LgCCID50/ml。
從比較實施例1中可清楚看出，與CN1237456A相比，本發(fā)明的出血熱病毒株有高很多的疫苗原液收獲次數(shù)和病毒毒力。
實施例1Vero細(xì)胞培養(yǎng)取長成單層的Vero細(xì)胞(來源于中國藥品生物制品檢定所)若干瓶(3L轉(zhuǎn)瓶)，棄去生長液，加入pH8.0、濃度0.1％的胰酶液，置室溫、轉(zhuǎn)瓶機(jī)上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)消化。肉眼觀察細(xì)胞面出現(xiàn)消化線時，棄去胰酶液，加適量含8～10％小牛血清的199培養(yǎng)液(生長液)，輕搖液體將細(xì)胞從瓶壁上沖下，使細(xì)胞懸于生長液中。搖勻后以1傳3的比例分裝到3立升轉(zhuǎn)瓶中，每瓶加生長液至300ml，置37℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，三日后，細(xì)胞長成單層。
PS-6(C-3)I型疫苗原液和L99(C-2)II型疫苗原液的分別制備選取長成單層的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棄去瓶內(nèi)的生長液，將毒種(PS-6(C-3)I型或L99(C-2)II型)稀釋10000倍于1～2％小牛血清的199液中(維持液)，搖勻后分裝于3L培養(yǎng)瓶中，每瓶300ml置33℃～35℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5～6天收獲病毒液(即疫苗原液)，再加入相同的維持液繼續(xù)培養(yǎng)，每3～4天收獲一次，共收獲8次。每次收獲的病毒液取樣做病毒滴定和無菌試驗。各次收獲的疫苗原液按液量加入福爾馬林至1/4000，硫柳汞至1/20000。充分振搖后置37℃24小時，再轉(zhuǎn)置4℃14天進(jìn)行病毒滅活。
雙價疫苗的純化及檢定取樣做安全試驗合格后，將PS-6(C-3)I型疫苗原液和L99(C-2)II型疫苗原液合并成雙價疫苗(1∶1比例)。合并的疫苗經(jīng)8000r/min連續(xù)流離心去掉細(xì)胞碎片。超濾濃縮，按1/20mol/L濃度加入醋酸鋅，2-8℃鹽析30分鐘后，3000r/min離心30分鐘。將沉淀用飽和EDTA溶解，再用3mol/LTris液調(diào)pH7.6-7.8，3000r/min離心30分鐘。上清液再經(jīng)超濾濃縮透析后(透析液PH7.2 0.2mol/LPB)，上Sepharose 4FF柱進(jìn)行層析純化。以A280nm監(jiān)測，PH7.2 0.2mol/LPB為洗脫液，收集第一峰。經(jīng)0.2μm孔徑濾器除菌過濾后留樣，加硫柳汞防腐(1/20000)，放4℃保存。純化的樣品進(jìn)行無菌試驗，抗原量測定，殘存牛血清蛋白含量測定，DNA含量測定，蛋白含量測定等檢定。檢定合格后，將純化的疫苗進(jìn)行適當(dāng)稀釋，加入AL(OH)3至0.5mg/ml，分裝1.0ml/安瓶。然后進(jìn)行成品檢定，包括無菌試驗，鑒別試驗，效力試驗，異常毒性試驗，理化檢定等。成品檢定合格后，即為腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗。
權(quán)利要求
1.一種腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗，包含有效量的腎綜合征出血熱滅活病毒I型和II型以及疫苗佐劑，該I型和II型病毒，分別來自PS-6(C-3)株，CCTCC-V200503，和L99(C-2)株，CCTCC-V200504。
2.權(quán)利要求
1的雙價純化疫苗，其中該PS-6(C-3)I型病毒與L99(C-2)II型病毒的比例為1∶1。
3.一種分離的腎綜合征出血熱病毒株，PS-6(C-3)，CCTCC-V200503。
4.一種分離的腎綜合征出血熱病毒株，L99(C-2)，CCTCC-V200504。
5.腎綜合征出血熱病毒株，PS-6(C-3)，CCTCC-V200503和腎綜合征出血熱病毒株，L99(C-2)，CCTCC-V200504在制備腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗中的應(yīng)用。
6.一種工業(yè)化生產(chǎn)腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗的方法，包括以下步驟1>、分別制備腎綜合征出血熱病毒PS-6(C-3)，CCTCC-V200503和L99(C-2)，CCTCC-V200504的疫苗原液，包括(1)、在生長液的存在下，培養(yǎng)Vero細(xì)胞；(2)、將腎綜合征出血熱病毒PS-6(C-3)，CCTCC-V200503或L99(C-2)，CCTCC-V200504，接種到Vero細(xì)胞中；(3)、在維持液的存在下，培養(yǎng)接種到Vero細(xì)胞中的該病毒，收獲病毒液；(4)、用甲醛處理收獲的病毒液，以滅活病毒，得到疫苗原液；2>、合并PS-6(C-3)和L99(C-2)的疫苗原液，3>、純化處理合并后的疫苗原液，加入佐劑，得到純化雙價疫苗。
7.權(quán)利要求
6的方法，其中，重復(fù)步驟(3)，以多次收獲病毒液。
8.權(quán)利要求
6或7的方法，其中，該純化處理包括離心分離、超濾濃縮、醋酸鋅沉淀和柱層析，其中，該柱層析優(yōu)選用Sepharose 4FF進(jìn)行。
9.權(quán)利要求
6-8之一的方法，其中，該生長液是含8％-10％小牛血清的199或MEM。
10.權(quán)利要求
6-9之一的方法，其中，該維持液是含1％-2％小牛血清的199或MEM。
專利摘要
本發(fā)明涉及腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗及其工業(yè)化制備方法。本發(fā)明的腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗，包含有效量的腎綜合征出血熱滅活病毒I型和II型以及疫苗佐劑，該I型和II型病毒，分別來自PS－6(C－3)株，CCTCC－V200503，和L99(C－2)株，CCTCC－V200504。本發(fā)明的制備方法包括1.分別制備腎綜合征出血熱病毒PS－6(C－3)，CCTCC－V200503和L99(C－2)，CCTCC－V200504的疫苗原液，用甲醛滅活病毒；2.將已滅活的PS－6(C－3)，CCTCC－V200503和L99(C－2)，CCTCC－V200504的疫苗原液合并后純化，包括離心分離、超濾濃縮、醋酸鋅沉淀和柱層析；3.向純化后的疫苗原液中加入佐劑，得到純化雙價疫苗。本發(fā)明制備的腎綜合征出血熱Vero細(xì)胞雙價純化疫苗，適合預(yù)防所有I型為主和II型為主的腎綜合征出血熱。
文檔編號A61P31/14GK1990041SQ200510137779
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月28日
發(fā)明者韓亮, 趙麗紅, 郝富勇, 岳立廣, 宋宗明, 惠連, 王曉宏, 李彤, 王偉, 趙建, 張龍梅, 馬軍, 張偉紅 申請人:長春生物制品研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan