本發(fā)明涉及一種殼寡糖的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
幾丁質(zhì)(chitin)廣泛存在于甲殼類動物的外殼、昆蟲的甲殼和真菌的胞壁中，是自然界中最為豐富的天然高分子，含量僅次于纖維素。幾丁質(zhì)具有多種功能特性，但是其極差的水溶特性和生物降解能力極大的限制了其廣泛應(yīng)用。相對于幾丁質(zhì)不溶于水、稀酸、稀堿、乙醇或其他有機溶劑的特性，殼聚糖可溶于水并在稀酸溶液中呈現(xiàn)出較高的粘度，這種溶解特性也限制了殼聚糖在生物領(lǐng)域的應(yīng)用。作為幾丁質(zhì)和殼聚糖的降解產(chǎn)物，殼寡糖的溶解性好，且在生理條件下粘度較低，這是由于殼寡糖的糖鏈更短和游離氨基基團。殼寡糖的糖苷殘基重復(fù)單元中含有一個氨基基團和兩個羥基基團，是自然界中唯一帶正電荷陽離子堿性氨基低聚糖。殼寡糖的這些特性引起了越來越多研究者的關(guān)注。已經(jīng)有很多文獻報道了殼寡糖的生物活性，抗氧化、消炎、拮抗微生物、降低膽固醇和增強免疫活性、抗腫瘤的活性等。殼寡糖在很多領(lǐng)域的應(yīng)用也有相應(yīng)的報道，如食品、藥物、農(nóng)業(yè)和環(huán)境領(lǐng)域。此外，殼寡糖良好的生物相容性、無毒、對活體器官的不致敏特性，也使其作為納米/微米體系發(fā)展成為一種潛在的藥物載體和組織工程支架。
原發(fā)性肝癌是最為常見的惡性腫瘤之一，2015年全球范圍內(nèi)共有78.8萬例肝癌病人死亡。原發(fā)性肝癌是一種高發(fā)病率、高死亡率的全球性難治性惡性腫瘤，分別居于男女常見惡性腫瘤的第5、7位，說明原發(fā)性肝癌已嚴重威脅人類健康且成為我國主要的腫瘤死因之一。有文獻報道，殼寡糖具有抗腫瘤的生物活性，其機制為直接抑制腫瘤細胞的生長，并且有報道細胞壞死和凋亡，減少腫瘤血管生成從而實現(xiàn)抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，也有可能是通過增強機體免疫力，間接實現(xiàn)拮抗腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明是為了解決目前原發(fā)性肝癌高發(fā)病率、高死亡率的技術(shù)問題，而提供一種殼寡糖的應(yīng)用。
本發(fā)明為一種殼寡糖的應(yīng)用，用于抑制人源肝癌hepg2細胞和人源肝癌mhcc97h細胞的活性；
所述的殼寡糖中聚合度2～6的殼寡糖含量為80％～90％，且殼二糖含量為25％～30％，殼三糖含量為15％～20％，殼四糖含量為25％～30％，殼五糖含量為3％～8％，殼六糖含量為2％～6％。
本發(fā)明的優(yōu)點：
殼寡糖是自然界中唯一的氨基低聚糖，其單體為氨基葡萄糖，本發(fā)明所述的殼寡糖的優(yōu)點是分子量低，純度高，殼二糖～殼六糖含量高，抗腫瘤效果好，溶解性好，易吸收，同時還具有無毒副作用等優(yōu)點；
殼寡糖是自然界中唯一帶正電荷的氨基葡萄糖，腫瘤細胞表面帶有比正常細胞更多的負電荷，所以殼寡糖可以通過靜電吸附靶向腫瘤細胞，殼二糖～殼四糖通過與血液中的甘露糖競爭腫瘤細胞表面的甘露糖受體，影響細胞ca2+離子信號通路，改變腫瘤細胞膜通透性，致使細胞胞漿外溢，同時細胞膜通透性增加了殼五糖和殼六糖進入腫瘤細胞的速度和濃度，并靶向腫瘤細胞線粒體，影響線粒體能量產(chǎn)生，斷開能量傳遞鏈，加速腫瘤細胞死亡。
本發(fā)明中所述的殼寡糖中殼二糖～殼四糖含量高，可高效地結(jié)合腫瘤細胞表面的甘露糖受體，進一步增加腫瘤細胞膜的通透性，殼五糖和殼六糖進入腫瘤細胞后，靶向線粒體，降低線粒體電勢。
本發(fā)明所述的殼寡糖應(yīng)用于抑制裸鼠肝原位移植人源肝癌hepg2細胞的瘤重抑制率為44.5％，光量子數(shù)抑制率為80.9％；抑制裸鼠肝原位移植人源肝癌mhcc97h細胞的瘤重抑制率為68.7％。
原位移植模型不僅能保持原有瘤組織的結(jié)構(gòu)，而且還能充分展示腫瘤的生物學(xué)行為，更接近腫瘤在病人體內(nèi)的發(fā)展情況，廣泛應(yīng)用于腫瘤機制研究及抗腫瘤藥物的篩選。
具體實施方式
具體實施方式一：本實施方式為一種殼寡糖的應(yīng)用，具體為應(yīng)用于抑制人源肝癌hepg2細胞和人源肝癌mhcc97h細胞的活性；
所述的殼寡糖中聚合度2～6的殼寡糖含量為80％～90％，且殼二糖含量為25％～30％，殼三糖含量為15％～20％，殼四糖含量為25％～30％，殼五糖含量為3％～8％，殼六糖含量為2％～6％。
具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一的不同點是：所述的殼寡糖的制備方法為：
將殼聚糖溶解于質(zhì)量濃度為0.1％～5.0％的冰乙酸溶液中，然后加入殼聚糖5～25倍重的質(zhì)量濃度為10％～40％過氧化氫，升溫攪拌至40℃～90℃恒溫，反應(yīng)0.5h～10h，再經(jīng)質(zhì)量濃度為60％～100％的乙醇沉淀，過濾，濾渣經(jīng)過干燥，得到殼寡糖；殼聚糖與質(zhì)量濃度為0.1％～5.0％的冰乙酸溶液的質(zhì)量體積比為1g:(10～30)ml。其他與具體實施方式一相同。
具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式二的不同點是：將殼聚糖溶解于質(zhì)量濃度為3.5％的冰乙酸溶液中，然后加入殼聚糖20倍重的濃度為30％過氧化氫。其他與具體實施方式一相同。
具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式二的不同點是：所述的干燥為冷凍干燥。其他與具體實施方式一相同。
具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式二的不同點是：升溫攪拌至70℃恒溫，反應(yīng)8h，再經(jīng)質(zhì)量濃度為95％的乙醇沉淀。其他與具體實施方式一相同。
通過以下試驗驗證本發(fā)明效果：
試驗一：本試驗為一種殼寡糖的制備方法，具體為：
將殼聚糖溶解于質(zhì)量濃度為3.5％的冰乙酸溶液中，然后加入殼聚糖20倍重的質(zhì)量濃度為30％過氧化氫，升溫攪拌至70℃恒溫，反應(yīng)8h，再經(jīng)質(zhì)量濃度為95％的乙醇沉淀，過濾，濾渣經(jīng)過冷凍干燥，得到殼寡糖；殼聚糖與質(zhì)量濃度為3.5％的冰乙酸溶液的質(zhì)量體積比為1g:20ml。
所述的殼寡糖中聚合度2～6的殼寡糖含量為85％，且殼二糖含量為28％，殼三糖含量為18％，殼四糖含量為27％，殼五糖含量為7％，殼六糖含量為5％；
試驗二：本試驗為應(yīng)用殼寡糖抑制人源肝癌hepg2細胞的活性。
1、試驗動物
試驗動物來源：成年nu/nu裸鼠，18.0～22.0g，雌性，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證號：scxk-(京)2012-001。受試動物飼養(yǎng)于無菌的獨立送風(fēng)籠中，每籠5只。墊料為60co輻射消毒的玉米芯墊料，粒徑4～6mm。飼以專門為小鼠配制的消毒飼料，自由飲用純凈水。動物實驗室內(nèi)溫度保持在25℃，相對濕度保持在40～70％。
2、試驗方法
2.1細胞培養(yǎng)
hepg2-luc細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)為10％的胎牛血清的dmem細胞培養(yǎng)液中，分別加入青霉素和鏈霉素各100u/ml，置于37℃含體積分數(shù)為5％的co2的細胞培養(yǎng)箱中，每1-2天換液一次。用0.25％胰酶消化傳代，1200r/min離心5min后，棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。
2.2肝原位腫瘤模型建立
將hepg-2-luc細胞消化后，用生理鹽水重懸，調(diào)整至細胞個數(shù)為4×107/ml，與matrix膠1:1混勻；對要手術(shù)接種的裸鼠以0.5％的戊巴比妥10ml/kg麻醉后，將裸鼠固定在手術(shù)臺上，消毒腹部皮膚，在右上腹部剪開約1cm的切口，暴露肝臟，手術(shù)洞巾覆蓋，用微量注射器吸取100μl混合均勻的細胞植入肝臟內(nèi)，創(chuàng)口出血部位用消毒紗布進行止血處理。然后將手術(shù)后的肝臟放回小鼠腹腔內(nèi)，用4/0號手術(shù)縫合針依次縫合腹肌和皮膚。
3、實驗分組及處理方案
待術(shù)后1周后用ivisspectrumct檢測模型腫瘤生長情況，選取已生長原位腫瘤，且腫瘤大小相似的動物按動物體重隨機分組，分為空白對照組、殼寡糖組及陽性藥組，每組動物8只，分組及處理方案如下：
空白對照組：生理鹽水；陽性藥組：索拉菲尼，劑量為20mg/kg；殼寡糖組:配置濃度為4mg/ml的殼寡糖生理鹽水溶液，注射溶液中殼寡糖的劑量為40mg/kg，用的是試驗一制備的殼寡糖。
殼寡糖腹腔注射，每間隔48h給藥一次；陽性藥組灌胃給藥，每24h給藥一次，試驗結(jié)束后，頸部脫臼處死動物，解剖取肝臟，并剝離肉眼可見腫瘤稱重。
4、數(shù)據(jù)處理
腫瘤瘤重生長抑制率＝(空白對照組瘤重－給藥組瘤重)/空白對照組瘤重×100％。
試驗結(jié)果：殼寡糖隔天給藥，共計16次，陽性藥索拉菲尼連續(xù)給藥，共計31次。殼寡糖組在給藥期間沒有出現(xiàn)明顯的體重大幅下降現(xiàn)象，而索拉菲尼組有一只動物由于腫瘤負荷過重而死亡。與空白對照組比較，40mg/kg殼寡糖劑量組的瘤重抑制率為44.5％，光量子數(shù)抑制率為80.9％；陽性對照組的瘤重抑制率為39.7％，光量子數(shù)抑制率為85.9％。具體結(jié)果見表1。
表1殼寡糖對人肝癌細胞hepg2-luc裸鼠原位移植瘤模型生長抑制試驗
試驗三：本試驗為應(yīng)用殼寡糖抑制人源肝癌mhcc97h細胞的活性。
1、試驗動物
試驗動物來源：成年nu/nu裸鼠，18.0～22.0g，雌性，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證號：scxk-(京)2012-001。受試動物飼養(yǎng)于無菌的獨立送風(fēng)籠中，每籠5只。墊料為60co輻射消毒的玉米芯墊料，粒徑4～6mm。飼以專門為小鼠配制的消毒飼料，自由飲用純凈水。動物實驗室內(nèi)溫度保持在25℃，相對濕度保持在40％～70％。
2、試驗方法
2.1細胞培養(yǎng)
mhcc97h-luc細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)為10％的胎牛血清的dmem細胞培養(yǎng)液中，分別加入青霉素和鏈霉素各100u/ml，置于37℃含體積分數(shù)為5％的co2的細胞培養(yǎng)箱中，每1-2天換液一次。用0.25％胰酶消化傳代，1200r/min離心5min后，棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。
2.2肝原位腫瘤模型建立
傳代保種鼠皮下腫瘤生長至直徑約1～2cm時，無菌條件下取出瘤塊，將瘤塊切成1.0×1.0mm大小的瘤塊備用。將要手術(shù)接種的裸鼠用麻藥麻醉后，將鼠固定在手術(shù)臺上，消毒腹部皮膚，在左上腹部剪開1cm切口，暴露肝臟，手術(shù)洞巾覆蓋。將準(zhǔn)備好的瘤塊放入專用接種套管針內(nèi)，用套管針將瘤植入肝臟內(nèi)，創(chuàng)口出血部位用消毒紗布進行止血處理。然后將手術(shù)后的肝臟放回小鼠腹腔內(nèi)，用手術(shù)縫合針依次縫合腹肌和皮膚。
3、試驗分組及處理方案
荷瘤鼠手術(shù)兩周至三周后通過b超隨機檢測肝原位腫瘤模型是否成功建立，將荷瘤鼠進行隨機分組，分為空白對照組、殼寡糖組及陽性組，每組動物8只，分組及處理方案如下：
空白對照組：生理鹽水；陽性藥氟尿嘧啶：30mg/kg；殼寡糖組：配置濃度為4mg/ml的殼寡糖生理鹽水溶液，注射溶液中殼寡糖的劑量為40mg/kg，用的是試驗一制備的殼寡糖。殼寡糖腹腔注射，每間隔48h給藥一次；陽性藥尾靜脈注射給藥，每周給藥兩次。試驗結(jié)束后，頸部脫臼處死動物。解剖取肝臟，并剝離肉眼可見腫瘤稱重。
4、數(shù)據(jù)處理
腫瘤瘤重生長抑制率＝(空白對照組瘤重－給藥組瘤重)/空白對照組瘤重×100％。
5、試驗結(jié)果：殼寡糖隔天給藥，共計12次，陽性藥氟尿嘧啶每周給藥2次，共計6次。與空白對照組比較，40mg/kg殼寡糖劑量組的瘤重抑制率為68.7％；陽性對照組的瘤重抑制率為66.4％。具體結(jié)果見表3。
表3殼寡糖對人肝癌細胞mhcc97h裸鼠原位移植瘤模型生長抑制試驗
試驗四：本試驗為測試殼寡糖對正常昆明小鼠血象的影響，選取空白對照組：生理鹽水；殼寡糖組：40mg/kg，用的是試驗一制備的殼寡糖。結(jié)果見表4，可以說明試驗一制備的殼寡糖毒性低。
表4
共給藥4次(1周)，腹腔注射，隔天給藥。