本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及由松柏醛或松柏醛和釩化合物聯(lián)合的藥物組合物為主要原料，制備用于預(yù)防和治療神經(jīng)退行性病變阿爾茨海默癥的藥物或保健食品的用途。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是目前威脅世界人口健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的重大疾病之一。其原因一是人口老齡化的加劇，患病人數(shù)逐年增加。美國(guó)65歲以上人口中，每8人便有一人受此病困擾，25％的住院老年病人患有AD癥；國(guó)內(nèi)的情況和美國(guó)相似。其二是從神經(jīng)組織發(fā)生AD病理變化到可見(jiàn)的臨床認(rèn)知障礙癥狀之間存在較長(zhǎng)的時(shí)間差，造成一旦確診就失去了治療的最佳時(shí)間。這種病變和癥狀之間的不同步性可用大腦的“認(rèn)知儲(chǔ)備”來(lái)解釋。其三是目前缺乏有效的AD治療方案，并且費(fèi)用昂貴。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)每年用于治療AD的費(fèi)用是普通老年病治療費(fèi)用的9倍多。這種巨額費(fèi)用對(duì)各國(guó)都是嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)威脅，甚至有可能導(dǎo)致醫(yī)保系統(tǒng)破產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，研發(fā)AD的治療藥物具有重大的科學(xué)和應(yīng)用意義。

在過(guò)去的研究中，淀粉樣蛋白理論(Aβhypothesis)一直是公認(rèn)的AD病理機(jī)制和藥物AD藥物研發(fā)的焦點(diǎn)。然而，過(guò)去基于清除淀粉樣斑塊策略的藥物均遭失敗。這就需要研究者對(duì)AD病理變化的機(jī)制進(jìn)行重新檢討，從新的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)出發(fā)設(shè)計(jì)治療方案和發(fā)現(xiàn)新作用機(jī)制的藥物。

Aβ級(jí)聯(lián)反應(yīng)假說(shuō)的研究表明，老年階段的淀粉樣斑塊在AD相當(dāng)晚期才出現(xiàn)，而Aβ寡聚體才是破壞大腦功能完整性的首要因素。Aβ寡聚體具有神經(jīng)毒性，可引起神經(jīng)突觸損失，降低神經(jīng)元可塑性，改變能量代謝，引起氧化應(yīng)激和線粒體功能紊亂。因此未來(lái)AD研究的方向應(yīng)該是如何在腦神經(jīng)發(fā)生損傷前清除毒性的Aβ蛋白或抑制其毒性；

Aβ除了單獨(dú)作用外，也和Tau蛋白過(guò)度磷酸化相互關(guān)聯(lián)。AD患者病理性過(guò)度磷酸化時(shí)，Tau蛋白的正常功能受到了損害，由于激酶和磷酸酶催化活性之間的平衡被打破，引發(fā)Tau蛋白過(guò)度磷酸化。Tau蛋白過(guò)度磷酸化導(dǎo)致不溶性雙螺旋絲(PHF)形成，微管結(jié)合能力的喪失使細(xì)胞骨架不穩(wěn)定，最終引起神經(jīng)退行性病變和神經(jīng)元死亡。因此Tau蛋白可作為靶點(diǎn)在AD患者中進(jìn)行進(jìn)一步安全和有效性的探究；

Aβ不僅出現(xiàn)在神經(jīng)細(xì)胞中，而且在線粒體中也有相應(yīng)濃度。其可以抑制線粒體呼吸酶復(fù)合物II和IV，使ATP產(chǎn)生降低，ROS產(chǎn)量升高，最終導(dǎo)致線粒體功能紊亂；研究表明，Aβ累積還引起了線粒體分裂(Fis1)和融合(Mfn1/2和OPA1)蛋白表達(dá)的異常，打破線粒體正常的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致?lián)p傷線粒體清除減少，加劇神經(jīng)退行性病變。線粒體功能紊亂在AD進(jìn)程中十分關(guān)鍵，被認(rèn)為是治療AD的另一個(gè)重要靶點(diǎn)。

另外，AD和糖尿病分享著許多共同的病理現(xiàn)象，而且相互促進(jìn)彼此的病理進(jìn)程。在超過(guò)80％的AD患者身上，都有不正常的血糖水平或是胰島素抵抗癥狀，而且II型糖尿病人罹患AD的風(fēng)險(xiǎn)比健康人群高兩倍多?？固悄虿♀C化合物是人所共知的胰島素增敏劑，有可能通過(guò)消除胰島素抵抗發(fā)揮阻止AD疾病進(jìn)程的作用。一項(xiàng)臨床調(diào)查表明，富釩飲水的糖尿病人和非糖尿病人的腦認(rèn)知能力都保持較好。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問(wèn)題中存在的不足之處，本發(fā)明提供松柏醛或松柏醛和釩化合物組合物用于預(yù)防和治療神經(jīng)退行性病變的用途。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種松柏醛或松柏醛和釩化合物組合物用于預(yù)防和治療神經(jīng)退行性病變的用途，以松柏醛或松柏醛和釩化合物聯(lián)合的藥物組合物為原料，制備用于預(yù)防和治療神經(jīng)退行性病變阿爾茨海默癥的藥物或保健食品的用途。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述釩化合物包括無(wú)機(jī)釩化合物和有機(jī)釩化合物，所述無(wú)機(jī)釩化合物包括氧釩配合物、過(guò)氧釩配合物、羥胺釩配合物、釩的雜多酸配合物；所述有機(jī)釩化合物包括苯甲酸氧釩、阿司匹林氧釩、乙酰丙酮氧釩、雙(2-甲基-3-羥基-4-吡喃酮)氧釩(BMOV)、3-羥基-2-乙基-4-吡喃酮(BEOV)、3-羥基-2-異丙基-4-吡喃酮(BIOV)、3-羥基-2-正丁基-4-吡喃酮(BnBOV)、二(吡啶2-甲酸)氧釩(VO(Pa)2)、吡啶二甲酸氧釩(VO-DPA)、吡啶甲酸酞胺氧釩(VO-PAM)、甲基吡啶甲酸氧釩(VO-MPA)、吡啶甲酸氧釩(VO-PA)、丙二酸羥胺氧釩、草酸羥胺氧釩、纈氨酸羥胺氧釩、亮氨酸羥胺氧釩。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述釩化合物還包括以曲酸吡喃酮為母核，2位上引入抗氧化基團(tuán)合成的BSOV系列以及以氨基三乙酸為碳骨架引入具有羥基苯胺或羥基苯乙胺衍生物結(jié)構(gòu)的抗氧化功能配體制備的新型氧釩配合物(VOL1-VOL6)。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述松柏醛的濃度范圍在100μM-0.1μM內(nèi)均具有不同程度提升正常及Aβ過(guò)載條件下神經(jīng)細(xì)胞的活力。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，正常及Aβ過(guò)載條件下神經(jīng)細(xì)胞是以SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤及過(guò)量表達(dá)野生型淀粉樣前體蛋白(APP)和瑞士突變型淀粉樣前體蛋白(APPsw)的細(xì)胞。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用時(shí)間為12h、24h、36h、48h。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述松柏醛的濃度范圍在100μM-50μM內(nèi)與釩化合物的濃度為1μM的聯(lián)合使用效果最顯著。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述松柏醛的濃度為100μM時(shí)，與釩化合物的濃度為1μM的聯(lián)合使用在AD細(xì)胞及動(dòng)物模型上效果最優(yōu)。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，選用的阿爾茨海默癥動(dòng)物模型為APPswe/PS1dE9(APP/PS1)雙轉(zhuǎn)基因小鼠。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述神經(jīng)退行性病變?yōu)榘ò柎暮ＤY的所有神經(jīng)退行性疾病。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明公開(kāi)的松柏醛或松柏醛和釩化合物組合物用于預(yù)防和治療神經(jīng)退行性病變的用途，以松柏醛或松柏醛和釩化合物聯(lián)合的藥物組合物為原料，制備用于預(yù)防和治療神經(jīng)退行性病變阿爾茨海默癥的藥物或保健食品的用途；松柏醛或松柏醛和釩化合物組合物通過(guò)抑制Aβ毒性、抑制Tau蛋白過(guò)度磷酸化、恢復(fù)細(xì)胞線粒體功能、刺激神經(jīng)細(xì)胞再生、等機(jī)制，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，維持神經(jīng)細(xì)胞功能；釩化合物可能通過(guò)調(diào)節(jié)腦神經(jīng)細(xì)胞葡萄糖代謝和刺激神經(jīng)細(xì)胞再生保護(hù)阿爾茨海默癥、糖尿病和缺血性腦卒中模型動(dòng)物的神經(jīng)細(xì)胞活力和神經(jīng)認(rèn)知功能，食物成分的松柏醛和釩化合物聯(lián)合也可以開(kāi)發(fā)成預(yù)防阿爾茨海默癥的藥物或保健食品。

附圖說(shuō)明

圖1是MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1所制備的化合物松柏醛(4H3M)對(duì)Aβ過(guò)載神經(jīng)細(xì)胞APPwt和APPswe的細(xì)胞活力的影響；

圖2是MitoTracker線粒體選擇探針?lè)z測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1所制備的化合物松柏醛(4H3M)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Yneo的線粒體形態(tài)的影響；

圖3是MitoTracker線粒體選擇探針?lè)z測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1所制備的化合物松柏醛(4H3M)對(duì)Aβ過(guò)載神經(jīng)細(xì)胞APPwt的線粒體形態(tài)的影響；

圖4是MitoTracker線粒體選擇探針?lè)z測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1所制備的化合物松柏醛(4H3M)對(duì)Aβ過(guò)載神經(jīng)細(xì)胞APPswe的線粒體形態(tài)的影響；

圖5是Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1所制備的化合物松柏醛(4H3M)及松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)對(duì)APPswe/PS1dE9(APP/PS1)動(dòng)物模型的大腦皮層及海馬組織中Aβ寡聚以及Tau蛋白磷酸化的影響；

圖6是免疫組化染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1所制備的化合物松柏醛(4H3M)及松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)對(duì)APPswe/PS1dE9(APP/PS1)動(dòng)物模型的大腦皮層及海馬組織中Aβ寡聚的影響；

圖7是尼氏染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1所制備的化合物松柏醛(4H3M)及松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)對(duì)APPswe/PS1dE9(APP/PS1)動(dòng)物模型的海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞的影響。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明提供一種松柏醛或松柏醛和釩化合物組合物用于預(yù)防和治療神經(jīng)退行性病變的用途，以松柏醛或松柏醛和釩化合物聯(lián)合的藥物組合物為原料，制備用于預(yù)防和治療神經(jīng)退行性病變阿爾茨海默癥的藥物或保健食品的用途。

其中，釩化合物是包括所有無(wú)機(jī)釩化合物和有機(jī)釩化合物，無(wú)機(jī)釩化合物包括氧釩配合物、過(guò)氧釩配合物、羥胺釩配合物、釩的雜多酸配合物等，包括苯甲酸氧釩、阿司匹林氧釩、乙酰丙酮氧釩、雙(2-甲基-3-羥基-4-吡喃酮)氧釩(BMOV)、3-羥基-2-乙基-4-吡喃酮(BEOV)、3-羥基-2-異丙基-4-吡喃酮(BIOV)、3-羥基-2-正丁基-4-吡喃酮(BnBOV)、二(吡啶2-甲酸)氧釩(VO(Pa)2)、吡啶二甲酸氧釩(VO-DPA)、吡啶甲酸酞胺氧釩(VO-PAM)、甲基吡啶甲酸氧釩(VO-MPA)、吡啶甲酸氧釩(VO-PA)、丙二酸羥胺氧釩、草酸羥胺氧釩、纈氨酸羥胺氧釩、亮氨酸羥胺氧釩等及本課題組發(fā)明的以曲酸吡喃酮為母核，2位上引入抗氧化基團(tuán)合成的BSOV等系列以及以氨基三乙酸為碳骨架引入具有羥基苯胺或羥基苯乙胺衍生物結(jié)構(gòu)的抗氧化功能配體制備的新型氧釩配合物(VOL1-VOL6)等所有釩化合物。

優(yōu)選的，所述濃度范圍100μM-0.1μM均具有不同程度提升正常及Aβ過(guò)載條件下神經(jīng)細(xì)胞的活力，其中濃度范圍在100μM-50μM之間提升正常及Aβ過(guò)載條件下神經(jīng)細(xì)胞的活力的能力最顯著。正常及Aβ過(guò)載條件下神經(jīng)細(xì)胞是以SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤及過(guò)量表達(dá)野生型淀粉樣前體蛋白(APP)和瑞士突變型淀粉樣前體蛋白(APPsw)的細(xì)胞(分別簡(jiǎn)稱為SH-SY5Yneo細(xì)胞、APPwt細(xì)胞、APPswe細(xì)胞)。藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用時(shí)間為12h、24h、36h、48h，其中36h效果最明顯。

優(yōu)選的，所述松柏醛的濃度范圍在100μM-50μM與釩化合物的濃度為1μM的聯(lián)合使用效果最顯著，所述松柏醛的濃度為100μM最優(yōu)。

優(yōu)選的，所述松柏醛的濃度范圍在50μM-100μM與釩化合物的濃度為1μM的聯(lián)合使用效果最顯著，所述松柏醛的濃度為100μM時(shí)，與釩化合物的濃度為1μM的聯(lián)合使用在AD細(xì)胞及動(dòng)物模型上效果最優(yōu)。

優(yōu)選的，選用的阿爾茨海默癥動(dòng)物模型為APPswe/PS1dE9(APP/PS1)雙轉(zhuǎn)基因小鼠。

優(yōu)選的，所述神經(jīng)退行性病變?yōu)榘ò柎暮ＤY的所有神經(jīng)退行性疾病。

本發(fā)明的目的在于以disease modification為目標(biāo)，發(fā)現(xiàn)能對(duì)以上關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)發(fā)揮作用的抗阿爾茨海默癥化學(xué)藥物。

松柏醛是一種食物成分，它主要用作生物測(cè)定、抗生素或生化藥品中含量或效價(jià)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。其中白蘭地中松柏醛的含量為1.68-2.8mg/L，松柏醛還存在于多種中藥材中，如杜仲刺、五加、竹茹、蘆根、蜂膠等。但目前并沒(méi)有關(guān)于松柏醛的臨床藥用資料，在查閱的相關(guān)文獻(xiàn)中，有關(guān)于植物源抑菌活性成分的研究表明，從灰胡桃中提取的松柏醛成分具有抑菌及抗菌等功效；從畬藥半邊風(fēng)中分離的化學(xué)成分松柏醛具有一定的抑制大鼠中性粒細(xì)胞(PMN)呼吸爆發(fā)的作用等。

有文獻(xiàn)表明松柏醛可能是肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)的一種產(chǎn)物。肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)是催化木質(zhì)素特異途徑的第一個(gè)限速酶，可能對(duì)木質(zhì)素生物合成途徑具有潛在的調(diào)控作用。由于松柏醛廣泛存在于多種植物中，因此認(rèn)為它可能是存在于植物木質(zhì)部的一種化學(xué)成分。

近些年來(lái)，從中藥成分中發(fā)現(xiàn)抗AD藥物一直是研究者的重點(diǎn)之一。之前有研究表明，肉桂及其提取物(主要活性成分是花青素)在AD細(xì)胞及動(dòng)物模型上具有一定的防治功效。我們則在細(xì)胞層次深入研究了肉桂的另一主要成分肉桂醛的作用及其分子機(jī)制。進(jìn)而，在此基礎(chǔ)上，本文以Aβ過(guò)度分泌的SH-SY5Y細(xì)胞為研究模型，用高效快捷的MTS法為篩選方法，著眼于Aβ和線粒體作用靶點(diǎn)，從多種中藥活性成分庫(kù)中篩選出了具有良好抗AD活性的化合物松柏醛(4H3M)。我們的研究表明，其能提升正常及Aβ過(guò)載條件下神經(jīng)細(xì)胞的活力，具有較好的抑制Aβ寡聚等功效。松柏醛(4H3M)是4-羥基肉桂醛類物質(zhì)中的一種，本發(fā)明以松柏醛(4H3M)作為藥物模型，研究其預(yù)防及治療AD的作用。我們初步的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，松柏醛(4H3M)通過(guò)：

①、抑制Aβ毒性

②、抑制Tau蛋白過(guò)度磷酸化

③、恢復(fù)細(xì)胞線粒體功能

④、刺激神經(jīng)細(xì)胞再生

等機(jī)制，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，維持神經(jīng)細(xì)胞功能。分析松柏醛的化學(xué)結(jié)構(gòu)可發(fā)現(xiàn)，其活性表現(xiàn)與分子結(jié)構(gòu)中的酚羥基及α,β-不飽和醛酮結(jié)構(gòu)有關(guān)。其中酚羥基的化學(xué)環(huán)境，酚羥基所處空間環(huán)境的擁擠狀態(tài)都會(huì)影響化合物的活性。

另外，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，Aβ負(fù)擔(dān)與金屬代謝紊亂、胰島素抵抗等相互循環(huán)加劇神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和Tau過(guò)度磷酸化等對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷?；诳固悄虿♀C化合物的分子機(jī)制和前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們首次提出抗糖尿病金屬化合物有可能通過(guò)消除胰島素抵抗和提高細(xì)胞抗氧化能力、有效降低Aβ負(fù)擔(dān)及其神經(jīng)損傷，從而阻止AD病理進(jìn)程和保護(hù)神經(jīng)“認(rèn)知儲(chǔ)備”。松柏醛在作用上與必需生物元素釩具有顯著協(xié)同性。我們及文獻(xiàn)的研究初步表明，釩化合物可能通過(guò)調(diào)節(jié)腦神經(jīng)細(xì)胞葡萄糖代謝和刺激神經(jīng)細(xì)胞再生保護(hù)阿爾茨海默癥、糖尿病和缺血性腦卒中模型動(dòng)物的神經(jīng)細(xì)胞活力和神經(jīng)認(rèn)知功能。食物成分的松柏醛和釩制劑聯(lián)合也可以開(kāi)發(fā)成預(yù)防阿爾茨海默癥的保健食品。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述：

實(shí)施例1

松柏醛(4H3M)及松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)化合物(4H3M+VAC)組合物制劑的制備

稱取17.18mg(0.1mmol)松柏醛(4H3M)，取10mL DMSO溶解，配置成濃度為10mM的松柏醛(4H3M)母液；取100μL的松柏醛(4H3M)母液(10mM)稀釋于9.9mL的DMEM(含10％血清)中制得200μM的松柏醛(4H3M)溶液；然后分別將200μM的松柏醛(4H3M)溶液稀釋至100μM、50μM、10μM、5μM、1μM、0.5μM、0.1μM制得不同濃度的松柏醛(4H3M)溶液。

稱取26.51mg(0.1mmol)乙酰丙酮氧釩(VAC)，取10mL蒸餾水溶解，配置成濃度為10mM的乙酰丙酮氧釩(VAC)母液；取10μL的乙酰丙酮氧釩(VAC)母液(10mM)稀釋于9.99mL的DMEM(含10％血清)中制得10μM的乙酰丙酮氧釩(VAC)溶液；然后將10μM的乙酰丙酮氧釩(VAC)溶液稀釋至2μM；將200μM的松柏醛(4H3M)溶液與2μM的乙酰丙酮氧釩(VAC)溶液以1:1的比例混合制得松柏醛(4H3M)和乙酰丙酮氧釩(VAC)的終濃度分別為100μM和1μM的松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)化合物(4H3M+VAC)組合物制劑。

實(shí)施例2

MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力

細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)和傳代：細(xì)胞置于37℃，5％CO₂的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM(含10％胎牛血清)，100μM G418，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。(1)培養(yǎng)基、胰酶和PBS于37℃水浴鍋中預(yù)熱；(2)棄掉培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，取2ml PBS加入25cm³的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，清洗細(xì)胞表面3次，并棄去PBS；(3)加入1mL 0.25％胰酶消化細(xì)胞，鏡下觀察待細(xì)胞形態(tài)略有變化，則在超凈臺(tái)中把胰酶倒掉留取約100μL，將細(xì)胞置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3min至消化完全；(4)用2mL細(xì)胞培養(yǎng)基中止消化，并吹打培養(yǎng)瓶瓶壁，將細(xì)胞移入離心管中，1000rpm離心3min；(5)離心后棄上清，加1mL新鮮DMEM(含10％胎牛血清)于培養(yǎng)瓶中吹打混勻細(xì)胞，按合適比例進(jìn)行細(xì)胞傳代，在瓶身標(biāo)記好細(xì)胞名稱、代數(shù)及傳代日期并放入孵箱。

MTS法：

(1)接種細(xì)胞：用DMEM(含10％胎牛血清)培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液后，以每孔3000-4000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，每孔體積100μL；(2)細(xì)胞約60％融合后加入藥物作用36h；3)用DMEM(含10％胎牛血清)培養(yǎng)基配置10％的MTS溶液，藥物作用36h后棄去原培養(yǎng)孔中的溶液，每孔加10％MTS溶液100ul，繼續(xù)孵育2h；(3)2h后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光吸收值(激發(fā)波長(zhǎng)為490nm)，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制藥物作用曲線。

如圖1所示MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)化合物松柏醛(4H3M)對(duì)Aβ過(guò)載神經(jīng)細(xì)胞APPwt和APPswe的細(xì)胞活力的影響；根據(jù)圖1可知，松柏醛(4H3M)濃度范圍100μM-0.1μM均具有不同程度提升正常及Aβ過(guò)載條件下神經(jīng)細(xì)胞的活力，其中濃度范圍在100μM-50μM之間提升正常及Aβ過(guò)載條件下神經(jīng)細(xì)胞的活力的能力最顯著。

實(shí)施例3

MitoTracker線粒體選擇探針?lè)z測(cè)細(xì)胞線粒體形態(tài)

Red CMXRos是一種細(xì)胞滲透型的X-rosamine衍生物，包含標(biāo)記線粒體的弱巰基反應(yīng)性的氯甲基官能團(tuán)。其為一種氧化型的紅色熒光染料(Ex＝579nm，Em＝599nm)，只需簡(jiǎn)單孵育細(xì)胞，即可被動(dòng)運(yùn)輸穿過(guò)細(xì)胞膜并直接聚集在活性線粒體上，可以用來(lái)觀測(cè)線粒體形態(tài)。(1)按實(shí)施例2將SH-SY5Y Neo，APPwt和APPswe三種細(xì)胞分別鋪于35mm²的confocal皿中；(2)待細(xì)胞融合約40-50％后加入濃度為100μM松柏醛(4H3M)溶液作用36h；(3)除去舊培養(yǎng)基，加入含50nMMitoTracker Red CMXRos的無(wú)血清培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱中孵育10min；(3)10min后，除去原培養(yǎng)基，加入無(wú)血清培養(yǎng)基輕輕晃動(dòng)，清洗三次；(4)激光共聚焦顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)579nm，發(fā)射波長(zhǎng)599nm)觀察線粒體形態(tài)。

如圖2，3，4所示MitoTracker線粒體選擇探針?lè)▽?shí)驗(yàn)檢測(cè)化合物松柏醛(4H3M)對(duì)SH-SY5Yneo細(xì)胞和Aβ過(guò)載神經(jīng)細(xì)胞APPwt和APPswe的線粒體形態(tài)的影響；根據(jù)圖2，3，4可知，松柏醛(4H3M)濃度為100μM可減少三種細(xì)胞的非正常的橢圓型線粒體，重塑正常的絲狀線型線粒體形態(tài)的功能，通過(guò)重建線粒體形態(tài)，恢復(fù)線粒體功能，從而抵抗Aβ毒性。

實(shí)施例4

動(dòng)物模型和藥物治療

8周的雌性APPswe/PS1dE9(APP/PS1)動(dòng)物模型15只，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、松柏醛(4H3M)組和松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)(4H3M+VAC)組合物制劑組，每組5只，2-3只/籠飼養(yǎng)，12/12h明暗周期，環(huán)境溫度為22-26℃。待鼠齡為12周左右，按如下方法飼喂：

●對(duì)照組APP/PS1鼠：普通飼料喂養(yǎng)；

●松柏醛(4H3M)組APP/PS1鼠：以含0.2mmol/kg/day將松柏醛(4H3M)均勻摻入飼料中喂養(yǎng)；

●松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)(4H3M+VAC)組合物制劑組APP/PS1鼠：以含0.2mmol/kg/day的松柏醛(4H3M)和含0.1mmol/kg/day的乙酰丙酮氧釩(VAC)均勻摻入飼料中喂養(yǎng)；

實(shí)施例5

跳臺(tái)行為學(xué)檢測(cè)

按實(shí)施例4飼喂3組APP/PS1鼠，分別于3個(gè)月及4個(gè)月之后進(jìn)行跳臺(tái)行為學(xué)檢測(cè)，測(cè)試3組APP/PS1鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力。

跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)：用不透明黑色擋板分隔成8室，每室120mm×120mm×180mm，室底電柵可通電。將參加實(shí)驗(yàn)的各組APP/PS1鼠先放入反應(yīng)箱內(nèi)自由活動(dòng)5min，熟悉環(huán)境，然后接通銅柵電源(0.25mA)，小鼠受到電擊后其正常反應(yīng)是尋找安全跳臺(tái)以躲避電擊。各組小鼠從受到電擊到首次尋找到安全跳臺(tái)，記錄第1次跳下平臺(tái)的時(shí)間(潛伏期)和5min內(nèi)從安全跳臺(tái)跳下的錯(cuò)誤次數(shù)(基礎(chǔ)錯(cuò)誤次數(shù))，作為學(xué)習(xí)測(cè)試成績(jī)；1天后重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，記錄各組小鼠第1次跳下安全跳臺(tái)的時(shí)間(潛伏期)和5min內(nèi)受到的電擊次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))，作為記憶測(cè)試成績(jī)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，若小鼠停留在安全跳臺(tái)的時(shí)間超過(guò)5min，其潛伏期以5min計(jì)算。

表1是跳臺(tái)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1所制備的化合物松柏醛(4H3M)及松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)給藥3個(gè)月時(shí)間對(duì)APPswe/PS1dE9(APP/PS1)動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)和記憶的影響。

表2是跳臺(tái)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1所制備的化合物松柏醛(4H3M)及松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)給藥4個(gè)月時(shí)間對(duì)APPswe/PS1dE9(APP/PS1)動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)和記憶的影響。

表1

表2

根據(jù)表1和表2的跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在給藥三個(gè)月之后，與對(duì)照組相比，松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)(4H3M+VAC)組合物制劑組的AD鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力均得到了明顯的改善；給藥四個(gè)月之后，松柏醛(4H3M)組和松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)(4H3M+VAC)組合物制劑組的AD鼠的記憶能力均得到了明顯的改善，與對(duì)照組相比具有顯著性差異。

實(shí)施例6

Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

按實(shí)施例4飼喂3組APP/PS1鼠，6.5個(gè)月之后脫頸處死，取腦組織(去除嗅球和小腦)，分成左右兩個(gè)半球。取其中一個(gè)半球于液氮中凍存，取其大腦皮層和海馬區(qū)組織研磨，用加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的提取液提取可溶性的Aβ蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，將上樣緩沖液與各蛋白樣品充分混勻，100℃水浴鍋中煮樣5-10min。

Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Aβ寡聚：(1)配膠：配置15％分離膠和5％濃縮膠；(2)電泳：每孔上樣15μg蛋白，低電壓50V，30min，以溴酚藍(lán)為指示，待前沿跑過(guò)濃縮膠后調(diào)整電壓為120V，繼續(xù)電泳約90min待溴酚藍(lán)前沿跑出分離膠，即可停止電泳；(3)轉(zhuǎn)膜：200V，100min，轉(zhuǎn)膜期間及時(shí)降溫，電流不可超過(guò)400mA；(4)封閉：5％脫脂奶粉搖床封閉1.5h-2h；(5)孵育抗體：稀釋6E10一抗至說(shuō)明書比例，搖床4℃過(guò)夜；取出膜，用TBST洗膜，每次10min，洗三次；按照說(shuō)明書比例稀釋相應(yīng)二抗，室溫下?lián)u床孵育60min；TBST洗膜三次，每次20min；(6)曝光。

Tau蛋白磷酸化的檢測(cè)步驟(1)(2)(3)(4)同上，(5)孵育抗體：稀釋Tau蛋白一抗至說(shuō)明書比例，搖床4℃過(guò)夜；取出膜，用TBST洗膜，每次10min，洗三次；按照說(shuō)明書比例稀釋相應(yīng)二抗，室溫下?lián)u床孵育60min；TBST洗膜三次，每次20min；(6)曝光。

GAPDH蛋白的檢測(cè)：將曝光后的PVDF膜用蛋白印記再生液洗滌，然后用TBST洗膜10min，然后按上述同樣方法孵育一抗和二抗，曝光。

如圖5所示W(wǎng)estern Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組、松柏醛(4H3M)組和松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)(4H3M+VAC)組合物制劑組這三組AD鼠的腦組織中的可溶性Aβ蛋白的含量以及Tau蛋白磷酸化的情況；根據(jù)圖5所知，與對(duì)照組相比，松柏醛(4H3M)組和松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)(4H3M+VAC)組合物制劑組的AD鼠大腦中可溶性Aβ蛋白的含量顯著降低，磷酸化Tau蛋白的含量顯著減少，證明松柏醛(4H3M)和4H3M+VAC組合物能夠顯著抑制Aβ蛋白的寡聚，并減少Tau蛋白的磷酸化。

實(shí)施例7

免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)APP/PS1鼠腦組織中Aβ斑塊沉積

按實(shí)施例4飼喂3組APP/PS1鼠，6.5個(gè)月之后脫頸處死，取腦組織(去除嗅球和小腦)，分成左右兩個(gè)半球。取其中一個(gè)半球于4％福爾馬林溶液中固定48h，制作石蠟切片，切片厚約5μm。(1)石蠟切片脫蠟至水；(2)3％H₂O₂室溫孵育5-10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；(3)蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min，兩次；(4)5-10％正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10min，棄去血清，稀釋6E10一抗至說(shuō)明書比例，滴加一抗工作液，37℃孵育1-2h；(5)PBS沖洗，5min，3次；(6)滴加適量生物素化標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育30min；(7)PBS沖洗，5min，3次；(8)滴加適量的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10-30min；(9)PBS沖洗，5min，3次；(10)DAB顯色5min；(11)自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。(11)置于顯微鏡下觀察拍照。

如圖6所示免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組、松柏醛(4H3M)組和松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)(4H3M+VAC)組合物制劑組這三組AD鼠的腦組織中的Aβ蛋白沉積的情況；根據(jù)圖6所知，與對(duì)照組相比，松柏醛(4H3M)組和松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)(4H3M+VAC)組合物制劑組的AD鼠大腦中Aβ蛋白沉積有所減少，在高倍鏡下觀察，蛋白沉積斑塊的體積大小及個(gè)數(shù)都有所減少。

實(shí)施例8

尼氏染色法檢測(cè)APP/PS1鼠腦組織中海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞

按實(shí)施例4飼喂3組APP/PS1鼠，6.5個(gè)月之后脫頸處死，取腦組織(去除嗅球和小腦)，分成左右兩個(gè)半球。取其中一個(gè)半球于4％福爾馬林溶液中固定48h，制作石蠟切片，切片厚約5μm。首先切片置于焦油紫染料中染缸中，56℃孵育1h，酒精燈上加溫約10min，蒸餾水沖洗后，分化1-3min，顯微鏡下觀察至背景無(wú)色為止；無(wú)水乙醇迅速脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固；置于顯微鏡下觀察拍照。

如圖7所示尼氏染色法實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組、松柏醛(4H3M)組和松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)(4H3M+VAC)組合物制劑組這三組AD鼠的腦組織的海馬區(qū)；根據(jù)圖7所知，與對(duì)照組相比，松柏醛(4H3M)組和松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)(4H3M+VAC)組合物制劑組的AD鼠大腦中海馬區(qū)的存在大量的尼氏體，與對(duì)照組有顯著性差異。由于尼氏體是神經(jīng)元內(nèi)合成蛋白質(zhì)的重要部位，當(dāng)神經(jīng)元受到刺激后，胞體內(nèi)的尼氏體會(huì)明顯減少，因此證明4H3M和4H3M+VAC兩組藥物能夠保護(hù)神經(jīng)元或具有刺激神經(jīng)元再生的功能。

實(shí)施例9

APP/PS1鼠的腦重檢測(cè)

按實(shí)施例4飼喂3組APP/PS1鼠，6.5個(gè)月之后脫頸處死，取心、肝、腎和腦組織(去除嗅球和小腦)分別稱重，比較三組APP/PS1鼠的各臟器重量的差異。

表3所示臟器稱重實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組、松柏醛(4H3M)組和松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)(4H3M+VAC)組合物制劑組這三組APPswe/PS1dE9(APP/PS1)動(dòng)物模型在給藥6.5個(gè)月之后的心、肝、腎和腦組織的重量。

表3

根據(jù)表3所顯示的對(duì)照組、松柏醛(4H3M)組和松柏醛(4H3M)聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)(4H3M+VAC)組合物制劑組這三組AD鼠在給藥6.5個(gè)月之后的心、肝、腎和腦組織的重量，發(fā)現(xiàn)松柏醛(4H3M)組和松柏醛(4H3M) 聯(lián)合乙酰丙酮氧釩(VAC)(4H3M+VAC)組合物制劑組的AD鼠腦重均比對(duì)照組重，結(jié)果表明，這兩組藥物可能具有保護(hù)神經(jīng)元、刺激神經(jīng)元再生的作用。

本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程及所應(yīng)用的SH-SY5Y等三種細(xì)胞模型和APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD動(dòng)物模型，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程和AD細(xì)胞和動(dòng)物模型，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程和AD細(xì)胞和動(dòng)物模型才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品的任何結(jié)構(gòu)的改變及釩化合物的等效替換等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。