本發(fā)明是在韓國(guó)教育部的支援下根據(jù)項(xiàng)目編號(hào)NN11700實(shí)現(xiàn)的，上述項(xiàng)目的研究管理專業(yè)機(jī)關(guān)為韓國(guó)研究財(cái)團(tuán)，研究事業(yè)名稱為“支援一般研究者事業(yè)(基本)”，研究項(xiàng)目名稱為“開發(fā)與用于治療急性骨髓性白血病的口服用FMS樣酪氨酸激酶3(FLT3)抑制劑相關(guān)的研究”，主管機(jī)關(guān)為光州科學(xué)技術(shù)院，研究期間為2013年11月1日至2014年10月31日。

本專利申請(qǐng)主張2014年6月2日在韓國(guó)專利廳提交的韓國(guó)專利申請(qǐng)第10-2014-0067083號(hào)的優(yōu)先權(quán)，上述專利申請(qǐng)的公開內(nèi)容作為參照引入本說(shuō)明書中。

本發(fā)明涉及包含葉綠素a或脫鎂葉綠酸a的皮膚狀態(tài)改善用組合物。

背景技術(shù)：

皺紋、下垂及松弛是由環(huán)境因素和遺傳因素，如紫外線(UV)、紅外線及激素的變化等各方面引起的皮膚老化的特征[1、2]。老化的皮膚的結(jié)構(gòu)特征主要表現(xiàn)為真皮(dermis)的變化，而真皮由膠原(collagen)、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid)、彈性蛋白(elastin)、纖維連接蛋白(fibronectin)、蛋白聚糖(proteoglycan)及其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)(extracellular matrix protein)形成。在這種結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)要素中，主要由成纖維細(xì)胞(fibroblast)合成的第一型膠原在皮膚結(jié)合組織中，作為最豐富的蛋白質(zhì)，對(duì)皮膚起支援強(qiáng)度和彈力性的作用[3]。

長(zhǎng)期暴露于紫外線下成為早期皮膚老化或光輻射皮膚老化的主要原因[23]。光輻射皮膚老化可解釋為由紫外線造成的反復(fù)性的炎癥過(guò)程所引起的。皮膚炎癥生產(chǎn)出多種基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，這將會(huì)在真皮及表皮中以非正常方式分解細(xì)胞外基質(zhì)，且引起喪失功能的基質(zhì)結(jié)構(gòu)要素的蓄積[24]。因基質(zhì)分解和皮膚炎癥等，而所積累的皮膚損傷會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)過(guò)多的基質(zhì)金屬蛋白酶，且這與皺紋的形成有關(guān)。

據(jù)報(bào)告，多種化合物及植物提取物對(duì)皮膚具有抑制炎癥及改善皺紋的效果。對(duì)動(dòng)物范例(無(wú)毛小鼠)口服給藥維生素C、E、碧容健及月見(jiàn)草油(evening primrose oil)復(fù)合體的情況下，具有可以緩解因長(zhǎng)期暴露于紫外線而產(chǎn)生的皺紋的效果[27]。據(jù)報(bào)告，人參成分、鞣花酸(ellagic acid)及綠茶的多酚(polyphenol)也具有改善由紫外線引起的皮膚老化的效果[28、29、30]。被解釋為，大多數(shù)的多酚的皺紋改善效果與抗氧化作用有關(guān)[30]，呈現(xiàn)改善皺紋效果的作用方式與基質(zhì)金屬蛋白酶的生成抑制有關(guān)。

在本發(fā)明中，發(fā)明人們發(fā)現(xiàn)了葉綠素a(Chlorophyll a)及脫鎂葉綠酸a(Pheophorbide a)具有緩解由紫外線引起的皮膚炎癥，及改善皺紋的效果。并且，脫鎂葉綠酸a呈現(xiàn)出了抑制由紫外線誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶生產(chǎn)的效果。這種研究結(jié)果表現(xiàn)出葉綠素a及脫鎂葉綠酸a可以以皮膚狀態(tài)改善用物質(zhì)來(lái)被使用。

在本說(shuō)明書全文中參照了多篇論文及專利文獻(xiàn)，且其引用有所標(biāo)記。所引用的論文及專利文獻(xiàn)的公開內(nèi)容，作為參照其全部插入于本說(shuō)明書中，從而明確說(shuō)明了本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的水準(zhǔn)及本發(fā)明的內(nèi)容。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問(wèn)題

本發(fā)明人們?yōu)榱碎_發(fā)能夠有效改善如紫外線等外部刺激引起的皮膚損傷的物質(zhì)，研究并作出了努力。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葉綠素a及脫鎂葉綠酸a對(duì)如皮膚皺紋的改善及皮膚炎癥的緩解等皮膚狀態(tài)改善非常有效，從而完成了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明的目的為提供皮膚狀態(tài)改善用組合物。

本發(fā)明的另一目的及益處根據(jù)下述的發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明、發(fā)明要求保護(hù)范圍及附圖來(lái)更加明確。

解決問(wèn)題的方案

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，本發(fā)明提供皮膚狀態(tài)改善用組合物，包含葉綠素a或脫鎂葉綠酸a有效成分。

根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施方式，本發(fā)明提供紫外線引起的皮膚損傷預(yù)防、改善或治療用組合物，包含葉綠素a或脫鎂葉綠酸a作為有效成分。

根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，本發(fā)明提供曬傷預(yù)防或治療用組合物，包含葉綠素a或脫鎂葉綠酸a作為有效成分。

本發(fā)明人們?yōu)榱碎_發(fā)能夠有效改善如紫外線等外部刺激引起的皮膚損傷狀態(tài)的物質(zhì)，研究并作出了努力，其結(jié)果確認(rèn)到，葉綠素a及脫鎂葉綠酸a對(duì)如皮膚皺紋的改善及皮膚炎癥的緩解等皮膚狀態(tài)改善非常有效。

葉綠素(Chlorophyll)作為在植物中最豐富的成分，一般在以3:1至3:2的比率具有a、b型，存在于高等植物中。傳統(tǒng)上，植物的葉綠素通過(guò)抗-炎癥效果來(lái)用于管理傷口、燒傷及潰瘍等的受傷[4]，也作為用于增進(jìn)健康的健康食品來(lái)使用過(guò)[5]。此外，包含葉綠素的植物提取物的化妝品組合物也為了管理皮膚損傷而被使用[6]。

葉綠素生成多個(gè)種類的派生物，而其中包含脫鎂葉綠素(pheophytin)、脫鎂葉綠酸(pheophorbide)、氯(chlorin)及植烷酸(phytanic acid)。以往的研究者闡明了包含葉綠素、脫鎂葉綠素及脫鎂葉綠酸的葉綠素派生物具有潛在的化學(xué)性癌預(yù)防功能[7、8]。并且，還闡明了，成罐頭的綠色蔬菜共同包含的脫鎂葉綠素、原焦脫鎂葉綠酸(pyropheophytin)及脫鎂葉綠酸派生物具有潛在腫瘤抑制效果[9、10]?？芍氖牵撴V葉綠酸也用作對(duì)于癌進(jìn)行光動(dòng)力學(xué)治療的光毒性(phototoxic)物質(zhì)[11]。但是，現(xiàn)在還不知道脫鎂葉綠酸或葉綠素對(duì)皮膚皺紋改善具有何種效果。

本說(shuō)明書中的“皮膚狀態(tài)改善”雖然意味著改善皮膚皺紋、緩解皮膚炎癥或防止皮膚老化，但不局限于此。

皮膚皺紋是由包括陽(yáng)光的多種因素引起真皮中的膠原纖維、彈力纖維等發(fā)生變性，且由于皮膚水分減少則皮膚彈性下降，從而皮膚發(fā)生折疊而形成的。在多種因素中紫外線為最主要的原因。

根據(jù)本發(fā)明任一實(shí)施例，若對(duì)小鼠照射紫外線后，口服給藥葉綠素a或脫鎂葉綠酸a，則具有改善皺紋的效果。

在皮膚炎癥反應(yīng)中免疫細(xì)胞的活性起重要的作用。被活化的免疫細(xì)胞或免疫細(xì)胞生產(chǎn)的細(xì)胞因子等通過(guò)不斷刺激周圍輔助細(xì)胞引起細(xì)胞的過(guò)度的活化或細(xì)胞凋亡，來(lái)誘發(fā)組織的破壞等副作用，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。在皮膚炎癥反應(yīng)中，黏附分子(adhesion molecule)在角化細(xì)胞(kerat inocyte)、單核細(xì)胞(monocyte)及淋巴細(xì)胞(lymphocyte)間的結(jié)合中起重要的作用，而黏附分子包括細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1(Intracel lular adhesion molecule-l，ICAM-l)、血管粘附分子-1(vascular adhesion molecules-1，VCAM-1)和E-選擇(E-selection)等。如上所述的黏附分子將多種免疫相關(guān)細(xì)胞用皮膚組織浸潤(rùn)，從而通過(guò)皮膚細(xì)胞和免疫細(xì)胞間的各種相互反應(yīng)來(lái)引發(fā)了炎癥反應(yīng)。因此，抑制這種粘合分子的表達(dá)，從而可以緩解皮膚炎癥的反應(yīng)。

根據(jù)本發(fā)明的任一實(shí)施例，在對(duì)小鼠照射紫外線后口服給藥葉綠素a或脫鎂葉綠酸a的情況下，細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1的表達(dá)降低，且真皮中的炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)也減少了。這種結(jié)果表明，葉綠素a或脫鎂葉綠酸a具有緩解由紫外線引起的皮膚炎癥反應(yīng)的效果。

皮膚老化根據(jù)對(duì)老化的影響因素可分為內(nèi)因性老化(intrinsic aging)和外因性老化(extrinsic aging)。內(nèi)因性老化為隨著年齡的增長(zhǎng)皮膚的結(jié)構(gòu)和生理功能與環(huán)境無(wú)關(guān)的減退，外因性老化是因?yàn)槠つw長(zhǎng)時(shí)間暴露于太陽(yáng)光等外部環(huán)境而產(chǎn)生的。尤其，將光造成的老化稱為光輻射皮膚老化(photoaging)，紫外線會(huì)成為皮膚老化的生理學(xué)及形態(tài)學(xué)變化的主要原因。因紫外線生成有害活性氧后，若無(wú)法借助體內(nèi)的多種保護(hù)裝置來(lái)有效地去除，則會(huì)引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)來(lái)造成皮膚損傷。

本發(fā)明的葉綠素a或脫鎂葉綠酸a具有改善紫外線引起的皮膚皺紋及緩解皮膚炎癥的效果，這意味著，在皮膚老化中具有改善由光輻射皮膚老化引起的皮膚狀態(tài)的效果。

紫外線分為紫外線A(UVA，200～280nm)、紫外線B(UVB，280～320nm)、紫外線C(UVC，320～400nm)三種，紫外線C基本上被臭氧層吸收，只有紫外線A和紫外線B到達(dá)地表，而對(duì)皮膚產(chǎn)生影響。尤其，其中紫外線B為在紫外線中對(duì)皮膚造成的損傷最為嚴(yán)重。紫外線B到達(dá)真皮上部，迅速引起燒傷或紅斑，若進(jìn)一步進(jìn)行，則形成皮膚表層黑色素且造成色素的沉積，還會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞的增殖、DNA損傷等，從而誘發(fā)皮膚皺紋及皮膚癌。并且，據(jù)悉還會(huì)在皮膚細(xì)胞中誘發(fā)炎癥反應(yīng)。

如上所述，本發(fā)明的葉綠素a或脫鎂葉綠酸a呈現(xiàn)出改善紫外線引起的皮膚皺紋及緩解皮膚炎癥的效果，可有效地用于預(yù)防、改善及治療紫外線引起的皮膚損傷。

本說(shuō)明書中“曬傷(sunburn)”的主要原因?yàn)樽贤饩€，若紫外接到達(dá)皮膚上，則不僅直接作用于血管壁，而且大部分被皮膚細(xì)胞吸收來(lái)進(jìn)行刺激，使得分泌組織胺、前列腺素等炎癥物質(zhì)。其炎癥物質(zhì)通過(guò)增加血管壁的滲透性來(lái)將炎癥細(xì)胞從血管移動(dòng)至皮膚組織。即，由于紫外線皮膚發(fā)生炎癥反應(yīng)，從而出現(xiàn)紅斑、熱疳、疼痛、浮腫等癥狀。因此，若抑制炎癥細(xì)胞在血管中向皮膚組織浸潤(rùn)，則抑制炎癥反應(yīng)，從而可以預(yù)防或治療曬傷。

根據(jù)本發(fā)明的任一實(shí)施例，在對(duì)小鼠照射紫外線后口服給藥葉綠素a或脫鎂葉綠酸a的情況下，在真皮減少了炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。

根據(jù)本發(fā)明的任一實(shí)施例，向人體皮膚纖維芽細(xì)胞中照射紫外線后用脫鎂葉綠酸a處理的情況下，減少了基質(zhì)金屬蛋白酶-1及基質(zhì)金屬蛋白酶-3的生產(chǎn)。

基質(zhì)金屬蛋白酶為鉛-依賴性的肽鏈內(nèi)切酶。它們可以分解所有種類的細(xì)胞外基質(zhì)，且在細(xì)胞的增殖、分化、移動(dòng)、血管的生成及細(xì)胞自殺中起重要的作用。尤其，紫外線增加皮膚中基質(zhì)金屬蛋白酶的生產(chǎn)來(lái)分解膠原，從而引起皮膚老化反應(yīng)，如形成皺紋等。即，若在暴露于紫外線的皮膚中抑制基質(zhì)金屬蛋白酶生產(chǎn)，則可以預(yù)防或治療紫外線引起的皮膚損傷。

可知的是，基質(zhì)金屬蛋白酶-1不僅參與在正常的生理反應(yīng)分解細(xì)胞外基質(zhì)，而且在疾病的進(jìn)行過(guò)程中也分解細(xì)胞外基質(zhì)，尤其，起分解第一、第二及第三型膠原的作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶-3起分解Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅸ及Ⅹ類型膠原、蛋白聚糖(proteoglycans)、纖維連接蛋白(fibronectin)、層粘連蛋白(laminin)及彈性蛋白(elastin)的功能，并且，還活化其他基質(zhì)金屬蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-7及基質(zhì)金屬蛋白酶-9等。因此，基質(zhì)金屬蛋白酶-3被認(rèn)為在重組皮膚組織中最為主要的因子。

本發(fā)明的組合物可以以口服的皮膚改善用化妝品組合物來(lái)所提供。本發(fā)明的化妝品組合物包含上述葉綠素a或脫鎂葉綠酸a作為有效成分以外，還包含食品組合物或在口服用醫(yī)藥上通常使用的成分，還可以包含通常的輔助劑，例如，抗氧化劑、安定化劑、增溶劑、維生素、顏料及香料等，并且包含載體。

本發(fā)明的口服用化妝品組合物所包含的載體為當(dāng)制劑時(shí)通常所使用的，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油等，但是不局限于此。本發(fā)明的口服用化妝品組合物包含上述成分以外，還包含潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、保鮮劑等。

并且，本發(fā)明的組合物可以以藥學(xué)組合物來(lái)所提供。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的組合物為(a)本發(fā)明的葉綠素a或脫鎂葉綠酸a的藥學(xué)有效量；以及(b)包含藥學(xué)上可接受的載體的藥學(xué)組合物。本說(shuō)明書中的用語(yǔ)“藥學(xué)有效量”意味著達(dá)成葉綠素a或脫鎂葉綠酸a的效能或活性的充足的量。

本發(fā)明的組合物在以藥學(xué)組合物制成的情況下，本發(fā)明的組合物包含藥學(xué)上課接受的載體。被包含在本發(fā)明的藥學(xué)組合物的藥學(xué)上可接受的載體為當(dāng)制劑時(shí)通常所利用的，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油等，但是不局限于此。除了上述成分之外，本發(fā)明的藥學(xué)組合物還可以包含潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、保鮮劑等。在Remington's Pharmaceut ical Sciences(19th ed.，1995)中詳細(xì)記載了合適的藥學(xué)上可接受的載體及制劑。

本發(fā)明的藥學(xué)組合物可以口服給藥。

本發(fā)明的藥學(xué)組合物的合適的給藥量為根據(jù)如制劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、病態(tài)、飲食、給藥時(shí)間、給藥路徑、排泄速度及反應(yīng)靈敏性等因素來(lái)可以給予多種處方。

本發(fā)明的藥學(xué)組合物在該發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)，隨著普通技術(shù)人員可以容易地實(shí)施的方法，通過(guò)利用藥學(xué)上可接受的載體及/或成型添加劑來(lái)制劑，從而以單位用量形態(tài)來(lái)進(jìn)行制備或放入大用量容器內(nèi)來(lái)可以進(jìn)行制備。此時(shí)，劑型可以是油或水性媒介中的溶液、懸浮液、糖漿劑或油滑液形態(tài)或也可以是濃縮劑、散劑、粉末劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑形態(tài)，還可以包含分散劑或安定化劑。

并且，本發(fā)明的組合物可以以食品組合物來(lái)進(jìn)行提供。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的組合物為(a)本發(fā)明的葉綠素a或脫鎂葉綠酸a的食品學(xué)有效量；以及(b)包含食品學(xué)上可接受的載體的食品學(xué)組合物。

本發(fā)明的組合物在以食品組合物來(lái)制成的情況下，作為有效成分，不僅包含葉綠素a或脫鎂葉綠酸a，而且還包含當(dāng)制作食品時(shí)通常所添加的成分，例如：蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、營(yíng)養(yǎng)素、調(diào)味劑及香味劑。上述碳水化合物的例有單糖類，例如葡萄糖、果糖等；二糖類，例如麥芽糖、蔗糖、低聚糖等；以及多糖類，例如一般的糖，如糊精、環(huán)糊精等，以及糖醇，如木糖醇、山梨醇、赤藻糖醇等。作為香味劑可以使用天然香味劑[索馬甜，甜菊提取物(例如甜葉菊甙A、甘草素等)]及合成香味劑(糖精、阿斯巴甜等)。例如，本發(fā)明的食品組合物在以口服液來(lái)制成的情況下，可以將包含本發(fā)明的土茯苓提取物之外，還可以包含檸檬酸、液態(tài)果糖、砂糖、葡萄糖、醋酸、蘋果酸、果汁、杜仲提取物、大棗提取物、甘草提取物等。

發(fā)明的效果

概括本發(fā)明的特征及益處為如下：

(a)本發(fā)明提供皮膚狀態(tài)改善用組合物，包含葉綠素a或脫鎂葉綠酸a作為有效成分。

(b)根據(jù)本發(fā)明，葉綠素a或脫鎂葉綠酸a具有改善紫外線引起的皮膚皺紋的效果。

(c)根據(jù)本發(fā)明，葉綠素a或脫鎂葉綠酸a具有緩解紫外線引起的炎癥反應(yīng)的效果。

(d)本發(fā)明的組合物以口服給藥為特征，可以以化妝品組合物、藥學(xué)組合物及食品組合物來(lái)進(jìn)行提供。

附圖說(shuō)明

圖1a為在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的小鼠背部皮膚中，示出皺紋減少的圖片。

圖1b為在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的小鼠群體中，示出視覺(jué)上的皺紋等級(jí)比僅照射紫外線的群體顯著減少的圖表。

圖1c為在小鼠中因陰性復(fù)制物而出現(xiàn)的皺紋。

圖1d為將背部的皺紋區(qū)域利用影子區(qū)域來(lái)所計(jì)算的圖表。

圖2a為在給藥脫鎂葉綠酸a的小鼠的真皮中，示出炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與僅照射紫外線的小鼠相比減少的圖片。

圖2b為在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的小鼠中，示出表皮厚度顯著減少且真皮中的膠原束變得更厚的圖片。

圖2c為在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的小鼠中，示出表皮厚度與僅照射紫外線的小鼠相比減少的圖表。

圖3a為在給藥脫鎂葉綠酸a的小鼠真皮中，示出炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與僅照射紫外線的小鼠相比減少的圖片。

圖3b為示出在照射紫外線的小鼠的真皮上部和表皮中的細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1的表達(dá)與僅給藥賦形劑(vehicle)的小鼠相比相當(dāng)高的圖片。在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的小鼠中細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1的表達(dá)與僅照射紫外線的小鼠相比減少了。

圖3c為示出在表皮中，將炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)用顯微鏡觀察計(jì)算結(jié)果，給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的小鼠中的炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)與照射紫外線光的小鼠相比減少的圖表。

圖4a為在人皮膚成纖維細(xì)胞(hDF)照射紫外線且用各種濃度的脫鎂葉綠酸a處理后，分析細(xì)胞存活率的圖表。

圖4b為在人皮膚成纖維細(xì)胞照射紫外線且用各種濃度的脫鎂葉綠酸a處理后，用蛋白質(zhì)印跡法分析基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-3的表達(dá)水平變化的圖片。

圖4c為在人皮膚成纖維細(xì)胞照射紫外線且用各種濃度的脫鎂葉綠酸a處理后，用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT PCR)法分析基質(zhì)金屬蛋白酶-1的mRNA表達(dá)水平的圖表。

圖4d為在人皮膚成纖維細(xì)胞照射紫外線且用各種濃度的脫鎂葉綠酸a處理后，用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法分析基質(zhì)金屬蛋白酶-2的mRNA表達(dá)水平的圖表。

圖4e為在人皮膚成纖維細(xì)胞照射紫外線且用各種濃度的脫鎂葉綠酸a處理后，用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法分析基質(zhì)金屬蛋白酶-3的mRNA表達(dá)水平的圖表。

圖5a為在人皮膚成纖維細(xì)胞照射紫外線且用各種濃度的脫鎂葉綠酸a處理后，用蛋白質(zhì)印跡法分析磷酸化c-Jun氨基末端激酶(pJNK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶l/2(pERKl/2)及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶l/2(ERK1/2)的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平變化的圖片。

圖5b為示出在人皮膚成纖維細(xì)胞中處理脫鎂葉綠酸a且用共聚焦顯微鏡(confocal)觀察2小時(shí)的脫鎂葉綠酸a與濃度成比列地位于細(xì)胞質(zhì)的圖片。

具體實(shí)施方式

以下，通過(guò)實(shí)施例本來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。這些實(shí)施例僅是用于更具體地說(shuō)明本發(fā)明的，對(duì)本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員而言，本發(fā)明的保護(hù)范圍不隨本發(fā)明的主旨而局限于這些實(shí)施例是不言自明的。

實(shí)施例

實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)

人皮膚成纖維細(xì)胞(primary human dermal fibroblast，hDF)細(xì)胞株由全南大學(xué)醫(yī)科大學(xué)金誠(chéng)貞教授提供。細(xì)胞培養(yǎng)為在37℃，5％的CO₂條件使用添加5％胎牛血清(fetal bovine serum，Gibco Laboratories，Grand Island，NY，USA)及1％青霉素(penici 11in，100units/ml)/鏈霉素(streptomycin，100mg/ml)的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM，Gibco Laboratories，Grand Island，NY，USA))培養(yǎng)。

紫外線照射方法

使用了紫外光源具有280nm及380nm發(fā)光范圍的飛利浦TL20W/12盧比的熒光日光燈(Philips TL 20W/12RS fluorescent sun lamp)。采用紫外線測(cè)定儀(GUVx-TlxGS5-LA2，Genicom Daejeon，Korea)測(cè)定了皮膚表面的紫外線強(qiáng)度。與紫外光源相距30cm處的紫外線照射強(qiáng)度為1.0mW/cm²。在培養(yǎng)皿將細(xì)胞培養(yǎng)至75～80％，然后用磷酸鹽緩沖液清洗兩次后，照射紫外線并處理了實(shí)驗(yàn)物質(zhì)。此后，在遮光的狀態(tài)下，直到進(jìn)行下一個(gè)分析為止繼續(xù)培養(yǎng)。

為了對(duì)動(dòng)物照射紫外線，首先對(duì)小鼠背部皮膚照射了最小紅斑劑量(minimal erythema dose，MED)。最小紅斑劑量意味著，在照射24小時(shí)后可以誘導(dǎo)具有顯著界限的紅斑(erythema)的最小量。將紫外線以每周3次對(duì)小鼠照射了8周。前3周，每次將照射量增加1MED(本發(fā)明中1MED＝30mJ/cm2)，此后維持3MED。

細(xì)胞存活率分析(Cell viability assay)

為了分析細(xì)胞活性采用了水溶性四氮唑試驗(yàn)(water soluble tetrazolium test)方法。利用EZ Cytox細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(Ez-cytox Cell Viability Assay Kit(Daei 1Lab Co，Seoul，Korea))分析了活細(xì)胞的定量。通過(guò)利用變色龍多標(biāo)簽讀板(Chameleon multi-label plate reader(Hidex Personal Life Science，Hidex Oy，F(xiàn)inland))在450nm下測(cè)定吸光度，來(lái)用光譜測(cè)定法分析了甲月替染料(formazan dye)。

實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time RT-PCR)

根據(jù)制備者的指示使用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，分離了所有RNA。利用ImProm IITM反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(ImProm-IITM Reverse Transcription system(Pr omega，Madison，WI，USA))來(lái)用2.5μg的所有RNA合成了cDNA。為了分析各基因的表達(dá)水平，利用熒光定量DNA擴(kuò)增儀(DNA Engine Opticonl(MJResearch，Waltham，MA，USA))來(lái)用上述合成的cDNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。為了在PCR擴(kuò)增過(guò)程中探測(cè)熒光，利用了SYBR Premix Ex Taq(Takara Bio，Otsu，Japan)，通過(guò)將全部分量為10μl，其中1μl的cDNA/control及個(gè)基因包含特異性引物來(lái)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。所使用的引物如下：

基質(zhì)金屬蛋白酶-1

正方向CTG AAG GTG ATG AAG CAG CC

逆方向AGT CCA AGA GAA TGG CCG AG

基質(zhì)金屬蛋白酶-2

正方向GAT ACC CCT TTG ACG GTA AGG A

逆方向CCT TCT CCC AAG GTC CAT AGC

基質(zhì)金屬蛋白酶-3

正方向ATT CCA TGG AGC CAG GCT TTC

逆方向CAT TTG GGT CAA ACT CCA ACT GTG

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)

正方向CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT

逆方向AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC

PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行條件如下：

(1)在95℃下，變性(denaturation)10分鐘

(2)循環(huán)40回：變性(95℃下，一秒)，退火(60℃下，5秒)伸展(72℃下，25秒)。

蛋白質(zhì)印跡法分析

從樣品到所有蛋白質(zhì)提取物準(zhǔn)備在溶解試劑50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1mM EGTA，1％NP-40，0.25％sodium deoxycholate，1mM PMSF，and phosphatase inhibitor mixture(Sigma，St Louis，MO，USA)}里后加熱5分鐘。利用Bio-Rad蛋白測(cè)定染料試劑濃縮物(Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA))來(lái)將溶解的蛋白質(zhì)定量后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分離并移至聚偏氟乙稀(polyvinylidene di fluoride，PVDF)膜(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ，USA)。在4℃下，將膜用特定的一次抗體反應(yīng)一個(gè)晚上后，利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(chemiluminescence detection kit(Amersham Pharmacia Biotech))對(duì)與辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)相連接的二次抗體和蛋白質(zhì)帶進(jìn)行了視覺(jué)化。所使用的各個(gè)一次抗體如下：基質(zhì)金屬蛋白酶-1(Chemicon，Bedford，MA，USA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Chemicon，Bedford，MA，USA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(Epitomics，Burl ingame，CA，USA)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phospho c-Jun N-terminal kinase，pJNK)、c-Jun氨基末端激酶、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(phospho extracellular signal-regulated kinase，pErk)及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(所有Cell Signaling Technology，Beverly，MA，USA)。

共聚焦顯微鏡(Confocal microscopy)

在蓋玻片(coverslip)上，以5×10⁴/well培養(yǎng)人皮膚細(xì)胞后，將脫鎂葉綠酸a在37℃下不部暴露于光的狀態(tài)下處理了2小時(shí)。而且，在磷酸緩沖鹽溶液中用4％的多聚甲醛固定了細(xì)胞。在440nm的激發(fā)波長(zhǎng)(excitation wavelength)及655nm的發(fā)射波長(zhǎng)(emission wavelength)下，利用FV1000共聚焦顯微鏡(FV1000confocal microscope(Olympus，Tokyo，Japan))對(duì)脫鎂葉綠酸a的熒光進(jìn)行了視覺(jué)化。熒光強(qiáng)度決定了細(xì)胞內(nèi)是否吸收脫鎂葉綠酸a。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

使從查爾斯河實(shí)驗(yàn)室(Charles River Laboratories(Wilmington，MA))購(gòu)買的6周齡雌性SKH-1無(wú)毛小鼠適應(yīng)一周。有空調(diào)的房間以12小時(shí)有光/12小時(shí)無(wú)光的周期，在可以自由地吃的條件下，飼養(yǎng)小鼠。房間溫度維持在23士3℃，濕度維持在55士15％。所有實(shí)驗(yàn)由光州科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)(animal care and use committee)承認(rèn)。

試驗(yàn)物質(zhì)的口服給藥

適應(yīng)期滿后，將小鼠以每個(gè)群體6只分成了4個(gè)群體。各群體如下：

(a)陰性對(duì)照組

(b)僅照射紫外線的陽(yáng)性對(duì)照組

(c)照射紫外線的同時(shí)每天給藥5mg/kg葉綠素a的群體

(d)照射紫外線的同時(shí)每天給藥5mg/kg脫鎂葉綠酸a的群體

將葉綠素a(Ca，Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)或脫鎂葉綠酸a(Pa，F(xiàn)rontier Scientific，Logan，UT，USA)分別溶解于40％的400溶液的聚乙二醇(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)中使用。作為控制的賦形劑(vehicle)，僅用40％的400溶液的聚乙二醇制備后給藥陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組群體的小鼠。在照射紫外線后立即進(jìn)行了試驗(yàn)物質(zhì)的給藥。

背部皮膚的皺紋評(píng)價(jià)

繼續(xù)暴露于低用量的紫外線后，為了獲得背部皮膚的臨床的圖像(clinical)，使用了數(shù)碼相機(jī)(Sony Cyber shot DSC-W570，5Xoptical zoom，16.1megapixels，Sony Corporation，Tokyo，Japan)。放大的皺紋可以使用數(shù)碼相機(jī)上的 IIHybridM(3Gen，LLC，San Juan Capistrano，CA，USA)來(lái)獲得。根據(jù)Bissett等[20]記述的方法對(duì)小鼠背部的皺紋定了等級(jí)。由此定的等級(jí)如下：

等級(jí)0-無(wú)任何粗皺紋的情況；

等級(jí)1-由少數(shù)的淺的粗皺紋的情況；

等級(jí)2-由一些粗皺紋的情況；

等級(jí)3-由多個(gè)粗皺紋的情況。

為了分析皮膚的皺紋，使用了以陰性雕刻的復(fù)制物，此方法由柳等[21]所記述的方法。即，將半流動(dòng)體的硅聚合物與催化劑(Imprint II GarantTM Light Body，3M)相混合后，在背部皮膚上適用了，使足以滲透至越過(guò)輪廓線滲入到皺紋內(nèi)。形成了復(fù)制物，在具有設(shè)定的入射角(incident angle)的標(biāo)準(zhǔn)燈光下，對(duì)此復(fù)制物進(jìn)行了分析，使得生成與皺紋的高度成比例的反射影子。采用圖像分析軟件(ImageJ software，NIH Image，National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA；online at:http://rsb.info.nih.gov/ij/)從圖像影子區(qū)域測(cè)定了所截的圖像。

組織學(xué)檢查

將從照射紫外線的小鼠背部辟出取出的組織樣品固定在4％的多聚甲醛后，被包含于石蠟中。對(duì)厚度為4μm的薄的切片用蘇木精(hematoxylin)及曙紅(eosin)溶液進(jìn)行了染色。為了視覺(jué)化膠原的沉積，用Accustain tr ichrorae stain(Sigma-Aldr ich，St.Louis，Missouri，USA)對(duì)切片進(jìn)行了染色。采用i-Solution DT image acquisition and analysis program(IMT i-solution，Vancouver，Canada)及Leica microscope(Leica，Wetzlar，Germany)測(cè)定了從顆粒型角膜層的接合部位到真皮-表皮的接合部位的表皮厚度。為了評(píng)價(jià)表皮的厚度，在載玻片下測(cè)定了任意的十個(gè)部位。在高性能場(chǎng)計(jì)算了從表皮到皮下脂肪層的炎癥細(xì)胞。

棉衣組織化學(xué)法(Immunohistochemistry)

使用厚度為5μm的石蠟切片，進(jìn)行了對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-1(Chemicon International，Temecula，CA，USA)、細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1(Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA，USA)及Type 1Collagen(Santa Cruz Biotechnology，Sant Cruz載玻片，CA，USA)的免疫組織化學(xué)染色。使用二甲苯(xylene)及酒精從載玻切片去除石蠟并進(jìn)行了水化。為了去除切片上的內(nèi)生的(endogenous)過(guò)氧化物酶(peroxidase)，在3％的H2O2中培養(yǎng)后，為了阻斷非特異性的抗體結(jié)合部位，用3％的牛血清進(jìn)行了培養(yǎng)。為了檢出基質(zhì)金屬蛋白酶-1、type 1collagen及細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1，分別準(zhǔn)備了小鼠抗-人類基質(zhì)金屬蛋白酶-1單克隆抗體(1:100)、山羊抗-人類type 1collagen多克隆抗體(1:100)及小鼠抗-人類細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1單克隆抗體(1:100)。隨后，為了視覺(jué)化各抗體的特定靶，通過(guò)采用DAKO LSAB+system-HRPkit(DAKO Corporation，Carpinter ia，CA，USA)來(lái)適用了avidin-biot in-peroxidase complex方法。使用蘇木精作為對(duì)照染色。

統(tǒng)計(jì)分析

各個(gè)的離體(in vitro)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了3次，所有數(shù)據(jù)以平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差來(lái)表示。群體之間的顯著差異用T檢驗(yàn)(Student T test)及方差分析(ANOVA)進(jìn)行了分析。p-value<0.05為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的群體中，皺紋的臨床分?jǐn)?shù)(clinical score)得到了改善。

連續(xù)8周對(duì)反復(fù)照射紫外線的無(wú)毛小鼠皮膚皺紋作出了評(píng)價(jià)。在小鼠的背部用數(shù)碼相機(jī)拍攝了皺紋及陰性的復(fù)制圖像(negative replica image)的皮膚特性，且用圖像分析軟件進(jìn)行了分析(圖1)。在將小鼠背部皮膚長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)暴露于紫外線的情況下，回誘導(dǎo)作為光輻射皮膚老化的典型特征的皺紋和皮膚變粗的現(xiàn)象。在照射紫外線后立即給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的情況下，與對(duì)照組相比皺紋的厚度明顯被減少了，且顯示出微細(xì)的皺紋。并且，兩名熟練的專家確認(rèn)了對(duì)于臨床圖片的視覺(jué)化的皺紋等級(jí)，結(jié)果示出給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的群體中的皺紋等級(jí)下降了。在復(fù)制圖像中，給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的群體與對(duì)照組相比皺紋區(qū)域也減少了。

給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的小鼠的背部皮膚組織病理學(xué)得到了改善。

為了調(diào)查脫鎂葉綠酸a或葉綠素a對(duì)由照射紫外線被誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響，將照射紫外線的小鼠背部皮膚切片化后，用H&E進(jìn)行了染色(圖2)。在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的情況下，確認(rèn)到了，與對(duì)照組相比表皮和真皮上部的炎癥細(xì)胞和浸潤(rùn)減少了。

表皮變厚意味著有過(guò)因照射紫外線而被誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，將表皮的厚度用馬森三色(Masson-trichrome)染色法作出了評(píng)價(jià)。在照射紫外線的情況下，與僅用賦形劑(vehicle)處理的群體相比表皮厚度增加了。在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的群體中厚度減少表示的是炎癥程度下降了。并且，觀察到了，給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的群體與對(duì)照組的群體相比真皮中的膠原破壞更少。即，在僅照射紫外線的群體中觀察到了表皮中的微細(xì)的膠原束，且隨著真皮-表皮結(jié)合部位和上部真皮觀察到退化的變透明的(hyalinized)物質(zhì)被沉積而擴(kuò)散。與此相反，在給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的群體中觀察到，與對(duì)照組相比在真皮中厚的膠原束和上部真皮中退化的物質(zhì)減少了。

給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的群體與僅照射紫外線的對(duì)照組相比細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1表達(dá)降低了。

細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1為媒介白細(xì)胞的相互作用并干涉收集炎癥細(xì)胞的細(xì)胞表面的粘附分子(surface adhesion molecule)。紫外線的照射會(huì)在角質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1，眾所周知細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1在發(fā)生炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的炎癥部位的細(xì)胞膜，以高的水平來(lái)表達(dá)[22]。對(duì)細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果，確認(rèn)了紫外線處理的群體與僅處理賦形劑(vehicle)的群體相比在表皮和真皮上部細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1的表達(dá)程度增加了(圖3)。這可能是因?yàn)樵谡嫫ど喜堪l(fā)生了炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。給藥脫鎂葉綠酸a或葉綠素a的群體與僅照射紫外線的群體相比在表皮和真皮上部細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1的表達(dá)程度減少了。

若在人皮膚成纖維細(xì)胞(hDF)中照射紫外線后處理脫鎂葉綠酸a，則基質(zhì)金屬蛋白酶(基質(zhì)金屬蛋白酶)生產(chǎn)會(huì)減少。

為了評(píng)價(jià)脫鎂葉綠酸a對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶生產(chǎn)的影響，將人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)至培養(yǎng)皿的80％后，照射紫外線(20mJ/cm2)并用各種濃度的(0、10、20、50μM)的脫鎂葉綠酸a進(jìn)行了處理。而且，在遮光的狀態(tài)下將細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后，進(jìn)行了細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。細(xì)胞的生存能力不受紫外線的照射及試驗(yàn)物質(zhì)的處理的影響(圖4a)。

并且，照射紫外線且處理試驗(yàn)物質(zhì)后培養(yǎng)24小時(shí)，然后利用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法分析了基質(zhì)金屬蛋白酶的mRNA水平。將甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因作為內(nèi)部的控制來(lái)適用，將對(duì)于甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基質(zhì)金屬蛋白酶-1的相對(duì)量用條(bar)來(lái)表示(圖4c至圖4e)。在僅照射紫外線的情況下，基質(zhì)金屬蛋白酶-1/甘油醛-3-磷酸脫氫酶mRNA的水平增加了14倍。在處理脫鎂葉綠酸a的情況下，基質(zhì)金屬蛋白酶-1及基質(zhì)金屬蛋白酶-3水平顯著的減少了?；|(zhì)金屬蛋白酶-2mRNA水平基本上不受紫外線照射的影響。

為了確認(rèn)基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡法。分別對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-l、基質(zhì)金屬蛋白酶-2及基質(zhì)金屬蛋白酶-3用一次抗體分析的結(jié)果，基質(zhì)金屬蛋白酶-1及3的量以與處理脫鎂葉綠酸a的量成比例的方式減少了(圖4b)?？傊?，呈現(xiàn)出蛋白質(zhì)水平與mRNA表達(dá)水平相一致。

在人皮膚成纖維細(xì)胞(WF)中，脫鎂葉綠酸a抑制由紫外線照射所誘導(dǎo)的胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)磷酸化。

眾說(shuō)周知的是，基質(zhì)金屬蛋白酶與由紫外線照射所誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶生產(chǎn)有關(guān)。要確認(rèn)脫鎂葉綠酸a對(duì)由紫外線照射引起的MAPK的磷酸化有何影響。為此，對(duì)照射紫外線的人皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行脫鎂葉綠酸a處理，在遮光的狀態(tài)下培養(yǎng)2小時(shí)后，將溶解細(xì)胞來(lái)進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡法(圖5a)。為了確認(rèn)被磷酸化c-Jun氨基末端激酶、c-Jun氨基末端激酶、被磷酸化的磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，適用了對(duì)各個(gè)把蛋白質(zhì)的一次抗體。蛋白質(zhì)印跡法分析結(jié)果，在處理20μΜ及50μΜ的脫鎂葉綠酸a細(xì)胞中，觀察到磷酸化的c-Jun氨基末端激酶及磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的表達(dá)水平減少了。并且，基本的c-Jun氨基末端激酶蛋白質(zhì)水平與脫鎂葉綠酸a量成比例的減少了。

在人皮膚成纖維細(xì)胞中，利用共聚焦顯微鏡來(lái)對(duì)在2個(gè)小時(shí)內(nèi)脫鎂葉綠酸a被吸收的圖像進(jìn)行了視覺(jué)化(圖5b)。在用蛋白質(zhì)印跡法分析MAPK的結(jié)果中，在照射紫外線后處理10μΜ的脫鎂葉綠酸a2小時(shí)的情況下，MAPK磷酸化抑制效果低于在20μΜ及50μΜ中顯示的效果，這可能是因?yàn)榕c20μΜ及50μΜ相比在10μΜ的脫鎂葉綠酸a中細(xì)胞吸收不夠好。

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