專利名稱：用于處理含有焦脫鎂葉綠素的組合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于處理包含焦脫鎂葉綠素的組合物的方法、用途、裝置及相關(guān)產(chǎn)品。一方面，本發(fā)明特別適用于植物源性食品和飼料產(chǎn)品、例如植物油的工業(yè)處理。本發(fā)明可用于減輕或消除所述產(chǎn)品中的焦脫鎂葉綠素污染。
背景技術(shù)：
葉綠素是廣泛存在于植物界的綠色色素。葉綠素是光合作用所必需的，是存在于地球上的最豐富的有機(jī)金屬化合物之一。因此，許多源自植物的產(chǎn)品、包括食品和飼料均含有大量的葉綠素。例如，源自油料種子(例如大豆、棕櫚或油菜籽(canola)、棉籽以及花生油)的植物油通常含有一些葉綠素。然而，植物油中高水平葉綠素色素的存在通常是不合乎需要的。這是因?yàn)槿~綠素產(chǎn)生不合乎需要的綠色，并且可在儲(chǔ)存過程中誘導(dǎo)油氧化，導(dǎo)致油變質(zhì)。已經(jīng)應(yīng)用多種方法以從植物油中去除葉綠素?？稍谟彤a(chǎn)品加工的許多階段去除葉綠素，包括種子壓榨、油萃取、脫膠、堿處理以及漂白步驟。然而，對(duì)于將葉綠素殘留物去除至可接受水平，漂白步驟通常是最重要的。在漂白過程中，加熱油并使其通過吸附劑，以去除葉綠素和影響精制油外觀和/或穩(wěn)定性的其他帶顏色的化合物。漂白步驟中使用的吸附劑通常是粘土。在食用油加工業(yè)中，這些步驟的應(yīng)用通常將所加工的油中的葉綠素水平降低至0.02至0.05 !11之間。然而，由于漂白粘土中的霧沫夾帶，漂白步驟增加了加工成本并降低了油產(chǎn)率。另外，粘土的使用昂貴，這特別歸因于對(duì)于使用過的粘土(即廢料)的處理困難、危險(xiǎn)并且代價(jià)高昂。因此，已經(jīng)嘗試通過其他方法從油中去除葉綠素，例如使用葉綠素酶。在植物中，葉綠素酶(chlase)被認(rèn)為參與葉綠素降解和催化葉綠素中酯鍵的水解，以產(chǎn)生脫植基葉綠素(chlorophyllide)和葉綠醇。WO 2006009676描述了通過使用葉綠素酶處理可降低諸如植物油之類的組合物中的葉綠素污染的工業(yè)工藝。該工藝中產(chǎn)生的水溶性脫植基葉綠素也是綠色的，但可通過水萃取或二氧化硅處理而去除。葉綠素通常在用于油生產(chǎn)的種子中以及從種子萃取油的過程中部分降解。一種常用的改良是從卟啉(二氫卟酚)環(huán)中去除鎂離子，以形成稱為脫鎂葉綠素的衍生物(見圖26)。從卟啉環(huán)去除高極性鎂離子導(dǎo)致脫鎂葉綠素與葉綠素的理化性質(zhì)顯著不同。在加工過程中，油中的脫鎂葉綠素通常要比葉綠素更豐富。脫鎂葉綠素呈綠色，可通過與用于葉綠素的類似工藝而從油中去除，例如WO 2006009676中所述通過具有脫鎂葉綠素酶活性的酶催化的酯酶反應(yīng)。在某些條件下，某些葉綠素酶能夠水解脫鎂葉綠素以及葉綠素，由此適于去除這兩種污染物。脫鎂葉綠素的水解產(chǎn)物是紅色/褐色的脫鎂葉綠酸(pheophorbide)和葉綠醇。值得關(guān)注的是，脫鎂葉綠酸也可通過從脫植基葉綠素去除鎂而產(chǎn)生，即在葉綠素水解之后進(jìn)行(見圖26)。WO 2006009676教導(dǎo)了通過類似于用于脫植基葉綠素的方法去除脫鎂葉綠酸，例如通過水萃取或二氧化硅吸附。然而，值得注意的是，脫鎂葉綠酸的水溶性低于脫植基葉綠素，因此不能使用水萃取(特別是使用水)容易地洗除。脫鎂葉綠素可在油料種子的收獲和儲(chǔ)存過程中通過植物酶活性或通過在油精制過程中通過加工條件(例如熱)而進(jìn)一步降解為焦脫鎂葉綠素(見,“Behaviour ofchlorophyl Derivatives in Canola Oil Processing”，JAOCS,第 9 卷(Sept. 1993)，第837-841頁)。一種可能的機(jī)制是脫鎂葉綠素同素環(huán)的甲基酯鍵的酶促水解，及隨后不穩(wěn)定中間物至焦脫鎂葉綠素的非酶促轉(zhuǎn)化。據(jù)報(bào)道，一種稱為脫鎂葉綠酸酶的來自藜(Chenopodium album)的28_29kDa酶能夠催化脫鎂葉綠酸的類似反應(yīng),從而產(chǎn)生稱為焦脫鎂葉綠酸(pyropheophorbide)的焦脫鎂葉綠素的無葉綠醇衍生物(見圖26)。焦脫鎂葉綠酸的極性低于脫鎂葉綠酸，導(dǎo)致與脫鎂葉綠酸相比，焦脫鎂葉綠酸的水溶性降低且油溶性增加。加工過程中，植物油中的焦脫鎂葉綠素要比脫鎂葉綠素和葉綠素二者更豐富(見Bailey，s Industrial Oil and Fat Products (2005),卷 2. 2,表 9,第 6 版，F(xiàn)ereidoonShahidi編輯，John Wiley & Sons)。這部分歸因于在植物原料收獲和儲(chǔ)存期間葉綠素中鎂的喪失。還通過在加工和萃取前加熱油料種子，以及精制工藝過程中油脫膠和堿處理來降低葉綠素水平。因此，在許多植物油中，與焦脫鎂葉綠素(和脫鎂葉綠素)相比，葉綠素是相對(duì)次要的污染物。焦脫鎂葉綠素呈綠色且鑒于其對(duì)于顏色和穩(wěn)定性的不良影響，焦脫鎂葉綠素是油中主要的不良污染物。盡管對(duì)葉綠素和(較低程度上)脫鎂葉綠素去除的方面給予了關(guān)注，仍舊需要從諸如植物油之類的組合物中去除焦脫鎂葉綠素及其衍生物(例如焦脫鎂葉綠酸)的合適方法。特別地，現(xiàn)有技術(shù)中描述的葉綠素酶通常幾乎沒有或完全沒有焦脫鎂葉綠素酶活性，由此不能去除焦脫鎂葉綠素污染。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明提供了用于處理含有焦脫鎂葉綠素的組合物的方法，該方法包括使所述組合物與能夠水解焦脫鎂葉綠素的酶接觸。優(yōu)選地，所述組合物源自植物、藻類或細(xì)菌。在一種實(shí)施方式中，所述組合物包括植物源性油，例如植物油。優(yōu)選地，所述組合物包括選自米糠油、大豆油、菜籽(rape seed)油、棕櫚油、橄欖油、棉籽油、玉米油、棕櫚仁油、椰子油、花生油、芝麻油或向日葵油的油。在一種實(shí)施方式中，所述酶包括脫鎂葉綠素酶或脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶。所述酶可源自例如選自下述屬的物種擬南芥屬(Arabidopsis)、楊屬(Populus)、葡萄屬(Vitis)、稻屬(Oryza)、玉米屬(Zea)、煙草屬(Nicotiana)、藻屬(Ostreococcus)、藻屬、小立碗蘚屬(Physcomitrella)、褐指藻屬(Phaeodactylum)、衣藻屬(Chlamydomonas)或微胞藻屬(Micromonas)，或所述酶可源自例如選自下述物種擬南芥(Arabidopsisthaliana)、毛果楊(Populus trichocarpa)> 葡萄(Vitis vinifera)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zea mays)、煙草(Nicotiana tabacum)、綠色鞭毛藻(OstreococcusIucimarinus)、青綠藻(Ostreococcus taurii)、小立碗蘚(Physcomitrella patens)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)或微胞藻(Micromonas sp.)RCC299。優(yōu)選地，所述酶包含選自下述的氨基酸序列LPGFGVG(SEQ ID NO :13)、DFLGQG (SEQ ID NO : 14)、GNSLGG (SEQ ID NO 15), LVKGVTLLNATPFff (SEQ ID NO :16)、HPAA (SEQ ID NO :17)、EDPW (SEQ ID NO :18)以及 SPAGHCPH(SEQ ID NO :19)。在一種實(shí)施方式中，所述酶包含SEQ ID NO: I、或SEQ ID NO :4至12任一者或SEQID NO :21、23或25任一者所限定的多肽序列，或其功能性片段或變體，例如，所述酶包含在至少20個(gè)、至少50個(gè)、至少100個(gè)或至少500個(gè)氨基酸殘基或在序列的全長上與SEQ IDNO :1、或SEQ ID NO :4至12任一者或SEQ ID NO :21、23或25任一者具有至少50%、至少75 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少99 %序列同一性的多肽序列。在一種實(shí)施方式中，所述酶具有小于80的脫鎂葉綠素酶/焦脫鎂葉綠素酶活性比。 所述酶可水解所述組合物中的焦脫鎂葉綠素而生成焦脫鎂葉綠酸。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括從所述組合物去除焦脫鎂葉綠酸的步驟。例如，可通過脫臭步驟或二氧化硅處理步驟、優(yōu)選通過脫臭步驟和二氧化硅處理步驟二者去除焦脫鎂葉綠酸。優(yōu)選地，所述方法包括兩個(gè)或多個(gè)二氧化硅處理步驟。在一種實(shí)施方式中，所述二氧化硅處理在高溫下進(jìn)行,例如在約50至150°C、在70至110°C或在約90°C。在一種實(shí)施方式中，在固體支持體上固定能夠水解焦脫鎂葉綠素的酶。所述方法還可包括使所述組合物與具有葉綠素酶活性的酶接觸的步驟，任選地，還可將所述葉綠素酶固定于固體支持體上。優(yōu)選地，所述方法還包括使所述組合物與?；D(zhuǎn)移酶接觸的步驟。優(yōu)選地，相對(duì)于處理前存在于所述組合物中的焦脫鎂葉綠素濃度，所述組合物中的焦脫鎂葉綠素濃度降低至少10%、至少50%、至少75%或至少90%。另一方面，本發(fā)明提供了用于精制植物(例如蔬菜)油的工藝，該工藝包括使用焦脫鎂葉綠素酶處理含有焦脫鎂葉綠素的植物油。所述工藝可在工業(yè)規(guī)模進(jìn)行，可包括如上所述的多個(gè)方法步驟。所述工藝還可包括通常用于植物油加工的步驟，例如己烷萃取和/或脫膠步驟。在又一方面，本發(fā)明提供了具有焦脫鎂葉綠素酶活性的多肽用于從組合物去除焦脫鎂葉綠素污染的用途。該用途可應(yīng)用如上所述的多個(gè)方法步驟而實(shí)施。在又一方面，本發(fā)明提供了用于對(duì)含有焦脫鎂葉綠素的組合物進(jìn)行酶處理的裝置，該裝置包括(a)植物油精制裝置；和(b)可操作地并入所述植物油精制裝置中的具有焦脫鎂葉綠素酶活性的多肽，從而使所述多肽能夠在精制所述組合物的過程中水解所述組合物中的焦脫鎂葉綠素。所述裝置可包含用于實(shí)施如上所述的方法或工藝的相應(yīng)裝置特征。另一方面，本發(fā)明提供了包含固定于二氧化硅上，具有焦脫鎂葉綠素酶活性的多肽的組合物。所述多肽可為在上文所述方法的優(yōu)選實(shí)施方式中所述的酶。另一方面，本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO 3所示的核酸序列編碼的多肽，或具有焦脫鎂葉綠素酶活性的其功能性變體或片段。例如，所述變體和/或片段可在至少100、至少200或至少300個(gè)氨基酸殘基或全長序列上顯示與SEQ ID NO: 4至少90 %、至少95%或至少99%的序列同一性。又一方面，本發(fā)明提供了 SEQ ID NO :3所示的核酸序列，或編碼功能性焦脫鎂葉綠素酶的其變體或片段。例如，所述變體和/或片段可在至少300、至少500或至少1000個(gè)核苷酸殘基或全長序列上顯示與SEQ ID NO :3至少90%、至少95%或至少99%的序列同一性。在其他方面，本發(fā)明提供了一種包含SEQ ID NO :3所示核酸序列的表達(dá)載體(例如，圖13所示的表達(dá)載體)和包含所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化(宿主)細(xì)胞。又一方面，本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO :25所示的氨基酸序列的多肽，或具有焦脫鎂葉綠素酶活性的其功能性變體或片段。例如，所述變體和/或片段可在至少100、至少200或至少300個(gè)氨基酸殘基或全長序列上顯示與SEQ ID NO :25的至少90%、至少95%或至少99%的序列同一性。又一方面，本發(fā)明提供了可通過如上所述的工藝或方法獲得的組合物。例如，所述組合物可為植物、藻類或細(xì)菌產(chǎn)品，特別是精制植物油， 例如精制蔬菜油。已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)某些植物酶具有焦脫鎂葉綠素酶活性，例如，能夠水解焦脫鎂葉綠素中的酯鍵以生成焦脫鎂葉綠酸和葉綠醇。另外，所述焦脫鎂葉綠素酶特別可用于去除植物源性產(chǎn)品，例如植物油中的焦脫鎂葉綠素污染物。


圖I顯示了使用吸光度檢測(cè)(430nm)的HPLC色譜圖，表示如下編號(hào)的峰1 =脫植基葉綠素b ；2 =脫植基葉綠素a ；3 =新葉黃素；3’ =新葉黃素異構(gòu)體；4 =新色素；5=堇黃質(zhì)；6 =黃體呋喃素(Iueoxanthin) ；7 =異堇黃質(zhì)；8 =花藥黃質(zhì)(anteraxanthin)；8’ =花藥黃質(zhì)異構(gòu)體；9 =玉米黃質(zhì)；10 =葉黃素；10’ =葉黃素異構(gòu)體；10” =葉黃素異構(gòu)體；11 =脫鎂葉綠酸b ; 12 =脫鎂葉綠酸a ; 13 =葉綠素b ; 13’ =葉綠素b’ ； 14=葉綠素a;14’ =葉綠素a’；15 =脫鎂葉綠素b ;15’ =脫鎂葉綠素b’；16= β-胡蘿卜素；17=脫鎂葉綠素a ;17’ =脫鎂葉綠素a’ ；18 =焦脫鎂葉綠素b ；19 =焦脫鎂葉綠素a。圖2顯示了表5中所示的樣品I (對(duì)照)在脫臭之前的HPLC分析結(jié)果。圖3顯示了表5中所示的樣品I (對(duì)照)在脫臭之后的HPLC分析結(jié)果。圖4顯示了表5中所示的樣品2(包含脫鎂葉綠酸)在脫臭之前的HPLC分析結(jié)果O圖5顯示了表5中所示的樣品2 (包含脫鎂葉綠酸)在脫臭之后的HPLC分析結(jié)
果O圖6顯示了表5中所示的樣品3 (包含焦脫鎂葉綠酸)在脫臭之前的HPLC分析結(jié)
果O圖7顯示了表5中所示的樣品3 (包含焦脫鎂葉綠酸)在脫臭之后的HPLC分析結(jié)
果O圖8顯示了表5中所示的樣品4(包含脫鎂葉綠素)在脫臭之前的HPLC分析結(jié)
果O圖9顯示了表5中所示的樣品4(包含脫鎂葉綠素)在脫臭之后的HPLC分析結(jié)
果O圖10顯示了來自擬南芥的脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶(PPH)的氨基酸序列(SEQ ID N0l)o葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽以粗體表示。圖11顯示了來自擬南芥的編碼脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶的核苷酸序列(SEQID NO 2)。SEQ ID NO 1 的 PPH 由 SEQ ID NO 2 的 173 至 1627 位殘基編碼。
圖12顯示了編碼脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶(脫鎂葉綠素酶)的合成基因，該基因具有設(shè)計(jì)用于在絲狀真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)中表達(dá)的密碼子(核苷酸序列SEQ ID NO :3，氨基酸序列SEQ ID NO 4)。圖13顯示了含有通過kexin辛肽連接子與cbhl的催化核心融合的脫鎂葉綠素酶(PPH)合成基因的表達(dá)構(gòu)建體。圖14顯示了在培養(yǎng)上清中表達(dá)作為分泌蛋白的PPH的里氏木霉轉(zhuǎn)化體的SDS-PAGE。圖15顯示了毛果楊PPH的多肽序列(SEQ ID NO :5)。
圖16顯示了葡萄PPH的多肽序列(SEQ ID NO 6)。圖17 顯不了蓖麻(Ricinus communis)PPH 的多妝序列(SEQ ID NO :7)。圖18顯示了水稻(日本栽培群)PPH的多肽序列(SEQ ID NO 8)。圖19顯示了玉米PPH的多肽序列(SEQ ID NO 9)。圖20顯示了煙草PPH的多肽序列(SEQ ID NO 10)。圖21顯示了水稻日本栽培群PPH的多肽序列(SEQ ID NO : 11)。圖22顯示了(a)小立碗蘚小立碗亞種PPH的多肽序列(SEQ ID NO 12)和(b)擬南芥葉綠素酶的多肽序列(SEQ ID NO 20)。圖23顯示了擬南芥PPH蛋白與推定PPH的氨基酸序列比對(duì)。發(fā)現(xiàn)了如下所示氨基酸序列的保守區(qū)LPGFGVG (SEQ ID NO : 13)、DFLGQG (SEQ ID NO : 14)、GNSLGG (SEQ IDNO 15)、LVKGVTLLNATPFff (SEQ ID NO 16)、HPAA (SEQ ID NO 17)、EDPff (SEQ ID NO 18)及SPAGHCPH(SEQ ID NO :19)。圖24是本發(fā)明的油精制工藝的圖示。圖25是本發(fā)明的植物油精制工藝和裝置的圖示。圖26顯示了涉及葉綠素及其衍生物的反應(yīng)和本發(fā)明中使用的酶。圖27顯示了普通小麥(Triticum aestivum)葉綠素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO 21)。圖28顯示了編碼小麥葉綠素酶的核苷酸序列(SEQ ID NO 22)。圖29顯示了萊茵衣藻葉綠素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO 23)。圖30顯示了編碼萊茵衣藻葉綠素酶的核苷酸序列(SEQ ID NO 24)。圖31顯示了普通小麥葉綠素酶基因與aprE信號(hào)序列的融合體的示意圖。圖32顯示了含有小麥(普通小麥)葉綠素酶基因的質(zhì)粒pBN_TRI_CHL的示意圖。圖33顯示了萊茵衣藻葉綠素酶基因與aprE信號(hào)序列的融合體的示意圖。圖34顯示了含有萊茵衣藻葉綠素酶基因的質(zhì)粒pBN_CHL_CHL的示意圖。圖35顯示了與野生型酶相比缺乏N末端16個(gè)氨基酸的普通小麥葉綠素酶變體(小麥Ndl-16)的氨基酸序列(SEQ ID NO 25)。圖36顯示了編碼與野生型酶相比缺乏N末端16個(gè)氨基酸的普通小麥葉綠素酶的變體(小麥Ndl-16)的核苷酸序列(SEQ ID NO :26)。
具體實(shí)施例方式一方面，本發(fā)明涉及一種用于處理含有焦脫鎂葉綠素酶的組合物的方法。通常，實(shí)施所述方法以從所述組合物去除焦脫鎂葉綠素，或降低所述組合物中的焦脫鎂葉綠素水平，例如在焦脫鎂葉綠素作為污染物存在的情況。焦脫鎂葉綠素呈綠色，衍生自存在于分子中的卟啉(二氫卟酚)環(huán)。因此，組合物(例如植物油)中焦脫鎂葉綠素的存在可賦予所述組合物不合乎需要的綠色或淡綠色。在一種實(shí)施方式中，可實(shí)施本發(fā)明的方法以去除或降低組合物中存在的綠色。因此，本發(fā)明的方法可稱為漂白或脫色工藝。焦脫鎂葉綠素水解產(chǎn)生葉綠醇和焦脫鎂葉綠酸(見圖26)。焦脫鎂葉綠酸含有帶顏色的卟啉環(huán)，但葉綠醇鏈的喪失意味著焦脫鎂葉綠酸呈赤褐色，而非綠色。在某些實(shí)施方式中，還需要去除組合物中的焦脫鎂葉綠酸并降低 紅色/褐色。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法還可包括去除或降低組合物中的焦脫鎂葉綠酸水平的步驟。本發(fā)明的方法可涉及漂白或脫色以去除所述組合物中的綠色和/或紅色/褐色。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及篩選、表達(dá)以及應(yīng)用對(duì)于葉綠素的無鎂降解產(chǎn)物(特別地，至少焦脫鎂葉綠素，例如脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠素)具有活性而對(duì)葉綠素具有低活性或無活性的酶。優(yōu)選地，本發(fā)明的酶對(duì)葉綠素?zé)o鎂降解產(chǎn)物(優(yōu)選對(duì)焦脫鎂葉綠素)比對(duì)葉綠素的活性高80%，更優(yōu)選地，本發(fā)明的酶對(duì)葉綠素?zé)o鎂降解產(chǎn)物(優(yōu)選對(duì)焦脫鎂葉綠素)比對(duì)葉綠素的活性高90%。更優(yōu)選地，本發(fā)明的酶對(duì)葉綠素?zé)o鎂降解產(chǎn)物(優(yōu)選對(duì)焦脫鎂葉綠素)比對(duì)葉綠素的活性高95%。組合物根據(jù)本發(fā)明的方法，可對(duì)于任何包含焦脫鎂葉綠素的組合物進(jìn)行處理，以去除不合乎需要的焦脫鎂葉綠素污染。優(yōu)選地，所述組合物是植物源性制品、藻類制品或細(xì)菌源性制品，例如，所述組合物是源自任何種類的植物、藻類或細(xì)菌(例如藍(lán)細(xì)菌)的產(chǎn)品。在一種實(shí)施方式中，所述組合物包含植物原料、植物油或植物萃取物。術(shù)語“植物”包括完整植株、植株部分(例如，葉、莖、花、根等)、植物原生質(zhì)體、種子以及植物細(xì)胞及其子代。可在本發(fā)明的方法中處理的產(chǎn)品所源自的植物種類包括高級(jí)植物，包括被子植物(單子葉植物和雙子葉植物)以及裸子植物。其包括具有多種倍性水平的植物，包括多倍體、二倍體、單倍體以及半合子狀態(tài)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述組合物可包含植物油，例如蔬菜油，包括由油料種子或油料果實(shí)(例如，諸如油菜籽(rapeseed)油之類的種子油和諸如棕櫚之類的果實(shí)油)加工的油。合適的油的實(shí)例包括米糠油、大豆油、油菜籽油、棕櫚油、橄欖油、棉籽油、玉米油、棕櫚仁油、椰子油、花生油、芝麻油或向日葵油。本發(fā)明的方法可以與用于加工香精油(essential oil)、例如來自果實(shí)種子油(例如葡萄籽、杏、琉璃苣等的那些油)的方法聯(lián)合使用?？蛇x地，所述組合物可包含藻類制品；織物、線或纖維或布；或木制品或紙產(chǎn)品或副產(chǎn)品，例如木漿、紙漿、牛皮紙(Kraft)漿或非木紙產(chǎn)品或副產(chǎn)品，例如米紙。在所述方法的其他方面，所述組合物可包含藥物制劑或化妝品制劑(例如用于藥物和化妝品的脂質(zhì)體)、生物柴油、食品、食用油、飼料或食品添加劑。本發(fā)明的方法可用于處理源自植物(例如蔬菜或藻類)來源或可選來自合成來源的粗制油或精制油。本發(fā)明的方法可用于處理油濃度較高的粗制油或精制油，或在一方面用于處理非精制油和非稀釋粗制油。本發(fā)明的方法可以與用于處理高磷油(例如，大豆油)的方法聯(lián)合使用。焦脫鎂葉綠素去除焦脫鎂葉綠素可作為污染物天然存在于所述組合物(例如，制劑、飼料、食品或油)中，或作為不合乎需要的組分存在于經(jīng)加工的產(chǎn)品中。焦脫鎂葉綠素可以以任何水平存在于所述組合物中。通常，焦脫鎂葉綠素可作為天然污染物，以基于所述組合物(例如，植物油)的總重量O. 001至1000mg/kg(0. 001至IOOOppm, I(T7至IO^wt % )的濃度存在于所述組合物中。在其他實(shí)施方式中，焦脫鎂葉綠素可以以基于所述組合物的總重量O. I至100mg/kg、0. 5 至 50mg/kg、I 至 50mg/kg、I 至 30mg/kg 或 I 至 10mg/kg 的濃度存在于所述組合物中。本發(fā)明的方法通常降低所述組合物中焦脫鎂葉綠素的水平。例如，與處理前存在于總組合物中的焦脫鎂葉綠素濃度(按重量)相比，所述方法可將焦脫鎂葉綠素的濃度降低至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。因此，在具體實(shí)施方式
中，基于所述組合物(例如蔬菜油)的總重量，處理之后所述組合物(例如蔬菜油)中的焦脫鎂葉綠素濃度可為小于 100mg/kg、小于 50mg/kg、小于 30mg/kg、小于 10mg/kg、小于 5mg/kg、小于 lmg/kg、小于
O.5mg/kg、小于 O. lmg/kg 或小于 O. 02mg/kg。焦脫鎂葉綠酸去除本發(fā)明的方法可任選包括去除焦脫鎂葉綠酸的步驟。由于焦脫鎂葉綠素被本發(fā)明的酶水解，焦脫鎂葉綠酸可存在于所述組合物中，或可作為污染物天然存在，或作為不合乎需要的組分存在于經(jīng)加工的產(chǎn)品中。焦脫鎂葉綠酸還可由于脫鎂葉綠酸降解而存在于所述組合物中，脫鎂葉綠酸自身可通過具有脫鎂葉綠素酶活性的酶對(duì)于脫鎂葉綠素的活性而產(chǎn)生，或者脫鎂葉綠酸可在葉綠素酶對(duì)于葉綠素作用之后而由脫植基葉綠素生成(見圖26)。用于油精制的加工條件，特別是熱或在所述工藝中使用諸如脫鎂葉綠酸酶、葉綠素酶和/或脫鎂葉綠素酶均可有助于焦脫鎂葉綠酸生成中的多個(gè)步驟。焦脫鎂葉綠酸可以以任何水平存在于所述組合物中。通常，在根據(jù)本發(fā)明的方法使用焦脫鎂葉綠素酶處理之前或之后，焦脫鎂葉綠酸可以以基于所述組合物(例如植物油)的總重量O. 001至1000mg/kg(0. 001至IOOOppm, 1(Γ7至KT1Wt % )的濃度存在于所述組合物(例如植物油)中。在其他實(shí)施方式中，焦脫鎂葉綠酸可以以基于所述組合物的總重量 O. I 至 100mg/kg、0. 5 至 50mg/kg、l 至 50mg/kg、l 至 30mg/kg 或 I 至 10mg/kg 的濃度存在于所述組合物中。在一種實(shí)施方式中，相對(duì)于焦脫鎂葉綠素酶處理之前和/或之后的水平，本發(fā)明的方法降低所述組合物中的焦脫鎂葉綠酸水平。因此，在一些實(shí)施方式中，焦脫鎂葉綠酸的濃度可在焦脫鎂葉綠素酶處理之后增加。通常，所述方法包括去除焦脫鎂葉綠酸的步驟，使得焦脫鎂葉綠酸濃度低于焦脫鎂葉綠素酶處理之后的濃度。優(yōu)選地，由該酶促步驟產(chǎn)生的焦脫鎂葉綠酸從所述組合物去除，使得所述組合物中的焦脫鎂葉綠酸的終水平低于焦脫鎂葉綠素酶處理前的水平。例如，相對(duì)于焦脫鎂葉綠酸去除步驟之前(例如焦脫鎂葉綠素酶處理之前或之后)存在于總組合物中的焦脫鎂葉綠酸濃度(按重量)，所述方法可降低焦脫鎂葉綠酸的濃度至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。因此，在具體實(shí)施方式
中，在焦脫鎂葉綠酸去除步驟之后，所述組合物(例如植物油)中的焦脫鎂葉綠酸濃度可以為基于所述組合物(例如植物油)的總重量小于100mg/kg、小于50mg/kg、小于30mg/kg、小于10mg/kg、小于5mg/kg、小于 lmg/kg、小于 O. 5mg/kg、小于 O. lmg/kg 或小于 O. 02mg/kg。焦脫鎂葉綠素酶本發(fā)明的方法包括使含有焦脫鎂葉綠素 的組合物與具有焦脫鎂葉綠素酶活性的酶接觸的步驟。任何具有能夠修飾焦脫鎂葉綠素的活性的多肽均可用作本發(fā)明方法中的酶。對(duì)于“焦脫鎂葉綠素酶活性”，優(yōu)選是指該酶可水解焦脫鎂葉綠素中的酯鍵以產(chǎn)生葉綠醇和焦脫鎂葉綠酸。因此，所述酶通常具有酯酶或水解酶活性。優(yōu)選地，所述酶能夠在油相中、任選還在水相中具有焦脫鎂葉綠素酶活性。可使用任何合適的測(cè)定技術(shù)來檢測(cè)焦脫鎂葉綠素酶活性，例如，使用焦脫鎂葉綠素作為底物基于下文實(shí)施例中所述的酶活性(脫鎂葉綠素酶和焦脫鎂葉綠素酶活性)測(cè)定的技術(shù)。例如，可使用基于熒光的技術(shù)來檢測(cè)焦脫鎂葉綠素酶活性，例如，如下文實(shí)施例5所述通過監(jiān)測(cè)焦脫鎂葉綠酸來檢測(cè)。在一種合適的測(cè)定中，在焦脫鎂葉綠素存在下溫育待檢測(cè)焦脫鎂葉綠素酶活性的多肽，并通過熒光檢測(cè)來監(jiān)測(cè)焦脫鎂葉綠素、焦脫鎂葉綠酸和/或葉綠醇水平?？蛇x地，焦脫鎂葉綠素酶測(cè)定可基于添加推定酶之后對(duì)于焦脫鎂葉綠素、焦脫鎂葉綠酸和/或葉綠醇水平的HPLC檢測(cè)和定量，例如基于具體參考下文實(shí)施例5的實(shí)例中所述的技術(shù)。可使用例如Ali Khamessan 等(1994), Journal of Chemical Technology& Biotechnology, 60 (I),第 73-81 頁；Klein 和 Vishniac (1961), J. Biol. Chem. 236 2544-2547 ;以及 Kiani 等(2006) ,Analytical Biochemistry 353 :93-98 中所揭示的那些方法來檢測(cè)焦脫鎂葉綠素酶活性。在合適的情況下，可使用焦脫鎂葉綠素代替葉綠素作為底物?？蛇x地，合適的測(cè)定可基于添加推定的酶之后對(duì)于焦脫鎂葉綠素或焦脫鎂葉綠酸水平的HPLC檢測(cè)和定量，例如，基于下文所述的技術(shù)。在一種實(shí)施方式中，所述測(cè)定可基于Homero-Mendez 等(2005), Food Research International 38(8-9) :1067-1072 中所述的方法。在另一種實(shí)施方式中，可使用下列測(cè)定。向170 μ I mM HEPES (pH 7. 0)中添加20 μ I 0. 3mM溶于丙酮的焦脫鎂葉綠素。將酶溶于50mM HEPES (pH 7. 0)。將10 μ I酶溶液添加至190 μ I底物溶液，以啟動(dòng)反應(yīng)，并在40°C溫育多個(gè)時(shí)間段。通過添加350 μ I丙酮來終止反應(yīng)。在離心(18，000g, 2分鐘)之后，通過HPLC分析上清，并檢測(cè)焦脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠酸的量。I單位的焦脫鎂葉綠素酶活性被定義為在40°C下，例如在本文所述的測(cè)定方法中每分鐘水解I微摩爾焦脫鎂葉綠素的酶量。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，例如通過本文所述的測(cè)定方法所檢測(cè)，基于每g純化酶的活性單位，本發(fā)明方法中使用的酶具有至少100U/g、至少250U/g或至少500U/g的焦脫鎂葉綠素酶活性。在一些實(shí)施方式中，除了焦脫鎂葉綠素酶活性之外，所述酶還可具有其他活性，例如脫鎂葉綠素酶活性和/或葉綠素酶活性。因此，所述酶無需對(duì)于焦脫鎂葉綠素具有選擇性，并且除了焦脫鎂葉綠素之外，還能夠利用脫鎂葉綠素和/或葉綠素作為底物，只要所述酶對(duì)于焦脫鎂葉綠素顯示顯著活性。對(duì)于“酶”，意圖包括具有焦脫鎂葉綠素酶活性的任何多肽，包括例如催化抗體、酶片段等。任何分離、重組、合成或嵌合(或合成與重組的組合)多肽(例如，酶或催化抗體)均可以使用。因此，本發(fā)明使用的術(shù)語“焦脫鎂葉綠素酶”包括能夠水解焦脫鎂葉綠素的任何多肽。脫鎂葉綠素酶和葉綠素酶活性可通過與上文所述用于焦脫鎂葉綠素酶的那些方法類似的方法來測(cè)定，在合適的情況下，使用脫鎂葉綠素或葉綠素代替焦脫鎂葉綠素作為底物。在一種實(shí)施方式中，所述酶能夠水解脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠素。更優(yōu)選地，所述酶能夠水解脫鎂葉綠素和焦脫鎂葉綠素，但不能水解葉綠素。例如，所述酶可以是脫鎂葉綠素酶或脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶(PPH)，例如Schelbert等，The Plant Cell 21 767-785(2009)中所述的酶。 在另一種實(shí)施方式中,優(yōu)選地,所述酶具有小于80、小于70、小于60、小于50、小于40或小于30的脫鎂葉綠素酶/焦脫鎂葉綠素酶活性比。例如，所述酶具有O. I至70、1至50或10至30的脫鎂葉綠素酶/焦脫鎂葉綠素酶活性比。脫鎂葉綠素酶/焦脫鎂葉綠素酶活性比可通過使用上文所述方法檢測(cè)脫鎂葉綠素酶活性和焦脫鎂葉綠素酶活性，并通過由脫鎂葉綠素酶活性除以焦脫鎂葉綠素酶活性來計(jì)算。特別優(yōu)選的具有低脫鎂葉綠素酶/焦脫鎂葉綠素酶活性比的酶源自下文所述的小麥或衣藻。在一種實(shí)施方式中，所述酶源自小麥，例如來自小麥屬，特別是來自普通小麥Triticum aestivum。例如,所述酶可為包含SEQ ID NO :21的序列的多肽(見圖27),或可由SEQ ID NO 22的核苷酸序列編碼(見圖28)。在另一種實(shí)施方式中，所述酶源自衣藻屬，特別是來自萊茵衣藻。例如，所述酶可為包含SEQ ID NO 23的序列的多肽(見圖29)，或可由SEQ ID NO 24的核苷酸序列編碼(見圖30)。在一種實(shí)施方式中，所述酶為葉綠素酶和/或焦脫鎂葉綠素酶的N末端截短變體，例如，SEQ ID NO USEQ ID NO :4至12任一者、或SEQ ID NO :21或23的N末端截短變體。在具體的實(shí)施方式中，與母序列相比，這樣的N末端截短變體在N末端可缺少至少I、2、5、10或15個(gè)氨基酸(例如，I至30或5至20個(gè)氨基酸)。在一種實(shí)施方式中，所述酶包含SEQID NO 25的序列(見圖35)，即SEQ ID NO 21的N末端截短變體。令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)來自小麥和衣藻的葉綠素酶具有焦脫鎂葉綠素酶活性，和較低的脫鎂葉綠素酶/焦脫鎂葉綠素酶活性比。另外，與野生型酶相比，小麥葉綠素酶的N末端截短變體具有降低的脫鎂葉綠素酶/焦脫鎂葉綠素酶活性比。脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，除了脫鎂葉綠素，PPH和相關(guān)酶還能夠水解焦脫鎂葉綠素。然而，PPH對(duì)葉綠素沒有活性。如Schelbert等人所述的，PPH直向同源物通常存在于真核光合作用生物中。PPH表現(xiàn)為在種系發(fā)生上不同于葉綠素酶的α/β水解酶亞組，這兩組在序列同源性和底物上存在區(qū)別。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述酶可為源自任何物種的任何已知ΡΡΗ，或其功能性變體或片段，或可衍生自任何已知的PPH酶。例如，在一種實(shí)施方式中，所述酶為來自擬南芥的ΡΡΗ，例如包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的多肽，或由SEQ ID NO :2核苷酸序列編碼的多肽(NCBI登錄號(hào)NP_196884，GenBank ID No. 15240707)，或它們的功能性變體或片段。在另一種實(shí)施方式中，所述酶包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列，或由SEQ ID NO :3的核苷酸序列編碼的多肽，或其功能性變體或片段。在其他實(shí)施方式中，所述酶可為源自任何下列物種的PPH:擬南芥、毛果楊、葡萄、水稻、玉米、煙草、綠色鞭毛藻、青綠藻、小立碗蘚、三角褐指藻、萊茵衣藻或微胞藻RCC299。例如，所述酶可為包含表I中所示的下列數(shù)據(jù)庫條目中任一所列的氨基酸序列或由其中所列的核苷酸序列編碼的多肽，或其功能性片段或變體。表I生物登錄號(hào)GenbankID
擬南芥NP_19688415240707
毛果楊XP_002314066224106163
葡萄CA040741157350650
水稻(日本栽培群)NP—001057593115467988
玉米ACF87407194706646
煙草CA099125156763846
綠色鞭毛藻XP_001415589145340970
青綠藻CAL50341116000661
小立碗蘚XP_001761725168018382
三角褐指藻XP_002181821219122997
萊茵衣藻XP—001702982159490010
微胞藻 RCC299AC062405226516410例如，所述酶可為SEQ ID NO :5至12任一者所示的多肽，或其功能性片段或變體。變體和片段已知的焦脫鎂葉綠素酶(例如PPH)序列的功能性變體和片段也可用于本發(fā)明。對(duì)于“功能性”，是指所述片段或變體保留可檢測(cè)的焦脫鎂葉綠素酶活性。通常，所述變體和片段在至少約10、20、30、50、100、200、300、500或1000或更多殘基或全長序列上顯示與已知的焦脫鎂葉綠素酶(例如PPH)序列具有同源性，例如，與已知的焦脫鎂葉綠素酶(例如PPH)氨基酸序列(例如，與SEQ ID NO :1、或與SEQ ID NO :4至12任一者或表I中所示的序列，或與 SEQ ID N0:21、23 或 25)至少約 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同源性。序列同一性百分?jǐn)?shù)可通過使用序列比對(duì)算法分析或通過目測(cè)來確定。一方面，序列比對(duì)算法是BLAST算法，例如BLAST 2. 2. 2版算法。其他適用于本發(fā)明方法的具有焦脫鎂葉綠素酶活性的酶可通過確定存在于例如已知PPH序列中的保守序列基序的存在來鑒定。保守序列基序包括下列基序LPGFGVG(SEQID NO :13)、DFLGQG(SEQ ID NO : 14)、GNSLGG(SEQ ID NO 15),LVKGVTLLNATPFff(SEQ ID NO:16) ,HPAA(SEQ ID NO :17)、EDPW(SEQ ID NO :18)以及 SPAGHCPH(SEQ ID NO :19)。因此，用于本發(fā)明的優(yōu)選焦脫鎂葉綠素酶包含這些序列中的一種或多種。GNSLGG (SEQ ID NO :15)基序含有活性位點(diǎn)絲氨酸殘基。特別優(yōu)選的是，用于本發(fā)明的方法的酶包含GNSLGG序列?？赏ㄟ^搜索基因組數(shù)據(jù)庫、例如微生物組宏基因組數(shù)據(jù)庫(JGI-DOE，USA)確定這些基序的存在來鑒定具有合適的焦脫鎂葉綠素酶活性的多肽序列。焦脫鎂葉綠素酶的分離和制備用于本發(fā)明的酶可從它們的天然來源分離或可例如使用重組DNA技術(shù)制備。可分離或構(gòu)建編碼具有焦脫鎂葉綠素酶活性的多肽的核苷酸序列并將其用于制備相應(yīng)的多肽。例如，可使用來自產(chǎn)生所述多肽的生物的染色體DNA或信使RNA構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫。如果已知多肽的氨基酸序列，可合成標(biāo)記的寡核苷酸探針并將其用于從由所述生物制備的基因組文庫中鑒定編碼多肽的克隆。可選地，也可使用含有與另一已知多肽基因同源的序列的標(biāo)記寡核苷酸探針來鑒定編碼多肽的克隆。在后一種情況中，可使用嚴(yán)謹(jǐn)性較低的雜交和洗滌條件。 可選地，可通過如下方法來鑒定編碼多肽的克隆將基因組DNA的片段插入表達(dá)載體(例如質(zhì)粒)、使用所產(chǎn)生的基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化酶陰性細(xì)菌、然后將所轉(zhuǎn)化的細(xì)菌鋪板至含有被所述多肽抑制的酶的瓊脂上，由此得以鑒定表達(dá)所述多肽的克隆。再者，也可以通過成熟的標(biāo)準(zhǔn)方法通過合成來制備編碼所述多肽的核苷酸序列，如 Beucage S. L.等(1981) Tetrahedron Letters 22,第 1859-1869 頁描述的亞憐酸胺法，或Matthes等(1984) EMBO J. 3，第801-805頁描述的方法。在亞磷酰胺法中，在如自動(dòng)DNA合成儀上合成寡核苷酸，然后將其純化、退火、連接并克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中。所述核苷酸序列可以是源自混合的基因組和合成來源、混合的合成和cDNA來源、或混合的基因組和cDNA來源，其根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過連接源自合成、基因組或cDNA來源(根據(jù)需要)的片段而制得。每個(gè)連接的片段對(duì)應(yīng)于整個(gè)核苷酸序列的不同部分。所述DNA序列也可以使用特定引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來制備，如US 4，683，202或Saiki R K等(Science (1988) 239，第 487-491 頁)中所述。本文所用的術(shù)語“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其變體、同源物、片段和衍生物(例如其部分)。所述核苷酸序列可以是源自基因組或合成或重組的來源，其可以是雙鏈的或單鏈的(無論其代表正義鏈還是反義鏈)。通常，使用重組DNA技術(shù)制備編碼具有焦脫鎂葉綠素酶活性的多肽的核苷酸序列。然而，在本發(fā)明的另一種可選實(shí)施方式中，可以使用本領(lǐng)域已知的化學(xué)方法來合成全部或部分核苷酸序列(見 Caruthers MH 等(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 和 HornT 等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。酶序列的修飾一旦分離出編碼酶的核苷酸序列或鑒定出編碼推定的酶的核苷酸序列后，可能需要對(duì)所選擇的核苷酸序列進(jìn)行修飾，例如可能需要對(duì)所述序列進(jìn)行突變以制備本發(fā)明的酶?？梢允褂煤铣傻墓押塑账醽硪胪蛔?。這些寡核苷酸包含位于所需突變位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸序列。Morinaga等(Biotechnology (1984) 2,第646-649頁)中公開了適合的方法。Nelson 和 Long (Analytical Biochemistry (1989), 180,第 147-151 頁)中描述了向編碼酶的核苷酸序列中弓I入突變的另一種方法?？梢噪S機(jī)引入突變以代替如上文所述的定點(diǎn)誘變，如使用可商購的試劑盒，如來自 Stratagene 的 GeneMorph PCR 誘變?cè)噭┖?或來自 Clontech 的 Diversify PCR 隨機(jī)誘變?cè)噭┖小P O 583 265涉及用于優(yōu)化基于PCR的誘變的方法，其也可以與諸如EP O 866796中所述的那些DNA突變類似物結(jié)合使用。易錯(cuò)PCR技術(shù)也適用于制備具有優(yōu)選性質(zhì)的焦脫鎂葉綠素酶變體。W00206457提到了脂酶的分子進(jìn)化。獲得新型序列的第三種方法是使用任何數(shù)量的限制性酶或如Dnase I的酶將不同的核苷酸序列片段化，并重新組裝成編碼功能性蛋白的全長核苷酸序列。或者，可以使用一個(gè)或多個(gè)不同的核苷酸序列，并在重新組裝全長核苷酸序列時(shí)引入突變。DNA改組(shuffling)和家族改組技術(shù)適用于制備具有優(yōu)選性質(zhì)的焦脫鎂葉綠素酶變體。適合進(jìn)行“改組”的方法可以見EP0752008、EP1138763、EP1103606。改組也可以與如US 6，180，406和TO 01/34835中所述的其他形式的DNA誘變相結(jié)合。因此，有可能在體內(nèi)或體外在核苷酸序列中產(chǎn)生大 量定點(diǎn)突變或隨機(jī)突變，并隨后通過多種手段篩選功能性得到改進(jìn)的編碼多肽?？梢允褂美缬?jì)算機(jī)分析(insilico)和外切酶介導(dǎo)(exo-mediated)的重組方法(見 WO 00/58517、US 6，344，328、US6，361，974)進(jìn)行分子進(jìn)化，其中所產(chǎn)生的變體保留了與已知酶或蛋白的很低的同源性。由此獲得的所述變體可與已知的脫鎂葉綠素酶或焦脫鎂葉綠素酶具有顯著的結(jié)構(gòu)類似性，但具有很低的氨基酸序列同源性。此外，如在非限定性實(shí)例中，多核苷酸序列的突變體或天然變體也可以與野生型或其他突變體或天然變體重組以生產(chǎn)新的變體。也可以篩選所述新的變體以獲得功能性得到改進(jìn)的編碼多肽。應(yīng)用上述以及類似的分子進(jìn)化方法能夠在沒有關(guān)于蛋白結(jié)構(gòu)或功能的任何現(xiàn)有知識(shí)的情況下，鑒定和選擇具有優(yōu)選特性的本發(fā)明的酶的變體，并能夠產(chǎn)生不可預(yù)測(cè)但有益的突變體或變體。在本領(lǐng)域中應(yīng)用分子進(jìn)化來優(yōu)化或改變酶活性的實(shí)例有很多，所述實(shí)例包括但不限于以下的一種或多種優(yōu)化在宿主細(xì)胞或體外的表達(dá)和/或活性、增加酶活性、改變底物和/或產(chǎn)物特異性、增加或降低酶穩(wěn)定性或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、改變?cè)趦?yōu)選環(huán)境條件(如溫度、pH、底物)中酶的活性/特異性。使用分子進(jìn)化工具可以改變酶以提高該酶的功能性，這對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。適合地，用于本發(fā)明的編碼焦脫鎂葉綠素酶(例如PPH)的核苷酸序列可以編碼焦脫鎂葉綠素酶變體(例如PPH變體)，即當(dāng)與親本酶比較時(shí)，所述焦脫鎂葉綠素酶(例如PPH)可以包含至少一個(gè)氨基酸的取代、缺失或添加。變體酶保持與親本酶至少1%、2%,3%,5% ,10% ,15%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,97%,99%的同源性。適合的親本酶可以包括具有焦脫鎂葉綠素酶活性的任何酶。焦脫鎂葉綠素酶多肽序列本發(fā)明還涵蓋由編碼焦脫鎂葉綠素酶的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列在本發(fā)明任一方法和/或用途中的用途。本文所使用的術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“多肽”和/或術(shù)語“蛋白”同義。在一些情況下，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“肽”同義。所述氨基酸序列可以從適合的來源制備/分離，或其可以通過合成制備、或其可以使用重組DNA技術(shù)制備。適合地，所述氨基酸序列可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從本文教導(dǎo)的分離多肽獲得。一種適合測(cè)定分離多肽的氨基酸序列的方法如下可以將純化的多肽凍干，并將100 μ g的凍干原料溶解于8M尿素和O. 4M碳酸氫銨的50 μ I混合物(pH 8. 4)中。在覆蓋氮?dú)獠⑻砑?μ I 45mM 二硫蘇糖醇后，可以將溶解的蛋白在50°C變性并還原15分鐘。冷卻至室溫后，可以添加5μ I IOOmM碘乙酰胺，從而使半胱氨酸殘基在室溫、避光和氮?dú)庀卵苌?5分鐘?？梢韵蛞陨戏磻?yīng)混合物中添加135 μ I水和含5 μ g內(nèi)切蛋白酶Lys_C的5 μ I水溶液，并在37°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下消化24小時(shí)?？梢允褂萌軇〢(0. 1% TFA的水溶液)和溶劑B (O. I % TFA 的乙臆溶液)在 VYDAC C18 柱(O. 46 X 15cm ; 10 μ m ;The Separation Group,California, USA)上通過反相HPLC分離所得到的肽。在N-末端測(cè)序前，可以使用相同的溶劑體系在Develosil C18柱上對(duì)所選擇的肽進(jìn)行重新色譜分析?？梢允褂肁ppliedBiosystems 476A 測(cè)序儀,根據(jù)制造商的說明書(Applied Biosystems, California, USA)使用脈沖液態(tài)快速循環(huán)來完成測(cè)序。 序列比對(duì)在此，術(shù)語“同源物”是指與目標(biāo)氨基酸序列和目標(biāo)核苷酸序列具有一定同源性的實(shí)體。在此，術(shù)語“同源性”可以等同于“同一性”。所述同源氨基酸序列和/或核苷酸序列可以提供和/或編碼保留所述酶的功能活性和/或增強(qiáng)所述酶的活性的多肽。在本文中，認(rèn)為同源序列包括可以與目標(biāo)序列有至少75%、85%或90%同一性，優(yōu)選為至少95%或98%同一性的氨基酸序列。通常，同源物將包含與目標(biāo)氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)等。雖然同源性也可以被視為相似性(即具有相似化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)，但是在本發(fā)明的內(nèi)容中，優(yōu)選地，以序列同一性表示同源性。在本文中，認(rèn)為同源序列包括可以與編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列(目標(biāo)序列)有至少75 %、85 %或90 %同一性的核苷酸序列，優(yōu)選為至少95 %或98 %同一性的核苷酸序列。通常，同源物將包括與目標(biāo)序列相同的活性位點(diǎn)編碼序列等。雖然同源性也可以被視為相似性(即具有相似化學(xué)性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)，但是在本發(fā)明的內(nèi)容中，優(yōu)選地，以序列同一性表示同源性?？梢酝ㄟ^目測(cè)進(jìn)行同源性比較，或者更通常是借助易于獲得的序列比較程序進(jìn)行同源性比較。這些商業(yè)性計(jì)算機(jī)程序可以計(jì)算兩個(gè)或多個(gè)序列間的同源性％?？梢栽谶B續(xù)的序列中計(jì)算同源性％，即一個(gè)序列與其他序列比對(duì)，且將一個(gè)序列中的每個(gè)氨基酸與其他序列中的相應(yīng)氨基酸直接比較，每次比較一個(gè)殘基。這被稱為“無缺口”比對(duì)。通常所述無缺口比對(duì)僅在數(shù)量相對(duì)少的殘基中進(jìn)行。雖然這是非常簡(jiǎn)單且穩(wěn)定的方法，但是其未能考慮到如在其他方面相同的成對(duì)序列中，一個(gè)插入或缺失將引起隨后的氨基酸殘基無法比對(duì)，因此可能導(dǎo)致在進(jìn)行整體比對(duì)時(shí)的同源性％大大降低。因此，大部分序列比對(duì)方法被設(shè)計(jì)成產(chǎn)生考慮了可能的插入和缺失而不過度地懲罰整體同源性得分的最佳比對(duì)。這可以通過在比對(duì)序列中插入“缺口”以試圖使局部同源性最大化而實(shí)現(xiàn)。然而，這些更加復(fù)雜的方法給比對(duì)中出現(xiàn)的每個(gè)缺口賦予“缺口罰分”，使得對(duì)于相同數(shù)目的相同氨基酸，具有盡量少缺口的序列比對(duì)(反映了兩個(gè)比較的序列間更高的相關(guān)性)將比具有更多缺口的序列比對(duì)得到更高的得分。通常使用“仿射缺口罰分”(Affinegap cost),即對(duì)缺口的存在處以較高罰分,而對(duì)缺口中的每個(gè)后續(xù)殘基處以較小罰分。這是最常用的缺口評(píng)分系統(tǒng)。高缺口罰分無疑將產(chǎn)生具有更少缺口的優(yōu)化比對(duì)。大多數(shù)比對(duì)程序允許修正缺口罰分。然而，當(dāng)使用所述軟件進(jìn)行序列比較時(shí)，優(yōu)選使用默認(rèn)值。
因此，最大同源性％的計(jì)算首先需要在考慮缺口罰分下產(chǎn)生最佳的比對(duì)。適合用于進(jìn)行所述比對(duì)的計(jì)算機(jī)程序?yàn)閂ector NTI Advance 11 (Invitrogen Corp.) 可以進(jìn)行序列比較的其他軟件的實(shí)例包括但不限于BLAST軟件包(見Ausubel等1999 ShortProtocols in Molecular Biology,第 4 版，第 18 章)和 FASTA (Altschul 等 1990 J. Mol.Biol. 403-410)。BLAST和FASTA均可進(jìn)行離線和在線搜索(見Ausubel等1999，第7-58至7-60頁)。然而，對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選使用Vector NTI Advance 11程序。也可以將稱為BLAST 2 Sequences的新型工具用于比較蛋白和核苷酸序列(見FEMS Microbiol Lett1999 174(2) :247-50 ;和 FEMS Microbiol Lett 1999 177(1) :187-8)。雖然可以根據(jù)同一性來測(cè)定最終的同源性％ ，但是比對(duì)方法本身通常不是基于全是或全非的成對(duì)比較。作為代替，通常使用尺度相似性評(píng)分矩陣(scaled similarityscore matrix)，基于化學(xué)相似性或進(jìn)化距離對(duì)每對(duì)比較評(píng)分。通常所用的此矩陣的實(shí)例為BL0SUM62矩陣(BLAST程序套裝的默認(rèn)矩陣)。Vector NTI程序通常使用公開的默認(rèn)值，或者也可能使用所提供的自定義符號(hào)比較表(更多細(xì)節(jié)詳見用戶手冊(cè))。對(duì)于一些應(yīng)用，優(yōu)選使用Vector NTI Advance 11軟件包的默認(rèn)值。或者，也可以使用基于與CLUSTAL(Higgins DG 和 Sharp PM(1988), Gene 73(1)，237-244)類似的算法的 Vector NTI Advance 11 (Invitrogen Corp.)中的多重比對(duì)特征來計(jì)算同源性％。一旦軟件生成了最佳比對(duì)，就可以計(jì)算同源性％，優(yōu)選為序列同一性％。軟件通常將其作為序列比較的一部分來執(zhí)行，并生成數(shù)值結(jié)果。如果在測(cè)定序列同一性時(shí)使用缺口罰分，則優(yōu)選使用程序的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行成對(duì)比對(duì)。例如，下列參數(shù)是目前用于BLAST 2成對(duì)比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)
_BLAST 2__DNA__蛋白質(zhì)_
_期望閾值__1 ____10_
_^__11__3_
_評(píng)分參數(shù)___
_匹酉己/錯(cuò)配得分__2、-3__n/a _
___n/a__BLOSUM62_
缺口評(píng)分開口 5 開口 11__延伸2__延伸I_在一種實(shí)施方式中，優(yōu)選地，核苷酸序列和/或氨基酸序列的序列同一性可使用BLAST2 (blastn)和如上所列的評(píng)分參數(shù)來確定。出于本發(fā)明的目的，同一性的程度基于相同的序列元件的數(shù)量來確定。本發(fā)明氨基酸序列的同一性程度可以通過本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序的方法,如Vector NTIAdvance 11 (Invitrogen Corp.)來適當(dāng)?shù)販y(cè)定。對(duì)于成對(duì)比對(duì),所用的評(píng)分參數(shù)優(yōu)選為缺口開口罰分為11且缺口延伸罰分為I的BL0SUM62。適合地，在至少20個(gè)連續(xù)的核苷酸中、優(yōu)選在至少30個(gè)連續(xù)的核苷酸中、優(yōu)選在至少40個(gè)連續(xù)的核苷酸中、優(yōu)選在至少50個(gè)連續(xù)的核苷酸中、優(yōu)選在至少60個(gè)連續(xù)的核苷酸中、優(yōu)選在至少100個(gè)連續(xù)的核苷酸中測(cè)定核苷酸序列的同一性程度。適合地，可在全長序列上測(cè)定核苷酸序列的同一性程度。氨基酸突變所述序列也可以具有產(chǎn)生沉默改變和產(chǎn)生功能等價(jià)物的氨基酸殘基的缺失、插入或取代?？梢愿鶕?jù)殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)上的相似性來進(jìn)行謹(jǐn)慎的氨基酸取代，只要該物質(zhì)的二級(jí)結(jié)合活性被保持即可。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有相似親水性值的不帶電荷的極性頭基團(tuán)的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。例如可以根據(jù)下表進(jìn)行保守取代。在第二列中相同欄中的氨基酸，優(yōu)選在第三列中相同行中的氨基酸可以相互取代
權(quán)利要求
1.一種用于處理含有焦脫鎂葉綠素的組合物的方法，其包括使所述組合物與能夠水解焦脫鎂葉綠素的酶接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述組合物包括植物源性油。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述酶包括脫鎂葉綠素酶或脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶。
4.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述酶源自擬南芥(Arabidopsisthaliana)、毛果楊(Populus trichocarpa)> 葡萄(Vitis vinifera)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zea mays)、煙草(Nicotiana tabacum)、綠色鞭毛藻(OstreococcusIucimarinus)、青綠藻(Ostreococcus taurii)、小立碗蘚(Physcomitrella patens)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、普通小麥(triticum aestivum)或微胞藻(Micromonas sp.)RCC299。
5.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述酶包含選自下列的氨基酸序列LPGFGVG (SEQ ID NO : 13)、DFLGQG (SEQ ID NO : 14)、GNSLGG (SEQ ID NO :15)、LVKGVTLLNATPFff (SEQ ID NO : 16)、HPAA (SEQ ID NO : 17)、EDPW (SEQ ID NO :18)以及SPAGHCPH(SEQ ID NO :19)。
6.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述酶包含SEQID NO=USEQ ID N0:4至12任一者或SEQ ID NO :21、23或25任一者所示的多肽序列或其功能性片段或變體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述酶包含在至少50個(gè)氨基酸殘基上與SEQIDNO USEQ ID NO :4至12任一者或SEQ ID NO :21、23或25任一者具有至少75%序列同一性的多肽序列。
8.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述組合物中的焦脫鎂葉綠素被水解生成焦脫鎂葉綠酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其還包括從所述組合物中去除焦脫鎂葉綠酸的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述方法包括脫臭步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所述的方法，其中所述方法包括二氧化硅處理的步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述方法包括兩個(gè)或多個(gè)二氧化硅處理步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或權(quán)利要求12所述的方法，其中所述二氧化硅處理在約70至110°C下進(jìn)行。
14.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中將所述能夠水解焦脫鎂葉綠素的酶固定于固體支持體上。
15.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其還包括使所述組合物與具有葉綠素酶活性的酶接觸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中將所述具有葉綠素酶活性的酶固定于固體支持體上。
17.根據(jù)權(quán)利要求2至16任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物包括選自米糠油、大豆油、油菜籽油、棕櫚油、橄欖油、棉籽油、玉米油、棕櫚仁油、椰子油、花生油、芝麻油或向日葵油的油。
18.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中，與處理前存在于所述組合物中的焦脫鎂葉綠素的濃度相比，所述組合物中焦脫鎂葉綠素的濃度降低至少10 %。
19.一種用于精制植物油的工藝，其包括前述任一權(quán)利要求所述的方法。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的工藝，其還包括己烷萃取和/或脫膠步驟。
21.具有焦脫鎂葉綠素酶活性的多肽用于從組合物中去除焦脫鎂葉綠素污染的用途。
22.一種用于對(duì)含有焦脫鎂葉綠素的組合物進(jìn)行酶處理的裝置，該裝置包括(a)植物油精制裝置；和(b)可操作地并入所述植物油精制裝置中具有焦脫鎂葉綠素酶活性的多肽，從而使所述多肽能夠在精制所述組合物的過程中水解所述組合物中的焦脫鎂葉綠素。
23.一種組合物，其包含固定于二氧化硅上的具有焦脫鎂葉綠素酶活性的多肽。
24.—種多肽，其具有如SEQ ID NO :4所示的序列，或由SEQ ID NO :3所示的序列編碼的序列，或具有焦脫鎂葉綠素酶活性的其功能性變體或片段。
25.可通過權(quán)利要求I至20任一項(xiàng)所述的工藝或方法獲得的組合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求I至18任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶具有小于80的脫鎂葉綠素酶/焦脫鎂葉綠素酶活性比。
27.一種多肽，其具有SEQ ID NO :25所示序列，或具有焦脫鎂葉綠素酶活性的其功能性變體或片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于處理含有焦脫鎂葉綠素的組合物，特別是用于從中去除焦脫鎂葉綠素的方法和用途。所述組合物通常是植物源性、藻源性或細(xì)菌源性產(chǎn)品，例如植物油。所述方法包括使所述組合物與具有焦脫鎂葉綠素酶活性的酶接觸的步驟。本發(fā)明還提供了用于實(shí)施所述方法和用途的相關(guān)裝置和產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C11B3/00GK102803479SQ201080026156
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月12日
發(fā)明者約恩·博爾奇·瑟, 夏洛特·霍斯曼斯·波爾森, 馬蘇德·拉賈比·扎爾加海, 延斯·弗里斯貝克·瑟倫森, 蒂娜·約恩森, 詹妮·布倫斯特德, 勒內(nèi)·米凱爾森, 蘇珊·M·馬德里德 申請(qǐng)人:杜邦營養(yǎng)生物科學(xué)有限公司