一種九味獐牙菜片的制備方法及其在制備抑制乳腺腫瘤細(xì)胞c127細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種九味獐牙菜片的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的九味獐牙菜片的制備方法，由獐牙菜53.6g、金腰草17.9g、榜嘎35.7g、木香35.7g、兔耳草35.7g、苦荬菜42.9g、角茴香35.7g、小檗皮28.6g、波棱瓜子14.2g作為原料藥制成，采用超臨界萃取、微波萃取和大孔樹脂吸附制備而成，使得鹽酸小檗堿含量有很大提高。本發(fā)明還提供了九味獐牙菜片在制備抑制小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞C127細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
【專利說明】一種九味獐牙菜片的制備方法及其在制備抑制乳腺腫瘤細(xì) 胞C127細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種九味獐牙菜片的制備方法及其在制備抑 制小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞C127細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 九味獐牙菜膠囊標(biāo)準(zhǔn)號WS-11182 (ZD-1182)-2002,記載于國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編 內(nèi)科肝膽分冊。由獐牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香35. 7g、兔耳草35. 7g、苦荬 菜42. 9g、角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波棱瓜子14. 2g作為原料藥制成，具有清熱，消炎，止 痛的功效。用于膽囊炎，急性黃疸型肝炎。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有九味獐牙菜膠囊在提取制備方面采用CO2超臨界萃取、微波技 術(shù)和大孔樹脂吸附技術(shù)提取的報(bào)道，而中藥直接打粉取的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo) 致患者用量過大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種九味獐牙菜片的制備方法。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種九味獐牙菜片在制備抑制小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞 C127細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過如下的方案實(shí)現(xiàn)的： 一種九味獐牙菜片的制備方法，由獐牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香 35. 7g、兔耳草35. 7g、苦荬菜42. 9g、角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波棱瓜子14. 2g作為原 料藥制成，所述的制備方法由下列步驟組成：取木香、角茴香，粉碎成細(xì)粉，加入到C02超 臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力 20-30MPa，溫度30-50°C，C02流量l-3ml/g生藥·π?η，萃取時(shí)間130-170min，得超臨界萃取 物，備用；萃取后的木香、角茴香殘?jiān)c其他七味藥材，粉碎，加入2L的60%乙醇，投入微波 萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃 縮，加到DiaionHP-10大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回 收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙醇 制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0. 3g。
[0007] 上述的九味獐牙菜片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃取溶劑 的體積百分比為5%。
[0008] 上述的九味獐牙菜片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為25MPa。
[0009] 上述的九味獐牙菜片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為60°C。
[0010] 上述的九味獐牙菜片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中CO2流量2!111/^生 藥·min〇
[0011] 上述的九味獐牙菜片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取時(shí)間為150min。
[0012] 上述的九味獐牙菜片的制備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0013] 上述的九味獐牙菜片的制備方法中，所述微波萃取每次萃取時(shí)間為8分鐘。
[0014] 上述的九味獐牙菜片在制備抑制小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞C127細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng) 用。
[0015] 現(xiàn)有技術(shù)中，九味獐牙菜膠囊口服，一次4-5粒，一日2-3次。九味獐牙菜膠囊服 藥量大。采用本發(fā)明方法制備成的九味獐牙菜片每片重〇. 3g，每次僅需2片，一日服用2-3 次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過下述試驗(yàn)證明。
[0016] 試驗(yàn)一、不同方法制備的九味獐牙菜片中鹽酸小檗堿含量的比較 1、儀器及試藥本發(fā)明九味獐牙菜片：按實(shí)施例1方法制備，使用300g原料藥，經(jīng)提取 制成200片，每片重0. 3g。原九味獐牙菜膠囊，按照WS-11182 (ZD-1182)-2002標(biāo)準(zhǔn)方法 制備，作為對照。Agilentl200高效液相色譜儀；AE240電子分析天平；鹽酸小檗堿對照品 (中國藥品生物制品檢定所)。
[0017] 2、方法 照高效液相色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VID)測定。
[0018] 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙 腈-0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3) (22:78)為流動相；檢測波長為 347nm。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。
[0019] 對照品溶液的制備精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成每Iml含鹽酸 小檗堿28Pg的溶液，即得。
[0020] 本發(fā)明產(chǎn)品供試品溶液的制備取本發(fā)明的九味獐牙菜片，研細(xì)，取0.lg，精密稱 定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，超聲處理50分鐘，放冷，再稱定重量， 用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取上清液，用微孔濾膜（〇. 45Mm)濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0021] 對照品供試品溶液的制備取本對照的九味獐牙菜膠囊，研細(xì)，取〇. 5g，精密稱 定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，超聲處理50分鐘，放冷，再稱定重量， 用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取上清液，用微孔濾膜（〇. 45Mm)濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0022] 測定法分別精密吸取對照品溶液、本發(fā)明產(chǎn)品供試品溶液與對照品供試品溶液 各5μ1，注入液相色譜儀，測定，即得。
[0023] 3、結(jié)果 結(jié)果表明，本發(fā)明九味獐牙菜片中鹽酸小檗堿的含量為3. 6-7mg/片；而原九味獐牙菜 膠囊中鹽酸小檗堿的含量為〇. 71mg/粒，每片鹽酸小檗堿含量相當(dāng)于原膠囊劑含量的5-10 倍，在服用量減少的情況下，鹽酸小檗堿含量有很大提高。
[0024] 上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的九味獐牙菜片，有效成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高 于WS-11182 (ZD-1182) -2002標(biāo)準(zhǔn)記載的方法制備的九味獐牙菜膠囊。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解 本發(fā)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述 內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0026] 實(shí)施例1 取猜牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香35. 7g、兔耳草35. 7g、苦荬菜42. 9g、 角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波棱瓜子14. 2g:取木香、角茴香，粉碎成細(xì)粉，加入到CO2超臨 界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa， 溫度40°C，C(V流量2ml/g生藥·π?η，萃取時(shí)間150min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的木 香、角茴香殘?jiān)c其他七味藥材，粉碎，加入2L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波 萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DiaionHP-10大孔吸 附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波 提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200 片，每片重0. 3g。
[0027] 經(jīng)檢測，成品中鹽酸小檗堿的含量為7. 05mg/片。
[0028] 實(shí)施例2 取猜牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香35. 7g、兔耳草35. 7g、苦荬菜42. 9g、 角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波棱瓜子14. 2g:取木香、角茴香，粉碎成細(xì)粉，加入到CO2超臨 界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力30MPa， 溫度50°C，C(V流量3ml/g生藥·π?η，萃取時(shí)間130min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的木 香、角茴香殘?jiān)c其他七味藥材，粉碎，加入2L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波 萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DiaionHP-10大孔吸 附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波 提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200 片，每片重0. 3g。
[0029] 經(jīng)檢測，成品中鹽酸小檗堿的含量為3. 60mg/片。
[0030] 實(shí)施例3 取猜牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香35. 7g、兔耳草35. 7g、苦荬菜42. 9g、 角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波棱瓜子14. 2g:取木香、角茴香，粉碎成細(xì)粉，加入到CO2超臨 界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力20MPa， 溫度30°C，CO2流量lml/g生藥·min，萃取時(shí)間170min，得超臨界萃取物，備用；萃取后的 木香、角茴香殘?jiān)c其他七味藥材，粉碎，加入2L的60%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微 波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DiaionHP-10大 孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得 微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成 200片，每片重0. 3g。
[0031] 經(jīng)檢測，成品中鹽酸小檗堿的含量為4. 88mg/片。
[0032] 實(shí)施例4 :九味獐牙菜片抑制小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞C127細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料 1.實(shí)驗(yàn)材料 1. 1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株 小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞C127細(xì)胞，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0033] 1. 2實(shí)驗(yàn)藥物 研究藥物：本發(fā)明九味獐牙菜片：按實(shí)施例1方法制備。
[0034] 藥液儲液：稱取IOOmg九味獐牙菜片，溶于5ml無水乙醇中，0. 2Mm濾器過濾， 50(^ldoff管分裝，-20°C存儲，同時(shí)0. 2Mm濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0035] 1. 3實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM(GIBCO公司Cat.No. 12100-061Lot.No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技 有限公司Lot.No. 100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat.No. 11810-033Lot. No. 1088387)Jrypsin(AMRESC0 公司）;EDTA(AMRESC0 公司）;PenicillinGSodiumSalt (AMRESC0公司I)!StreptomycinSulfate(AMRESCO);無水乙醇（溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限公 司）；MTT(Biosharp批號：0793):PBS(實(shí)驗(yàn)室自配）； 1. 4實(shí)驗(yàn)器材 萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號：DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型 號：SPECTRAMX190);C02培養(yǎng)箱（FORMA型號：3111);超凈臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號： SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號：S/N020579);精密移液器(法國吉爾森公司型 號：P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號：BT323S);全自動高壓滅菌鍋（日本SANYO 公司型號：MLS-3020);臺式電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號：DHG9123A);冰 箱（西門子公司型號：KG18V21TI);液氮罐（CBS型號：2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀 器廠型號：KA-1000) ;0.2Mm濾器（MILLIP0RE型號：SLGP033RB);lcm培養(yǎng)皿（NEST公司）、 96孔培養(yǎng)板（NEST公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0036] 2.實(shí)驗(yàn)方法 I)C127細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)（IOcm培養(yǎng)皿)，當(dāng)細(xì)胞生長 至對數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml0. 25%胰蛋白酶-0. 04%EDTA， 37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中， IOOOrpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3XIO4個/ml。
[0037] 2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液18〇μ1，培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱 中（37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
[0038] 3)根據(jù)細(xì)胞生長情況，一般長至50%_70%，加入九味獐牙菜片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0039] 4) 24h后加入 2〇μ1MTT溶液（5mg/ml，即 0· 5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0040] 5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入20〇μ1二甲基亞砜，置搖床 上低速振蕩l〇min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0041] 6)同時(shí)設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介 質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個復(fù)孔。
[0042] 7)結(jié)果以藥物對細(xì)胞的抑制率表示：細(xì)胞增值抑制率（%)=(對照孔OD值-給藥 孔OD值)、對照孔OD值X100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0043] 3.統(tǒng)計(jì)處理 采用MicrosoftExcel2007軟件中的相關(guān)分析和Studentt檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以mean土S.D.表不。
[0044] 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí)，對C127細(xì)胞 增殖抑制有差異（P〈〇. 05)，劑量在10mg/ml時(shí)該差異具有顯著性（P〈0. 01)，當(dāng)劑量達(dá)到 15_20mg/ml時(shí)有極顯著性差異（P〈0. 001)。
[0045] 表1九味獐牙菜片對C127細(xì)胞增殖抑制影響研究（X土SD)

【權(quán)利要求】
1. 一種九味獐牙菜片的制備方法，由獐牙菜53. 6g、金腰草17. 9g、榜嘎35. 7g、木香 35. 7g、兔耳草35. 7g、苦荬菜42. 9g、角茴香35. 7g、小檗皮28. 6g、波棱瓜子14. 2g作為原料 藥制成，其特征在于，所述的制備方法由下列步驟組成：取木香、角茴香，粉碎成細(xì)粉，加入 到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取 壓力 20-30MPa，溫度 30-50°C，C02 流量1-31111/^生藥，111111，萃取時(shí)間13〇-17〇111111，得超臨界 萃取物，備用；萃取后的木香、角茴香殘?jiān)c其他七味藥材，粉碎，加入2L的60%乙醇，投入 微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液， 濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹脂柱上，60%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓 回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，將超臨界萃取物、微波提取物混合加入淀粉，60%乙 醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0. 3g。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的九味獐牙菜片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取 中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的九味獐牙菜片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取 中萃取壓力為25MPa。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的九味獐牙菜片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取 中萃取溫度為60°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的九味獐牙菜片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取 中C02流量2ml/g生藥? min。
6. 據(jù)權(quán)利要求1所述的九味獐牙菜片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取中 萃取時(shí)間為150min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的九味獐牙菜片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取功率 為 7001
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的九味獐牙菜片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取每次 萃取時(shí)間為8分鐘。
9. 權(quán)利要求1所述的九味獐牙菜片在制備抑制小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞C127細(xì)胞增殖藥物 中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P35/00GK104398812SQ201410638698
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】權(quán)棟棟, 朱立平, 陳云, 李加美, 王麗麗 申請人:山東中大藥業(yè)有限公司