專利名稱：一種九味羌活片的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種九味羌活片的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
九味羌活片記載于衛(wèi)生部標準WS3-B-0876-91，由羌活150g、防風150g、蒼術(shù) 150g、細辛50g、川芎IOOg,白芷100g、黃芩100g、甘草100g、地黃IOOg作為原料藥制成，能解表除濕。用于惡寒發(fā)熱，無汗，頭痛口干，肢體酸痛。
現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有九味羌活片在提取制備方面采用超臨界和微波技術(shù)的報道， 而采用打粉和水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過大，不方便服用，嚴重影響了本品在臨床上應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種九味羌活片的制備方法。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種九味羌活片在制備抑制人巨細胞性肺癌細胞 A549細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)方案本發(fā)明的目的是通過如下的方案實現(xiàn)的
一種九味羌活片的制備方法，由羌活150g、防風150g、蒼術(shù)150g、細辛50g、川芎 100g 、白芷100g、黃芩100g、甘草100g、地黃IOOg作為原料藥制成，所述的方法由下列步驟組成取羌活、蒼術(shù)、細辛、川葦加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，C02流量l_3ml/g生藥·π η，萃取時間150-180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重O. 5g。
上述一種九味羌活片的制備方法，所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
上述一種九味羌活片的制備方法，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。
上述一種九味羌活片的制備方法，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度 40°C, CO2 流量 2ml/g 生藥· min,萃取時間 160min。
上述九味羌活片在制備抑制人巨細胞性肺癌細胞A549細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
現(xiàn)有技術(shù)中，九味羌活片每片0. 5g，每次4-5片，一日2-3次，采用本發(fā)明制備成的九味羌活片每片0. 5g，每次僅需2-3片，一日服用2次，在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過下述試驗證明。
試驗一、不同方法制備的九味羌活片中黃芩素含量的比較
1、儀器及試藥本發(fā)明九味羌活片按實施例3方法制備，使用IOOOg原料藥，經(jīng)提取制成1000片，每片重O. 5g。原九味羌活片，按部頒標準方法制備，使用IOOOg原料藥，經(jīng)提取制成1000片，每片重O. 5g。Agilent 1200高效液相色譜儀；METTLERAE240電子分析天平；黃芩素對照品(中國藥品生物制品檢定所)。
2、方法
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水-磷酸(40 60 :0. 2)為流動相；檢測波長為280nm。理論板數(shù)按黃芩素峰計算，應(yīng)不低于3000。
對照品溶液的制備精密稱取在60°C減壓干燥4小時的黃芩素對照品適量，加甲醇制成每Iml含18 μ g的溶液，即得。
供試品溶液的制備取本發(fā)明九味羌活片和原九味羌活片，研細，混勻，取lg，精密稱定，精密加入70%乙醇20ml，密塞，超聲處理10分鐘，離心，取上清液，即得。
測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μ 1，注入液相色譜儀，測定， 即得。
3、結(jié)果
結(jié)果表明，本發(fā)明九味羌活片中黃芩素的含量為1. 12mg/片；而原九味羌活片中黃芩素的含量為O. 13mg/片，在服用量減少的情況下，黃芩素含量有很大提高。
上述研究表明，采用本發(fā)明制備的九味羌活片，有效成分含量高于部頒標準法制備的九味羌活片。
具體實施方式

以下通過實施例形式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
實施例1
取羌活150g、防風150g、蒼術(shù)150g、細辛50g、川芎IOOg,白芷100g、黃芩100g、甘草100g、地黃100g，將羌活、蒼術(shù)、細辛、川芎，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，C02流量lml/g生藥·π η，萃取時間150min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇， 投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率400W，萃取2次，每次4分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇， 濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70% 乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重0. 5g。
經(jīng)檢測，成品中黃芩素的含量為1. 2Img/片。
實施例2
取羌活150g、防風150g、蒼術(shù)150g、細辛50g、川芎IOOg,白芷100g、黃芩100g、甘草100g、地黃100g，將羌活、蒼術(shù)、細辛、川芎，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，C02流量3ml/g生藥·π η，萃取時間180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇， 投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇， 濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70% 乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重O. 5g。
經(jīng)檢測，成品中黃芩素的含量為1. 14mg/片。
實施例3
取羌活150g、防風150g、蒼術(shù)150g、細辛50g、川芎IOOg,白芷100g、黃芩100g、甘草100g、地黃100g，將羌活、蒼術(shù)、細辛、川芎，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力20MPa，溫度40°C，C02流量2ml/g生藥·π η，萃取時間160min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇， 投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次6分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇， 濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70% 乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重0. 5g。
經(jīng)檢測，成品中黃芩素的含量為1. 12mg/片。
實施例4 :九味羌活片抑制A549細胞增殖的實驗研究資料
I實驗材料
1.1實驗用細胞株
人巨細胞性肺癌細胞A549細胞，南京正寬醫(yī)藥科技有限公司實驗室細胞庫， DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
1. 2實驗藥物
研究藥物本發(fā)明九味羌活片按實施例3方法制備。
藥液儲液稱取IOOmg九味憲活片，溶于5ml無水乙醇中，0. 2 μ m濾器過濾， 500 μ Idoff管分裝，-20°C存儲，同時0. 2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
1. 3實驗試劑
DMEM(GIBC0 公司 Cat. No. 12100-061 Lot. No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot. No. 100419);NaHC03(上海久億化學試劑有限公司Cat. No. 11810-033 Lot. No. 1088387)；Trypsin (AMRESC0 公司批號2010/04)；EDTA (AMRESC0 公司批號:2009/10); Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司批號2010242)；Streptomycin SulfateCAMRESCO 公司批號2010382);無水乙醇(南京化學試劑有限公司批號080310182);MTT(Biosharp批號:0793) ;PBS (實驗室自配)；
1. 4實驗器材
萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號DM1L);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD 公司型號SPECTRAMAX 190) ;C02培養(yǎng)箱(FORMA型號3111);超凈臺(蘇凈集團安泰公司制造型號SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號S/N 020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號BT323S);全自動高壓滅菌鍋(日本SANK)公司型號MLS-3020);臺式電熱鼓風干燥箱(上海精密實驗設(shè)備公司型號 DHG9123A);冰箱(西門子公司型號KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(上海安亭科學儀器廠型號ΚΑ-1000) ;0. 2μπι濾器(MILLIP0RE型號SLGP033RB) ;10cm培養(yǎng)皿(NEST公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細胞計數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
2實驗方法
I) A549細胞用DMEM+10%FBS于37 °C、5%C02進行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm培養(yǎng)皿)，當細胞生長至對數(shù)期時，收集細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml O. 25%胰蛋白酶-O. 049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，IOOOrpm離心5min，調(diào)整細胞懸液濃度3X 104個/ml。
2)將細胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液180 μ I,培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中(37 °C，5%C02 )常規(guī)培養(yǎng)。
3)根據(jù)細胞生長情況，一般長至50%_70%，加入九味羌活片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 O. 5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
6)同時設(shè)置本底(不加細胞，只加培養(yǎng)液)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個復(fù)孔。
7)結(jié)果以藥物對細胞的抑制率表示
細胞增值抑制率(％)=(對照孔OD值-給藥孔OD值)/對照孔OD值X 100%。實驗重復(fù)3次。
3統(tǒng)計處理
采用Microsoft Excel 2003軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗，數(shù)據(jù)以 mean + S. D.表不。
4實驗結(jié)果
MTT法實驗后統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組比較，當劑量達到5mg/ml時，對A549細胞增殖抑制有差異(P〈0. 05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0. 01)，當劑量達到 15-20mg/ml時有極顯著性差異(P〈0. 001)。
表I九味羌活片對A549細胞增殖抑制影響研究—[X土SD)
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注與對照組比較，*P〈0.01 ;**Ρ〈0· 001
5實驗結(jié)論
九味羌活片可以抑制Α549細胞增殖，減少Α549細胞的細胞生長數(shù)目，該作用呈劑量依賴性。
權(quán)利要求
1.一種九味羌活片的制備方法，由羌活150g、防風150g、蒼術(shù)150g、細辛50g、川芎 100g、白芷100g、黃芩100g、甘草100g、地黃IOOg作為原料藥制成，其特征在于所述的方法由下列步驟組成取羌活、蒼術(shù)、細辛、川芎，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量 l-3ml/g生藥·π η，萃取時間150_180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入 2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4_8 分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重0. 5g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種九味羌活片的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種九味羌活片的制備方法，其特征在于所述微波萃取功率 500W,每次萃取6分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種九味羌活片的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa,溫度40°C, CO2流量2ml/g生藥· min,萃取時間160min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種九味羌活片在制備抑制人巨細胞性肺癌細胞A549細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種九味羌活片的制備方法，由羌活150g、防風150g、蒼術(shù)150g、細辛50g、川芎100g、白芷100g、黃芩100g、甘草100g、地黃100g作為原料藥制成，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得黃芩素含量有很大提高，本發(fā)明還提供了九味羌活片在制備抑制人巨細胞性肺癌細胞A549細胞增殖藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61K9/20GK102988576SQ20121037842
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月8日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:卞毓平