鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料及其制備方法，所述制備方法包括以下步驟：1）提取鹿茸多肽；2）配制膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液；3）將上述膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液混勻后，加入步驟1）提取的鹿茸多肽，進行真空冷凍干燥；4）將步驟3）凍干后的混合物用戊二醛溶液進行交聯(lián)反應，反應后再次真空冷凍干燥得到厚度為0.8mm~1.2mm的、多孔的鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖復合材料。本發(fā)明采用生物活性物質(zhì)鹿茸多肽與膠原蛋白-殼聚糖復合，選擇膠原蛋白作為緩釋釋放載體，為克服膠原蛋白自身的不足，將其與殼聚糖復合形成改性膠原材料，克服了多肽類藥物不易通過生物屏障，在傷口及創(chuàng)面易被水解酶破壞等問題。
【專利說明】鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料及其制備方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料及其制備方法。

【背景技術】
[0002]骨折愈合是一個復雜的生理過程，包括細胞的遷移、血管的生成和骨痂的改建等，也包括生長因子對細胞增殖、分化的調(diào)控、骨誘導、分子信號傳導作用等多序列的修復過程。組織工程學的問世為人體組織器官缺損的再造和修復開辟了新的途徑，目前將生物活性成分加載至骨組織工程支架材料上以促進骨修復成為研究新型骨修復材料的趨勢，能使生物活性因子與納米材料穩(wěn)定充分復合，使材料具備了載藥和控釋功能，延長生物活性成分降解半衰期，提高生物利用度，又可以起到持續(xù)促進成骨的功能，獲得更好的骨修復效果O
[0003]鹿茸為我國傳統(tǒng)名貴中藥，鹿茸多肽是其中主要活性成分之一，有加速骨組織再生、周圍神經(jīng)組織再生及創(chuàng)面愈合、促進骨折愈合的作用。鹿茸多肽能夠通過促進骨、軟骨細胞增殖及促進骨痂內(nèi)膠原的積累和鈣鹽沉淀而加速骨折愈合，縮短骨折愈合時間，改善骨折部位的生物力學性能，對骨痂內(nèi)骨膠原的合成和鈣鹽沉積具有促進作用。
[0004]鹿茸在臨床上具有悠久的應用歷史，但對其蛋白及多肽的化學及理學方面的研究并不深入，沒有更好的適應工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)品，但是目前的研究主要集中在細胞水平，同時作為多肽類物質(zhì)，雖然其具有生物活性大、生理作用強的特點，但是卻具有穩(wěn)定性差，容易發(fā)生水解、氧化、變性等作用導致完全失去作用，同時體內(nèi)的半衰期短，經(jīng)脈注射后很快就被清除或者降解。因此，運用現(xiàn)代生物技術從鹿茸中分離出多肽與蛋白并在此基礎上開發(fā)出具有高活性的梅花鹿茸生物制劑，進而利用生物工程技術將其工業(yè)化生產(chǎn)具有深遠的意義。
[0005]目前還未有將鹿茸多肽用于治療骨折愈合方面的臨床報道。
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術問題是如何克服鹿茸多肽藥物不易通過生物屏障，在傷口及創(chuàng)面易被水解酶破壞，以及如何持續(xù)、穩(wěn)定、高效地控制鹿茸多肽藥物的釋放速度，延長半衰期，實現(xiàn)藥物的靶向釋放，大幅度提高藥物的生物利用度。
[0008]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料及其制備方法，所述制備方法包括以下步驟:
1)提取鹿茸多肽；
2)配制膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液；
3)將上述膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液混勻后，加入步驟I)提取的鹿茸多肽，進行真空冷凍干燥；
4)將步驟3)凍干后的混合物用戊二醛溶液進行交聯(lián)反應，反應后再次真空冷凍干燥得到厚度為0.8mnTl.2mm的、多孔的鹿茸多肽-膠原蛋白_殼聚糖復合材料。
[0009]優(yōu)選的，所述交聯(lián)反應為將步驟3)的混合物加入戊二醛溶液在4°C混合24h。
[0010]優(yōu)選的，所述鹿茸多肽的提取為采用微波提取后，加入95%乙醇4°C沉淀方法提取鹿茸多肽。
[0011]優(yōu)選的，所述戊二醛溶液的濃度為0.25%。
[0012]優(yōu)選的，所述膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液采用濃度為0.05mol/L的乙酸溶液配制，得到的膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液濃度為0.5%。
[0013]優(yōu)選的，步驟3)中膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液采用體積比為9:1的比例混合均勻。
[0014]采用上述方法即制得鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料。所述鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料用于骨折愈合治療。
[0015]本發(fā)明有益效果為:本發(fā)明采用生物活性物質(zhì)鹿茸多肽與膠原蛋白-殼聚糖復合，選擇膠原蛋白作為緩釋釋放載體，為克服膠原蛋白自身的不足，將其與殼聚糖復合形成改性膠原材料，不僅能夠克服多肽類藥物不易通過生物屏障，在傷口及創(chuàng)面易被水解酶破壞等問題，而且可以持續(xù)、穩(wěn)定、高效地控制鹿茸多肽藥物的釋放速度，延長半衰期，實現(xiàn)藥物的靶向釋放，大幅度提高藥物的生物利用度，從而達到修復骨缺損與藥物治療的雙重效果，促進鹿茸多肽在骨修復新型材料中的應用。
[0016]

【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為本發(fā)明鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的電鏡掃描示意圖。
[0017]

【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明，下面實施例僅用于說明本發(fā)明而并非對本發(fā)明的限制。
[0019](I)鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的制備
A、鹿茸多肽提取:取新鮮梅花鹿茸，切成小塊，4°C蒸餾水沖洗，粉碎，加預冷冰醋酸溶液勻漿。勻漿液用100W微波處理lOmin，離心，取上清，加入95%乙醇4°C冷沉，離心，取上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、凍干得鹿茸多肽粗提物。
[0020]B、鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的制備:用0.05mol/L乙酸配制0.5%的膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液，按9:1的比例將膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液混勻，加入鹿茸多肽至終濃度分別為0.25,0.5、1、2.0Pg/mL，傾入預冷的24孔板中，_20°C冷凍12h后凍干24h，再用0.25%戊二醛溶液進行交聯(lián)，真空冷凍干燥，密封于無菌塑料袋中，最后制成厚約Imm的多孔支架，即得到鹿茸多肽含量不同的鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料。
[0021]C、鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料超微結(jié)構的觀察:將試樣切成小塊并進行雙重固定，清洗，叔丁醇脫水，冷凍干燥脫水和噴金導電處理后，制成切片，電鏡下觀察支架材料表面及內(nèi)部的超微結(jié)構，如圖1所示，鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料表面光滑，孔徑小且分布均勻，是生物材料理想的微觀結(jié)構形式。
[0022](2)鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料對骨折愈合的促進作用
MTT法檢測細胞增殖實驗:取對數(shù)生長期的成骨細胞，計數(shù)細胞濃度為5 X 104個/mL，于96孔板每孔加入200 μ L，使細胞生長同步化，實驗分2組，培養(yǎng)液對照組，含鹿茸多肽復合材料培養(yǎng)液組。分別于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)l、2、3、4、5d，每孔加入20 μ? ΜΤΤ，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清液，每孔加入150 μ L DMS0，振蕩lOmin，應用酶標儀于波長570nm處測吸光度值，選擇促增殖效果最佳的材料進行后續(xù)實驗。結(jié)果表明，在培養(yǎng)Id內(nèi)，各組HFOB細胞生長無明顯差異。培養(yǎng)第2d，含鹿茸多肽的復合材料組明顯促進細胞增殖，優(yōu)于其余兩組。繼續(xù)培養(yǎng)較長時間(3、4、5d)，交聯(lián)復合材料組對細胞的增殖逐漸增強，顯著優(yōu)于和對照組，且隨著鹿茸多肽濃度(0.25、0.5、1和2 Pg/mL)的升高呈劑量依賴性。結(jié)果顯示，交聯(lián)法制備的材料可在較長時間內(nèi)持續(xù)促進人成骨細胞的增殖。
[0023]堿性磷酸酶活性測定:取對數(shù)生長期的成骨細胞，計數(shù)細胞，以IX 104個/孔加入6孔板，培養(yǎng)12h，各孔加入不同濃度鹿茸多肽交聯(lián)材料的培養(yǎng)液，同時設培養(yǎng)液對照組，每組均設5復孔。培養(yǎng)7d后收集細胞，超聲破碎細胞取上清液用全自動生化分析儀測定ALP活性。結(jié)果表明，含鹿茸多肽的各組復合材料均能使HFOB細胞ALP活性明顯增高(P〈0.05)，且隨著鹿茸多肽濃度的增加ALP活性隨之增加。
[0024]鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖對兔骨折愈合的影響:取健康新西蘭白兔45只，麻醉動物，將兔仰臥固定在支架上，頭偏右側(cè)，脫毛，常規(guī)消毒鋪巾，暴露下領骨。沖洗降溫條件下，在下領骨中后1/3交界處用金剛砂片垂直于下領骨下緣在下領骨外側(cè)面和下緣做線形溝槽，深度為骨皮質(zhì)全，再用骨鑿深入溝槽內(nèi)將之撬斷，造成線形骨折。在骨折線兩側(cè)、距骨折線的對稱位置各鉆2個孔，鋼絲交叉結(jié)扎固定兩骨折斷端。充分止血后，放置鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋釋放材料(實驗組)、膠原蛋白-殼聚糖緩釋釋放材料(對照組)、對照組(4組)不放置任何試劑和載體，關閉傷口。
[0025]Micro-CT檢查:分別于術后4、8、12周時，將實驗各組下頜骨缺損處組織標本進行Micro-CT掃描，觀察組織缺損部位及其周圍骨質(zhì)的部分重建，根據(jù)形態(tài)學的變化進行定性分析。
[0026]組織學檢測:骨缺損部位取材，HE染色，于光學顯微鏡下觀察植入物與周圍骨組織的結(jié)合、新生骨基質(zhì)的生成、血管和纖維組織、材料的降解等情況。
[0027]結(jié)果:術后4周，鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋組的材料周圍組織可見明顯放射顯影，呈骨小梁形態(tài)；膠原蛋白-殼聚糖緩釋組可見部分骨小梁生成，但數(shù)量較少；空白對照組未見骨小梁生成。術后8周，鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋組的成骨量明顯增多，空白對照組僅在缺損邊緣處偶見骨小梁出現(xiàn)。
[0028]術后4周各組骨缺損處的病理學改變:鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋組中骨缺損部位由纖維骨痂填充，材料部分降解，周圍有新骨生成，成骨細胞聚集在骨基質(zhì)周圍，可見少量編織骨成分和血管組織，骨缺損周邊處可見新生骨小梁從邊緣向中央網(wǎng)孔內(nèi)生長；膠原蛋白-殼聚糖緩釋組中骨缺損大部分被纖維組織填充，在骨缺損邊緣部位有新骨形成。空白對照組骨缺損處主要為纖維組織填充，可見大量成纖維細胞。
[0029]術后8周各組骨缺損處的病理學改變:鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋組中的骨缺損部位骨小梁明顯增多，材料降解吸收明顯，可見較為成熟的新生骨組織與編織骨共存，小血管增生明顯，缺損區(qū)內(nèi)出現(xiàn)骨髓組織；膠原蛋白-殼聚糖緩釋組中，骨缺損中心大部分為纖維組織填充，材料進一步降解，但骨缺損周邊部位的新骨較4周時有所增加空白對照組的骨缺損仍為大量纖維組織填充，與術后4周時相比變化不明顯。
[0030]術后12周各組骨缺損處的病理學改變:鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋組中骨缺損部位新生骨小梁改建成為更致密的板層骨，大量成骨細胞位于骨陷窩中，可見哈佛管系統(tǒng)，髓腔再通，在缺損周邊可見板層骨與原骨組織緊密結(jié)合；膠原蛋白-殼聚糖緩釋組中的骨缺損處，可見成熟的成骨細胞，為編織骨修復，無板層骨和骨髓腔形成，缺損中心仍為纖維組織填充，材料基本降解，僅見少量殘留；空白對照組在缺損周邊部位可見骨島生成，數(shù)量極少，材料少量殘留，中心部位仍由纖維組織填充。
[0031]在以上的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是以上描述僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，因此本發(fā)明不受上面公開的具體實施的限制。同時任何熟悉本領域技術人員在不脫離本發(fā)明技術方案范圍情況下，都可利用上述揭示的方法和技術內(nèi)容對本發(fā)明技術方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明技術方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術方案保護的范圍內(nèi)。
【權利要求】
1.一種鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: 1)提取鹿茸多肽； 2)配制膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液； 3)將上述膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液混勻后，加入步驟I)提取的鹿茸多肽，進行真空冷凍干燥； 4)將步驟3)凍干后的混合物用戊二醛溶液進行交聯(lián)反應，反應后再次真空冷凍干燥得到厚度為0.8mnTl.2mm的、多孔的鹿茸多肽-膠原蛋白_殼聚糖復合材料。
2.根據(jù)權利要求1所述鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的制備方法，其特征在于，所述交聯(lián)反應為將步驟3)的混合物加入戊二醛溶液在4°C混合24h。
3.根據(jù)權利要求1所述鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的制備方法，其特征在于，所述鹿茸多肽的提取為采用微波提取后，加入95%乙醇4°C沉淀方法提取鹿茸多肽。
4.根據(jù)權利要求2所述鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的制備方法，其特征在于，所述戊二醛溶液的濃度為0.25%。
5.根據(jù)權利要求1所述鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的制備方法，其特征在于，所述膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液采用濃度為0.05mol/L的乙酸溶液配制，得到的膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液濃度為0.5%。
6.根據(jù)權利要求1所述鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的制備方法，其特征在于，步驟3)中膠原蛋白溶液和殼聚糖溶液采用體積比為9:1的比例混合均勻。
7.一種鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料，其特征在于，所述緩釋材料為采用如權利要求f 6任一項所述方法制得。
8.根據(jù)權利要求7所述鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料的應用，其特征在于，所述鹿茸多肽-膠原蛋白-殼聚糖緩釋材料用于骨折愈合治療。
【文檔編號】A61L27/54GK104436311SQ201410638713
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權日:2014年11月13日
【發(fā)明者】呂士杰, 朱文赫, 徐俊杰, 沈楠, 李亞巍, 鐘秀宏, 楊丹 申請人:吉林醫(yī)藥學院