豬偽狂犬病病毒疫苗組合物及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種豬偽狂犬病病毒疫苗組合物，該豬偽狂犬病病毒疫苗組合物含豬偽狂犬病病毒亞單位抗原，或含有重組新城疫病毒-豬偽狂犬病病毒載體。本發(fā)明還提供了該疫苗組合物的制備方法和應用。該疫苗組合物能有效預防豬偽狂犬病病毒相關疾病和由豬偽狂犬病病毒造成的感染的相關疾病。本發(fā)明豬偽狂犬病毒疫苗組合物中免疫原性抗原的組合可誘導產(chǎn)生協(xié)同的免疫效果，不僅免疫效果良好，還進一步降低了免疫使用量，降低了免疫成本。
【專利說明】豬偽狂犬病病毒疫苗組合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品領域，具體地涉及豬偽狂犬病毒的疫苗組合物及其制備 方法，以及將所述免疫抗原用于制備預防和/或治療與豬偽狂犬病毒相關疾病和由豬偽狂 犬病毒導致的感染的組合物的應用。
【背景技術】
[0002] 偽狂犬病，又稱Aujeszky氏病，是由皰疹病毒科（Herpesviridae) α亞科中的豬 皰疫病毒I型（Suid herpesvirus lstrain)所引起的豬、牛、羊等多種家畜、家禽和野生動 物的一種以發(fā)熱、奇癢（除豬外）及腦脊髓炎為主癥的急性傳染病。豬的偽狂犬病在我國 廣泛存在，危害嚴重，是制約規(guī)?；i場生產(chǎn)的主要疫病之一。它能引起妊娠母豬流產(chǎn)、死 胎或木乃伊胎和仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻痹，死亡率高。PRV具有較強的泛嗜性、神經(jīng)嗜性及潛 伏感染特性，在外周神經(jīng)系統(tǒng)可以長期潛伏感染，當潛伏病毒被激活變成有感染力的病毒， 被潛伏感染的宿主就會發(fā)病。
[0003] 豬PRV只有一個血清型，通常認為毒株的交叉保護力很強，但目前仍存在仔豬注 射商品化疫苗后發(fā)生典型豬偽狂犬病，例如長時間體溫升高，精神沉郁，食欲減退，出現(xiàn)呼 吸道和/或神經(jīng)癥狀。突出表現(xiàn)為任何年齡的豬都會感染，可在豬群水平傳播，潛伏期短 (1?2天），發(fā)病率在10%?100%之間，發(fā)病豬死亡率在10%?100%之間（仔豬死亡率 可高達100% )，感染后可引起豬只高熱（40?42°C，持續(xù)3日以上），呼吸困難，腹瀉，喘， 咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，側臥不起，角弓反張，泳狀劃水，最后衰竭而 死，并可引起種公豬精液質量下降，懷孕母豬流產(chǎn)（高達35% )，早產(chǎn)，死胎，弱仔（弱仔14 日齡前全部死亡）等繁殖障礙癥狀?，F(xiàn)有技術的疫苗免疫豬只后不能完全抵抗野毒攻擊， 依然會出現(xiàn)高熱，精神沉郁，食欲下降或廢絕等癥狀，感染率超過80 %，發(fā)病率超過30 %， 死亡率在10%?20%之間?，F(xiàn)有技術還沒有疫苗能夠解決針對豬偽狂犬變異株引起的偽 狂犬病。
[0004] 本發(fā)明首次通過將豬偽狂犬病毒gB蛋白與gD蛋白組合使用，針對豬偽狂犬變異 株引起的偽狂犬病有著較好的保護作用，，通過免疫效力比較試驗，意外發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白組 合使用，協(xié)同刺激機體免疫反應，有效降低了免疫劑量，大大降低了免疫成本。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術缺陷，提供一種預防和/或治療豬偽狂犬病毒感 染的疫苗組合物，該疫苗組合物包含兩種豬偽狂犬病毒免疫保護性抗原和佐劑。本發(fā)明提 供的預防和/或治療豬偽狂犬病毒感染的疫苗組合物包含的兩種豬偽狂犬病毒免疫抗原 為gB蛋白與gD蛋白。
[0006] 本發(fā)明的第一方面是一種豬偽狂犬病病毒疫苗組合物，所述的疫苗組合物包括免 疫量的gB蛋白、gD蛋白和佐劑。
[0007] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的疫苗組合物中，所述的gB蛋白蛋白 序列為SEQ ID NO. 3 ;所述的gD蛋白蛋白序列為SEQ ID NO. 4。
[0008] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預防和/或治療豬偽狂犬病毒感染的疫苗組合物包含的豬 偽狂犬病毒免疫抗原gB蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0 :3所示。
[0009] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預防和/或治療豬偽狂犬病毒感染的疫苗組合物包含的豬 偽狂犬病毒免疫抗原gB蛋白核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0010] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預防和/或治療豬偽狂犬病毒感染的疫苗組合物包含的豬 偽狂犬病毒免疫抗原gD蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0 :4所示。
[0011] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預防和/或治療豬偽狂犬病毒感染的疫苗組合物包含的豬 偽狂犬病毒免疫抗原gD蛋白核苷酸序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0012] 術語"gB蛋白"又稱"gB糖蛋白"，
[0013] 術語"gD蛋白"又稱"gD糖蛋白"，是豬偽狂犬病病毒進行感染必需的結構蛋白，是 成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也稱為"gp50蛋白"。
[0014] 本發(fā)明提供的預防和/或治療豬偽狂犬病毒感染的疫苗組合物包含的豬偽狂犬 病毒免疫抗原gB蛋白、gD蛋白還可以是與其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽。
[0015] 術語"佐劑"指加入到本發(fā)明的組合物中以增加組合物的免疫原性的物質。已知 的佐劑包括，但不限于：油佐劑，水溶性佐劑，鋁鹽佐劑，細胞因子佐劑。
[0016] 本發(fā)明所用術語"油佐劑"又稱"油性佐劑"或"油乳佐劑"，是由包括植物油、動 物油、礦物油中的一種或幾種組成，用于延緩免疫原在機體內(nèi)的存留時間，使之持續(xù)緩慢釋 放，增強巨噬細胞的吞噬與殺菌能力。
[0017] 本發(fā)明所用術語"水溶性佐劑"又稱"水基佐劑"或"水佐劑"，是一種聚合物水溶 性分散體，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，可以由高分子量聚丙烯酸類合成聚合物 組成。
[0018] 本發(fā)明所用術語"鋁鹽佐劑"，又稱"鋁膠佐劑"或"鋁佐劑"，包括氫氧化鋁佐劑和 磷酸鋁佐劑，其主要功能為緩釋，但同時具有對免疫細胞的激活作用。將抗原和氫氧化鋁或 磷酸鋁混合注射，能夠使抗原保存在注射部位，具有抗原緩釋和非特異免疫刺激作用。
[0019] 本發(fā)明所用術語"細胞因子佐劑"，包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、INF- γ、GM-CSF、TNF- a、TNF- β、TCA-3 等，又稱"細胞因子" 或"細胞素"，是活體宿主細胞分泌的通過擴散、細胞間接觸或血液循環(huán)到達宿主其他細胞， 在體液中以極低濃度發(fā)揮作用的一類非免疫球蛋白、局部天然蛋白或糖蛋白，也是一類由 機體活化的免疫細胞和某些非免疫細胞產(chǎn)生、分泌，能調節(jié)細胞生長、分化，與造血、炎癥反 應、免疫應答反應和創(chuàng)傷愈合等密切相關的高活性多功能小分子蛋白的統(tǒng)稱，可以刺激或 抑制免疫功能，在免疫應答中促進細胞發(fā)育分化、調節(jié)細胞生理功能和細胞間信息傳遞，在 免疫系統(tǒng)中起著非常重要的調控作用。
[0020] 本發(fā)明實施例中使用了油佐劑中的一種206佐劑。
[0021] 適用于本發(fā)明的組合物的佐劑的量優(yōu)選地是有效量。所述"有效量"是指佐劑在 同本發(fā)明抗原聯(lián)合施用時在宿主中發(fā)揮它們的免疫學作用而言必須或足夠的而不導致過 度副作用所必需量。待施用的佐劑的精確的量將根據(jù)因素如所用的成分和治療的疾病的類 型，待治療的動物的類型和年齡，施用的方式，以及組合物中的其它成分而變化。
[0022] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種治療和/或預防豬偽狂犬病毒感染的疫苗組 合物，由豬偽狂犬病毒免疫抗原gB蛋白、gD蛋白和206佐劑組成。
[0023] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的疫苗組合物中，所述的gB蛋白含量 為 25-100μ g/ml ;gD 蛋白含量為 25-100μ g/ml。
[0024] 作為本發(fā)明的一種最優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的疫苗組合物中，所述的gB蛋白含 量為50 μ g/ml ; gD蛋白含量為50 μ g/ml。
[0025] 本發(fā)明的組合物的成分或組分的量優(yōu)選地是治療有效量。所述治療有效量是指在 組合物施用的宿主中發(fā)揮它們的免疫學作用而不導致過度副作用所必需量。所用的成分 和待施用的組合物的精確的量將根據(jù)因素如治療的疾病的類型，待治療的動物的類型和年 齡，施用的方式，以及組合物中的其它成分而變化。
[0026] 優(yōu)選地，對于動物豬而言，本發(fā)明疫苗組合物gB蛋白抗原有效量為25-100 μ g/ ml ;gD蛋白抗原有效量為25-100 μ g/ml。
[0027] 更優(yōu)選地，所述疫苗組合物gB蛋白抗原有效量為50 μ g/ml ;gD蛋白抗原有效量為 50 μ g/ml〇
[0028] 本發(fā)明的另一方面是一種豬偽狂犬病病毒疫苗組合物，所述的疫苗組合物包括重 組新城疫病毒-豬偽狂犬病病毒載體以及佐劑。
[0029] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的疫苗組合物中，所述的重組新城疫 病毒-豬偽狂犬病病毒載體包含一種或多種異源多核苷酸，其編碼一種或多種豬偽狂犬病 病毒抗原、多肽或其變體，其中，所述的豬偽狂犬病病毒抗原包括gB蛋白、gD蛋白。
[0030] 術語"功能衍生物"指具有與完整蛋白/肽序列的生物活性基本類似的功能生物 活性的蛋白/肽序列。換言之，其優(yōu)選地指當將所述功能衍生物施用于動物時，基本上保留 了激發(fā)免疫應答，如針對豬偽狂犬病毒株攻擊的保護性反應的能力的多肽或其片段。
[0031] 術語"片段"指這樣的多核苷酸序列，其是人工構建（例如通過化學合成）或通過 將天然產(chǎn)物裂解成多個小片段（使用限制性內(nèi)切酶，或機械剪切）構建的本發(fā)明核酸的分 離的部分，或通過PCR、DNA聚合酶或本領域公知的任何其他聚合技術合成的核酸的部分， 或通過本領域技術人員公知的重組核酸技術在宿主細胞中表達的核酸部分。
[0032] 如本文一般理解和使用，"功能性片段"指編碼與完整核酸序列的生物活性基本相 似的功能生物活性的核酸序列。換言之，在本發(fā)明的上下文中，其優(yōu)選地指基本上保留了編 碼這樣的多肽/蛋白質能力的核酸或其片段，所述多肽/蛋白質當施用于動物時，激發(fā)針對 豬偽狂犬病毒攻擊的免疫應答，和更優(yōu)選地保護性反應。
[0033] 當指氨基酸序列時，"基本上相同"可以理解為本發(fā)明的多肽優(yōu)選地具有這樣的氨 基酸序列，其與SEQ ID NO :3-4中所示的序列的部分或全部具有至少70%同源性，或甚至 優(yōu)選地80%同源性，或甚至更優(yōu)選地90%同源性，或最優(yōu)選地95%同源性。
[0034] 在本文中術語"同源性"還包括與參比序列相同或類似，同時提供任何氨基酸的簡 單替換/修飾?？梢杂肂LAST-P (基本局部排比檢索工具），本領域技術人員公知的程序進 行該方面的同源性檢索。對于相應的核酸序列，同源性涉及在本領域中已知的BLASTX和 BLASTN 程序。
[0035] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的疫苗組合物中，所述的豬偽狂犬病 病毒抗原gB蛋白為序列SEQ ID N0. 3編碼的豬偽狂犬病病毒gB蛋白，述的豬偽狂犬病病 毒抗原gD蛋白為序列SEQ ID N0. 4編碼的gD蛋白。
[0036] 所述"載體"意指重組DNA或RNA質粒、噬菌體或病毒，其包含要在體內(nèi)或體外遞 送至靶細胞的異源多核苷酸。異源多核苷酸可包含目的序列以用于預防或治療的目的，可 選地，其為表達盒的形式。載體不需要能夠在最終的靶細胞或受試者中復制。術語"載體" 包括用于克隆載體，也包括病毒載體。
[0037] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的疫苗組合物中所述的疫苗組合物， 其特征在于，所述的新城疫病毒為弱毒株，優(yōu)選地，所新城疫病毒為新城疫病毒La Sota株。
[0038] 新城疫病毒La Sota株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0039] 本發(fā)明的另一方面是一種制備所述疫苗組合物的方法，所述的方法包括：1)制備 gB蛋白和gD蛋白抗原的步驟；以及2)按比例混合抗原，加入佐劑，乳化的步驟。
[0040] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種治療和/或預防豬偽狂犬病毒相關疾病或感染 的疫苗組合物的制備方法，包括：
[0041] (1)制備gB蛋白和gD蛋白抗原；
[0042] (2)按比例混合抗原，加入佐劑，乳化。
[0043] 抗原的制備可以通過本領域技術人員已知的多種方法進行，包括基因工程手段， 例如通過包含本發(fā)明多核苷酸的克隆或表達載體。術語"載體"涉及被設計用于轉導/轉 染一種或多種細胞類型的多核苷酸構建體。載體可以是，例如"克隆載體"，其被設計用于分 離、增殖和復制插入的核苷酸；"表達載體"，其被設計用于在宿主細胞中表達核苷酸序列； 或"病毒載體"，其被設計用于生產(chǎn)重組病毒或病毒樣顆粒；或"穿梭載體"，其包含不只一 種類型的載體的性質。適合制備本發(fā)明豬偽狂犬病毒抗原的公眾可獲得的載體包括質粒、 腺病毒、桿狀病毒、酵母桿狀病毒、植物病毒、腺伴隨病毒、反轉錄病毒、單純皰疹病毒、α病 毒、慢病毒等，還可以獲得構建這樣的載體的方法。本發(fā)明豬偽狂犬病毒抗原的制備還包括 通過人工合成的方式來實現(xiàn)。
[0044] 本發(fā)明的另一方面是一種制備所述疫苗組合物的方法，其特征在于，所述的方法 包括：1)重組所述新城疫病毒基因組全長cDNA載體的步驟；2)重組表達所述新城疫病毒 NP、P、L基因表達載體的步驟；3)重組表達所述豬偽狂犬病病毒抗原基因到所述新城疫病 毒基因組全長cDNA重組載體的步驟；以及4)將所述表達所述豬偽狂犬病病毒抗原的新城 疫病毒基因組全長cDNA重組載體和表達所述新城疫病毒NP、P、L基因重組載體共同轉染細 胞，進行病毒振救的步驟。
[0045] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明的疫苗組合物制備方法中，轉染細胞 為BHK細胞。也可選用本領域公知的培育新城疫病毒的其他細胞系細胞。
[0046] 本發(fā)明的另一方面是所述的疫苗組合物在制備預防和/或治療豬偽狂犬病病毒 相關疾病或由豬偽狂犬病病毒導致的感染的藥物中的應用。
[0047] 本發(fā)明的另一個目的在于提供包含豬偽狂犬病毒免疫抗原gB蛋白、gD蛋白或其 功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽在用于預防和/或治療豬偽狂犬病毒相關疾病 或感染的組合物和/或方法中的應用。
[0048] 術語"預防"指通過給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物抑制豬偽狂犬感染或推遲疾病 發(fā)作的所有行為。術語"治療"指通過給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物使豬偽狂犬病病毒感 染引起的癥狀減輕或轉好的所有行為。
[0049] 術語"保護性反應"意為在動物中預防豬偽狂犬病毒相關疾病或由豬偽狂犬病毒 導致的感染的發(fā)作或減輕存在的這樣的疾病的嚴重性。
[0050] 本發(fā)明涉及的豬偽狂犬病毒多肽，其有利地激發(fā)動物中的保護性反應。具體地，本 發(fā)明涉及的多肽包含與其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
[0051] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種疫苗組合物在制備治療和/或預防豬偽狂犬病 毒相關疾病或感染的藥物的應用。
[0052] 本文所用的術語"豬偽狂犬病病毒相關疾病"用于指由豬偽狂犬病毒感染引起的 疾病。它的例子包括發(fā)病仔豬表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)癥狀、昏睡、嗚叫、嘔吐、拉稀、體溫升高，一 旦發(fā)病，懷孕母豬可發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎兒或死胎或繁殖障礙，但不限于此。
[0053] 本文所用的術語"豬偽狂犬病病毒相關疾病"可以進一步用于指表現(xiàn)為任何年齡 的豬都會感染，可在豬群水平傳播，潛伏期短（1?2天），發(fā)病率在10 %?100 %之間，發(fā)病 豬死亡率在10%?100%之間（仔豬死亡率可商達100% )，感染后可引起豬只商熱（40? 42°C，持續(xù)3日以上），呼吸困難，腹瀉，喘，咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐， 側臥不起，角弓反張，泳狀劃水，最后衰竭而死，并可引起種公豬精液質量下降，懷孕母豬流 產(chǎn)（高達35%)，早產(chǎn)，死胎，弱仔（弱仔14日齡前全部死亡）等繁殖障礙癥狀，但不限于 此。上述癥狀與現(xiàn)有技術中感染了普通豬偽狂犬病病毒后產(chǎn)生的癥狀差異在于：感染了后 會造成感染后成年豬（體重在50kg以上豬）可引起豬只高熱（40?42°C，持續(xù)3日以上）， 呼吸困難，腹瀉，喘，咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，側臥不起，角弓反張，泳 狀劃水，最后衰竭而死；新生及4周齡以內(nèi)的仔豬突然發(fā)病，發(fā)生大批死亡，死亡率達90 % 以上；發(fā)病仔豬主要表現(xiàn)為體溫上升達41°C以上，食欲廢絕，伴有明顯的神經(jīng)癥狀和腹瀉； 斷奶前后仔豬主要為呼吸系統(tǒng)癥狀，表現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、流鼻涕等。
[0054] 本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點：
[0055] (1)本發(fā)明疫苗組合物可通過基因工程手段或人工合成手段對疫苗組合物的組分 進行大量合成表達，不僅耗時短，還可便于大規(guī)模生產(chǎn)；
[0056] (2)本發(fā)明豬偽狂犬病毒疫苗組合物中多免疫原性抗原的組合可誘導產(chǎn)生協(xié)同的 免疫效果，不僅免疫效果良好，還進一步降低了免疫使用量，降低了免疫成本；
[0057] (3)本發(fā)明疫苗組合物可有效保護豬只抵抗豬偽狂犬病毒的感染，提供了一種完 善預防和/或治療豬偽狂犬病毒感染的途徑，避免了傳統(tǒng)活疫苗毒力返強及散毒風險的發(fā) 生，對于凈化豬偽狂犬病毒有著積極的現(xiàn)實意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0058] 圖1為gB基因 PCR擴增產(chǎn)物電泳結果，從左至右各泳道分別為：Marker DL5000、 gB基因 PCR擴增產(chǎn)物、抽提陰性對照PCR擴增產(chǎn)物、PCR陰性對照；
[0059] 圖2為gD基因 PCR擴增產(chǎn)物電泳結果，從左至右各泳道分別為：Marker DL5000、 抽提陰性對照PCR擴增產(chǎn)物；3 :PCR陰性對照；4 :gD基因 PCR擴增產(chǎn)物；
[0060] 圖3為pFastBac/HBM-TOPO-gB酶切鑒定結果，從左至右各泳道分別為：Marker DL5000 ;2-5 泳道：pFastBac/HBM-TOPO-gB Mlu I 和 Hind III酶切鑒定結果；
[0061] 圖4為pFastBac/HBM-TOPO-gD酶切鑒定結果，從左至右各泳道分別為：Marker DL5000 ;2-4 泳道：pFastBac/HBM-TOPO-gD Mlu I 和 Hind III酶切鑒定結果；
[0062] 圖5為Bacmid-gB和Bacmid-gD PCR鑒定結果，從左至右各泳道分別為：Marker DL5000、Bacmid-gB PCR 鑒定、Bacmid-gD PCR 鑒定、Bacmid PCR 陰性對照；
[0063] 圖 6 為 vNDV-PRV-gB-gD 構建示意圖。
[0064] 序列表中：
[0065] 序列1為PRV HN1201株gB蛋白的核苷酸序列；
[0066] 序列2為PRV HN1201株gD蛋白的核苷酸序列；
[0067] 序列3為PRV HN1201株gB蛋白的氨基酸序列；
[0068] 序列4為PRV HN1201株gD蛋白的氨基酸序列。
【具體實施方式】
[0069] 下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人 員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0070] 實施例1豬偽狂犬病毒gB、gD蛋白的制備
[0071] 1.豬偽狂犬病毒gB、gD基因的擴增
[0072] 在生長良好的PK15細胞上接種PRV HN1201病毒或其不同代次的培養(yǎng)物，該不同 代次的培養(yǎng)物為5-35代以內(nèi)的培養(yǎng)物，收獲病毒后用TAKARA公司MiniBEST Viral RNA/ DNA Extraction Kit Ver. 3· 0試劑盒提取PRV基因組DNA。取1 μ 1基因組DNA作為模板， 分別利用gB、gD特異性引物：
[0073] gBSF:5， CTAGGGGGCGTCGGGGTCCTCGT 3' 和
[0074] gBSR:5; ATGCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGG3;
[0075] gDSFj' ATGCTGCTCGCAGCGCTATTGGC 3，和
[0076] gDSR:5，CTACGGACCGGGCTGCGCTTTTAG3，
[0077] 進行PCR擴增，利用 TAKARA 的高保真酶PrimeSTAR?HS DNA Polymerase with 6〇81^€61^8擴增條件為：941：3111丨11;981：108,681：3111丨11，30。7(3168 ;681：5111丨11，？〇?產(chǎn)物 命名為 gB。gD 擴增條件為：94°C 3min ;98°C 10s，68°C lmin，30cycles ;68°C 5min。PCR 產(chǎn) 物命名為gD。
[0078] 2.重組Bacmid的獲取及鑒定
[0079] 將高保真酶擴增獲得的PCR產(chǎn)物gB和gD分別克隆至pFastBac/HBM-TOPO 載體（購自Invitrogen公司，貨號A11339)，克隆體系如下：PCR產(chǎn)物gB 4μ1，Salt 8〇1111:;[011(鹽溶液）1以1，1'0?0￥6。1:01'1以1，共6以1。混合均勻，室溫孵育51]1；[11，轉化0116 ShotR Machl?TlR感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素抗性平板，分別挑取單克隆鑒定gB、gD基因 的插入方向，插入方向正確的質粒送Invitrogen公司測序，鑒定gB、gD序列的正確性。測 序正確的質粒分別命名為 pFastBac/HBM-T0P0-gB，pFastBac/HBM-T0P0-gD。
[0080] 分別將 pFastBac/HBM-T0P0-gB、pFastBac/HBM-T0P0-gD 質粒轉化 DHlOBac 感受 態(tài)細胞，pFastBac/HBM-T0P0-gB、pFastBac/HBM-T0P0-gD分別和感受態(tài)細胞中的穿梭質粒 Bacmid進行轉座，用 Invitrogen 的PureLink HiPure Plasmid DNA Miniprep Kit提取獲得 的重組質粒，并用pUCM13Forward/pUCM13Reverse引物分別鑒定gB、gD的插入，陽性Bacmid 分別命名為 Bacmid-gB、Bacmid-gD。
[0081] 3.轉染獲得重組桿狀病毒
[0082] 按照 Invitrogen 公司 Bac-to-Bac ΗΒΜ Τ0Ρ0 Secreted Expression System 的說 明書提供的方法進行。6孔板每孔鋪8X105個sf9細胞，待細胞貼壁后按照Cellfectinll轉 染試劑的說明書進行轉染：分別稀釋8以1〇611^〇1:;[1111和]^8 1^〇111(1-813 0嫩到10〇4 1 SF-900 II培養(yǎng)基中，Vortex混勻，混合稀釋后的DNA與稀釋后的Cellfectin II (總體積? 210 μ 1)，混合均勻室溫孵育15?30min，一滴滴加到細胞中。轉染后72h待出現(xiàn)細胞病變 后，收集細胞培養(yǎng)上清，記為P0代重組病毒vBac-gB。P0代重組病毒vBac-gB感染sf9細 胞，經(jīng)3代擴大培養(yǎng)后，獲得的P3代vBac-gB用于重組蛋白表達。
[0083] 同樣按上述轉染方法，將Bacmid-gD DNA進行轉染，收獲的重組病毒記為P0代 vBac-gD。P0代重組病毒vBac-gD感染sf9細胞，經(jīng)3代擴大培養(yǎng)后，獲得的P3代vBac-gD 用于重組蛋白表達。
[0084] 4.重組桿狀病毒感染High-five細胞獲得重組蛋白
[0085] 分別將P3代重組桿狀病毒vBac-gB、vBac-gD接種High-five細胞（購自 Invitrogen，貨號B85502)。在500ml三角瓶中懸浮培養(yǎng)High-five細胞，至細胞密度達 到7. OX 105cell/ml后，按照1M0I的量接種病毒，感染后72h收取細胞培養(yǎng)上清。利用 Millipore的切向流過濾系統(tǒng)將體積濃縮為原來體積的1/10。用1% (體積比）的Triton X-100(購自sigma，貨號T8787)滅活桿狀病毒，SDS-PAGE光密度法測定蛋白含量為 200 μ g/ml。
[0086] 實施2豬偽狂犬病毒疫苗組合物的制備
[0087] 取實施例1制備的gB和gD蛋白，緩緩加入到佐劑中，加的過程中不斷用轉速為 800rpm乳化機攪拌12min，混勻，4°C保存，即為豬偽狂犬病毒的疫苗組合物。具體配比見表 1〇
[0088] 表1豬偽狂犬病毒疫苗組合物成分配比 [0089]
【權利要求】
1. 一種豬偽狂犬病病毒疫苗組合物，其特征在于，所述的疫苗組合物包括免疫量的gB 蛋白、gD蛋白和佐劑。
2. 根據(jù)權利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的gB蛋白蛋白序列為SEQ ID NO. 3 ;所述的gD蛋白蛋白序列為SEQ ID NO. 4。
3. 根據(jù)權利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的gB蛋白含量為25-100 μ g/ ml ;gD 蛋白含量為 25-100μ8/πι1。
4. 一種豬偽狂犬病病毒疫苗組合物，其特征在于，所述的疫苗組合物包括重組新城疫 病毒-豬偽狂犬病病毒載體以及佐劑。
5. 根據(jù)權利要求4所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的重組新城疫病毒-豬偽狂犬 病病毒載體包含一種或多種異源多核苷酸，其編碼一種或多種豬偽狂犬病病毒抗原、多肽 或其變體，其中，所述的豬偽狂犬病病毒抗原包括gB蛋白、gD蛋白。
6. 根據(jù)權利要求5所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的豬偽狂犬病病毒抗原gB蛋 白為序列SEQ ID NO. 3編碼的豬偽狂犬病病毒gB蛋白，述的豬偽狂犬病病毒抗原gD蛋白 為序列SEQ ID NO. 4編碼的gD蛋白。
7. 根據(jù)權利要求4所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的新城疫病毒為弱毒株，優(yōu)選 地，所新城疫病毒為新城疫病毒La Sota株。
8. -種制備權利要求1-3任一項所述疫苗組合物的方法，其特征在于，所述的方法包 括： 1) 制備gB蛋白和gD蛋白抗原的步驟；以及 2) 按比例混合抗原，加入佐劑，乳化的步驟。
9. 一種制備權利要求4-7任一項所述疫苗組合物的方法，其特征在于，所述的方法包 括： 1) 重組所述新城疫病毒基因組全長cDNA載體的步驟； 2) 重組表達所述新城疫病毒NP、P、L基因表達載體的步驟； 3) 重組表達所述豬偽狂犬病病毒抗原基因到所述新城疫病毒基因組全長cDNA重組載 體的步驟；以及 4) 將所述表達所述豬偽狂犬病病毒抗原的新城疫病毒基因組全長cDNA重組載體和表 達所述新城疫病毒NP、P、L基因重組載體共同轉染細胞，進行病毒振救的步驟。
10. 根據(jù)權利要求1-7任一項所述的疫苗組合物在制備預防和/或治療豬偽狂犬病病 毒相關疾病或由豬偽狂犬病病毒導致的感染的藥物中的應用。
【文檔編號】A61K39/245GK104248757SQ201410519314
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權日:2014年9月30日
【發(fā)明者】田克恭, 孫進忠, 張超林, 張許科 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司