專利名稱：：一種豬偽狂犬病新型亞單位疫苗制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種豬偽狂犬病新型亞單位疫苗制備方法。技術(shù)背景偽狂犬病是多種動(dòng)物共患性傳染病，豬是其自然宿主，感染豬康復(fù)后呈隱性感染，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎或木乃伊，初生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻痹、衰竭直至死亡，死亡率幾乎100%,斷奶仔豬發(fā)病率為20%-40%，死亡率為10°/。-20°/。，該病已成為目前種豬繁殖障礙綜合癥的主要病因，并明顯呈逐年上升趨勢。由于成年豬多為隱性感染，并長期帶毒和排毒而成為潛在的傳染源，給該病的控制和消滅帶來極大的困難。目前世界各國對PR的有效預(yù)防主要是疫苗免疫接種，現(xiàn)有的豬偽狂犬病疫苗有油乳劑滅活疫苗及傳統(tǒng)的弱毒疫苗和基因缺失疫苗，這些疫苗的不足之處在于如油乳劑滅活疫苗安全性好，但免疫效果不理想，注射局部副作用大，血清學(xué)檢測不能區(qū)分疫苗免疫抗體和強(qiáng)毒抗體；弱毒疫苗免疫效果良好，但不能區(qū)分疫苗免疫抗體和強(qiáng)毒抗體，且存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)；基因缺失弱毒疫苗免疫效果良好，并能區(qū)分疫苗免疫抗體和強(qiáng)毒抗體，但基因缺失苗可能會(huì)因基因重組變?yōu)閺?qiáng)毒抹等潛在的不安全問題。因此，改進(jìn)現(xiàn)有的疫苗成為各國研究人員攻克的難題，國外已開展了豬偽狂犬病亞單位ISCOM疫苗的研究，其不足之處在于以強(qiáng)毒為制苗種毒，疫苗制備復(fù)雜繁瑣，疫苗的保存期不明確，限制了疫苗的規(guī)?；a(chǎn)和臨床應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種豬偽狂犬病新型亞單位疫苗制備方法，本發(fā)明以偽狂犬病毒弱毒抹(PRV-FB抹)為種毒，提取PRV-FB囊膜蛋白為免疫原，應(yīng)用新型佐劑QuilA和離心透析相結(jié)合的免疫刺激復(fù)合物制苗新技術(shù)，研制成安全有效的豬偽狂犬病新型亞單位疫苗，研制出的疫苗可用于豬偽狂犬病的預(yù)防和控制，并為動(dòng)物病毒性重大疫病的新型疫苗研究開拓一條新途徑。本發(fā)明所述的疫苗的制備方法是將PRV-FB林細(xì)胞毒經(jīng)差速離心后，重懸于PBS中，調(diào)整病毒抗原的蛋白濃度，加入Mega-10裂解病毒嚢膜蛋白，以離心方法提取嚢膜蛋白，加入適當(dāng)?shù)腎SC0M基質(zhì)，裝袋透析即為PRV新型亞單位疫苗。本發(fā)明是以偽狂犬病毒弱毒抹(PRV-FB抹)為種毒，提取PRV-FB嚢膜蛋白為免疫原，應(yīng)用免疫刺激復(fù)合物(ISC0M)制苗新技術(shù)，研制成安全有效的豬偽狂犬病新型亞單位疫苗，可用于豬偽狂犬病的預(yù)防和控制；本發(fā)明首次在國內(nèi)外全面系統(tǒng)測定了該疫苗的生物學(xué)特性、疫苗的安全性、免疫原性、保存期、抗體持續(xù)期、攻毒保護(hù)率和最小免疫量等各項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)。該疫苗主要含嚢膜糖蛋白不含核酸，不存在疫苗毒的潛伏感染問題，安全性好；同時(shí)，優(yōu)化了嚢膜提取技術(shù)，簡化了生產(chǎn)工藝，ISCOM的應(yīng)用解決了亞單位疫苗免疫原性差的難題。圖1是PRV嚢膜蛋白免疫刺激復(fù)合物電鏡照片(x10萬)復(fù)印件。具體實(shí)施方式以下通過試驗(yàn)例來進(jìn)一步說明本發(fā)明及本發(fā)明的有益效果，(但不是對本發(fā)明的限制)。本發(fā)明所述的疫苗制備方法是將PRV-FB抹細(xì)胞毒經(jīng)差速離心后，重懸于PBS中，調(diào)整病毒抗原的蛋白濃度，加入Mega-lO裂解病毒嚢膜蛋白，以離心方法提取嚢膜蛋白，加入適當(dāng)?shù)腎SC0M基質(zhì)，裝袋透析即為PRV新型亞單位疫苗。PRV嚢膜蛋白亞單位疫苗不含核酸成份，安全性好，且血清學(xué)方法能將自然感染動(dòng)物和疫苗接種動(dòng)物區(qū)別開，但免疫原性差。為此，本發(fā)明人進(jìn)一步采取如下措施，提高其免疫效果(1)上述PRV-FB弱毒的特征與培養(yǎng)是偽狂犬病毒弱毒抹(PRV-FB林)是經(jīng)乳兔腎原代細(xì)胞連續(xù)傳180代結(jié)合蝕斑克隆和低溫誘變技術(shù)選育出的弱毒林，PRV-FB抹對豬、牛、羊等家畜已無致病性；對易感家兔和乳豬盲傳五代，無返強(qiáng)現(xiàn)象;接種動(dòng)物同居接觸感染末發(fā)現(xiàn)水平傳播。上述PRV-FB弱毒林能在如CEF、MDEF、PK-15、VER0、RK、Marc-145等多種細(xì)胞上生長，本發(fā)明考慮到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需要，上述PRV-FB弱毒抹選用CEF或Marc-145細(xì)胞為病毒培養(yǎng)細(xì)胞；PRV-FB病毒的培養(yǎng)是將PRV-FB抹種毒接種CEF或Marc-145單層細(xì)胞，接種量為培養(yǎng)液量的1%，37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)至細(xì)胞病變達(dá)80°/時(shí)，收獲細(xì)胞毒。(2)上述病毒抗原的制備為將PRV-FB細(xì)胞毒經(jīng)-20°C凍融3次，5000rpra離心30-60mins，取上清35000rpm離心90-120mins,取沉淀重懸于PBS中，調(diào)整病毒抗原的蛋白濃度為10-12mg/ml,即為制苗用病毒抗原。(3)上述Mega-IO作用時(shí)間和濃度確定是PRV囊膜蛋白的提取，首先需要完全裂解病毒嚢膜，影響PRV囊膜蛋白提取的主要因素是Mega-lO(華美生物工程公司產(chǎn)品)，因此，篩選最適的Mega-10濃度和作用時(shí)間是提取嚢膜蛋白的關(guān)鍵。本發(fā)明用0.01MpH7.2PBS將上述病毒抗原稀釋至蛋白濃度為lOmg/ml,在制苗用病毒抗原中加入Mega-10至終濃度為l°/。~2%,分別于37°C、室溫下作用2-5小時(shí)，將病毒液鋪到蔗糖墊上(蔗糖墊的上層為PBS配制的10%蔗糖，下層為3(W蔗糖)，35000rpm(超速離心機(jī)，RP40轉(zhuǎn)頭)20。C離心90-120mins,收集樣品層和10%蔗糖層，裝透析袋對0.01MpH7.2PBS透析48小時(shí)，收獲約3ml即為PRV嚢膜蛋白，各取20ul按Bradford法置DyNAQuant200測定儀(Hoefer)測定蛋白濃度(見表1)。結(jié)果顯示Mega-10對PRV嚢膜蛋白的最適作用濃度為2%,作用時(shí)間最佳為在37°C條件下3小時(shí)，其次為室溫條件下4小時(shí)。表1不同濃度的Mega-10對PRV囊膜蛋白提取量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注表中數(shù)字為囊膜蛋白濃度，單位ug/ml。ND表示未測定。(4)ISCOM基質(zhì)及QuilA濃度的選擇在于PRV-ISC0Ms疫苗的免疫原性強(qiáng)弱與囊膜蛋白、ISCOM基質(zhì)和QuilA的組成密切相關(guān)，ISCOM的形成通常通過負(fù)染電鏡觀察見到典型的籠格狀結(jié)構(gòu)(圖1)來證實(shí)。將收集的嚢膜蛋白樣品層和10%蔗糖層混合后分成A、B、C三組，分別加入含0.05%、0.1%、0.2。/。QuilA的ISC0M基質(zhì)，對PBS透析48hrs并經(jīng)適當(dāng)濃縮后，取少許電鏡檢查混合物中的ISC0M顆粒，同時(shí)各免疫5只10—12周齡昆明系小白鼠(普通級(jí)，購自福建省醫(yī)科所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，測定血清抗體。結(jié)果通過電鏡觀察和抗體水平測定比較了ISC0M基質(zhì)中各成份(QuilA、卵磷脂、膽固醇)不同含量的效果，篩選出較佳組合中的Qui1A適宜濃度為0.1%。(5)上述新型疫苗的聚丙烯酰胺凝膠電泳譜(SDS-PAGE)是采用12°/。分離膠，4%濃縮膠，凝膠厚度l咖電泳系統(tǒng)，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白為預(yù)染的蛋白(sigma產(chǎn)品)。取經(jīng)適當(dāng)濃縮的抗原樣品與5x樣品緩沖液按5:l混合煮沸3分鐘后10000rpm離心5rain,取15ul上清上樣，電壓150V至樣品進(jìn)入分離膠后降為100V,電泳至溴酚藍(lán)指示劑距底部lcm時(shí)終止。取出凝膠置于考馬斯亮藍(lán)R250染液中室溫染色30min，經(jīng)脫色液脫色后拍照保存，結(jié)果見PRV新型疫苗主要蛋白帶4條，分子量約為63、50、34、26.5KD。(6)上述新型疫苗的Westernblot特征是采用一孔梳加樣槽，SDS-PAGE樣品為PRV-FB抗原，同上電泳后取出凝膠浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液(25mmol/LTris-HCL、192mmol/L甘氨酸、20%甲醇，PH8.3)10min,按照Towbin等方法將蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上(4。C100mA1.5小時(shí))，將轉(zhuǎn)移過的硝酸纖維膜用TBST(25畫1/LTris-HCL，PH7.5,含150畫1/LNaCL，0.05%Tween-20)洗滌后，在封閉液(TBST-10%小牛血清)中4。C過夜或37。C1小時(shí)封閉，TBST洗滌3次并將NC膜切成4mm寬的反應(yīng)條，加入適當(dāng)稀釋的待檢鼠血清37。C1小時(shí)，同上洗滌后，加入羊抗鼠IgG-AP(工作濃度l:3萬)37。Cl小時(shí)，洗滌，加底物顯色。結(jié)果顯示，新型疫苗免疫鼠血清能識(shí)別PRV的部分蛋白帶，分子量約為63、50KD,而鼠抗PRV強(qiáng)毒血清識(shí)別的蛋白條帶分子量約為95.5、86、63、34KD。提示血清學(xué)方法能區(qū)分強(qiáng)毒感染動(dòng)物和免疫接種動(dòng)物。該疫苗在電鏡下呈籠格狀結(jié)構(gòu)(見圖l),直徑30-40nm,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；免疫學(xué)指標(biāo)測定表明疫苗對小白鼠、斷奶仔豬、懷孕母豬均具有良好的安全性，能誘導(dǎo)產(chǎn)生較好的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，且相當(dāng)于弱毒苗誘導(dǎo)的抗體水平；疫苗的最小免疫量為斷奶仔豬50ug,懷孕母豬1000ug;疫苗在-20。C保存12個(gè)月以上其免疫原性不變；斷奶仔豬免疫后7天即可誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫，抗體持續(xù)期4個(gè)月以上，攻毒保護(hù)率達(dá)100%;母豬免疫后能誘導(dǎo)產(chǎn)生比斷奶仔豬更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，其有效中和抗體持續(xù)6個(gè)月。該疫苗主要含囊膜糖蛋白不含核酸，不存在疫苗毒的潛伏感染問題，安全性好，免疫原性強(qiáng)，血清學(xué)方法能區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物和強(qiáng)毒感染動(dòng)物；并首次在國內(nèi)外系統(tǒng)測定了新型疫苗的生物學(xué)特性和各項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)，進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明的新穎性、創(chuàng)造性和實(shí)用性。本發(fā)明所述PRV-FB林生物材料樣品保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，生物材料樣品保藏單位地址湖北省武漢市武漢大學(xué)，生物材料樣品保藏單位保藏日期2007年10月19日，保藏編號(hào)CCTCC-V200710,分類命名偽狂犬病毒弱毒FB林(PRV-FB)。權(quán)利要求1、一種豬偽狂犬病新型亞單位疫苗制備方法，其特征在于所述的疫苗制備方法是將PRV-FB株細(xì)胞毒經(jīng)差速離心后，病毒重懸于PBS中，調(diào)整病毒抗原的蛋白濃度，加入Mega-10裂解病毒囊膜蛋白，以離心方法提取囊膜蛋白，加適當(dāng)?shù)腎SCOM基質(zhì)，裝袋透析即為PRV新型亞單位疫苗。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述PRV-FB抹的特征與培養(yǎng)是PRV-FB抹是經(jīng)乳兔腎原代細(xì)胞連續(xù)傳180代結(jié)合蝕斑克隆和低溫誘變技術(shù)選育出的弱毒抹，PRV-FB林對豬、牛、羊等家畜已無致病性，對易感家兔和乳豬盲傳五代，無返強(qiáng)現(xiàn)象，接種動(dòng)物同居接觸感染末發(fā)現(xiàn)水平傳播；PRV-FB弱毒林能在CEF、MDEF、PK-15、VERO、RK、Marc-145多種細(xì)胞上生長，所述PRV-FB抹選用CEF或Marc-145細(xì)胞為病毒培養(yǎng)細(xì)胞；PRV-FB病毒的培養(yǎng)是將PRV-FB抹種毒接種CEF或Marc-145單層細(xì)胞，接種量為培養(yǎng)液量的1%,37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)至細(xì)胞病變達(dá)80%時(shí)，收獲細(xì)胞毒。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述病毒抗原的制備為將PRV-FB細(xì)胞毒經(jīng)-20。C凍融3次，5000rpm離心30-60mins,取上清35000rpm離心90-120mins,取沉淀重懸于PBS中，調(diào)整病毒抗原的蛋白濃度為10-12mg/ml,即為制苗用病毒抗原。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的Mega-IO作用時(shí)間和濃度確定是用0.01MPH7.2PBS將上述病毒抗原稀釋至蛋白濃度為10mg/ml,在制苗用病毒抗原中加入Mega-10至終濃度為1%~2%,分別于37°C、室溫下作用2-5小時(shí)，將病毒液鋪到蔗糖墊上，蔗糖墊的上層為PBS配制的10°/蔗糖，下層為30°/。蔗糖，超速離心機(jī)、RP40轉(zhuǎn)頭、35000rpm、20°C離心90-120mins,收集樣品層和10%蔗糖層,裝透析袋對0.01MpH7.2PBS透析48小時(shí)，收獲約3ml即為PRV囊膜蛋白,各取20ul按Bradford法置DyNAQ畫t200測定儀測定蛋白濃度；Mega-10對PRV囊膜蛋白的最適作用濃度為2%，作用時(shí)間最佳為在37°C條件下3小時(shí)，其次為室溫條件下4小時(shí)。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的ISCOM基質(zhì)及QuilA濃度的選擇是將收集的嚢膜蛋白樣品層和10%蔗糖層混合后分成A、B、C三組，分別加入含0.05%、0.1%、0.2%QuilA的ISCOM基質(zhì)，對PBS透析48hrs并經(jīng)適當(dāng)濃縮后，取少許電鏡檢查混合物中的ISCOM顆粒，同時(shí)各免疫5只10—12周齡昆明系小白鼠，測定血清抗體；通過電鏡觀察和抗體水平測定比較ISCOM基質(zhì)中各成份QuilA、卵磷脂、膽固醇不同含量的效果，篩選出較佳組合中的QuilA適宜濃度為0.1%。6、根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備方法，其特征在于所述的制備方法的新型疫苗的聚丙烯酰胺凝膠電泳譜SDS-PAGE是PRV新型疫苗主要蛋白帶4條，分子量約為63、50、34、26.5KD。7、根據(jù)權(quán)利要求l所迷的制備方法，其特征在于所述的新型疫苗的Westernblot特征是新型疫苗免疫鼠血清能識(shí)別PRV的部分蛋白帶，分子量約為63、5OKD,而鼠抗PRV強(qiáng)毒血清識(shí)別的蛋白條帶分子量約為95.5、86、63、34KD。全文摘要本發(fā)明公開了一種豬偽狂犬病新型亞單位疫苗制備方法，其特征在于所述的制備方法是將PRV-FB株細(xì)胞毒經(jīng)差速離心后，病毒重懸于PBS中，調(diào)整病毒抗原的蛋白濃度，加入Mega-10裂解病毒囊膜蛋白，以離心方法提取囊膜蛋白，加適當(dāng)?shù)腎SCOM基質(zhì)，裝袋透析即為PRV新型亞單位疫苗。本發(fā)明是以偽狂犬病毒弱毒株(PRV-FB株)為種毒，提取PRV-FB囊膜蛋白為免疫原，應(yīng)用免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)制苗新技術(shù)，研制成安全有效的豬偽狂犬病新型亞單位疫苗，可用于豬偽狂犬病的預(yù)防和控制。文檔編號(hào)A61P31/00GK101332297SQ20071018177公開日2008年12月31日申請日期2007年10月22日優(yōu)先權(quán)日2007年6月26日發(fā)明者俞伏松,梅林,林天龍,程曉霞,陳仕龍,陳少鶯申請人:陳少鶯