一種靶向納米聲敏劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于功能性藥物的制備技術(shù)，具體涉及一種靶向納米聲敏劑及其制備方法。該聲敏劑包括姜黃素和鐵蛋白，含量比為1：20～200(按體積比)；該聲敏劑通過如下方法制備：鐵蛋白分離純化→鐵蛋白變性解離→加入姜黃素混合→復(fù)性→靜置→透析→濃縮。本發(fā)明將姜黃素包埋在鐵蛋白內(nèi)部空腔后能提高其水溶性和穩(wěn)定性，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于功能性藥物的制備技術(shù)，具體涉及一種靶向納米聲敏劑及其制備方 法。 一種祀向納米聲敏劑及其制備方法

【背景技術(shù)】
[0002] 聲動(dòng)力化學(xué)療法（sonodynamic chemistry therapy, SDCT)是近年來發(fā)展起來的 一種腫瘤治療新方法，是指給腫瘤患者注射聲敏劑，用一定頻率和強(qiáng)度的超聲波輻照腫瘤 部位，激發(fā)聚集在腫瘤組織中的聲敏劑，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生不可逆性損傷，從而達(dá)到腫瘤治 療的目的。聲敏劑可選擇性聚集于腫瘤組織，未經(jīng)激活時(shí)無細(xì)胞毒性，一旦被超聲波激活即 可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的損傷。隨著聲動(dòng)力化學(xué)療法的發(fā)展和成熟，選擇抗腫瘤效果好、毒副反應(yīng) 小的聲敏劑成為研究的熱點(diǎn)。
[0003] 姜黃素是從植物姜黃中提取的天然食用脂溶性色素，姜黃盛產(chǎn)于世界各地，歷史 悠久。姜黃素是由碳、氫、氧組成的有機(jī)物，分子式為C 21H2(l06，相對(duì)分子量為368. 37,通常被 用作香料，食品保鮮劑、調(diào)味劑、著色劑。廣泛研究表明姜黃素具有多種有益人類健康的生 理功能，主要有抗氧化、抗炎、抑制糖基化終產(chǎn)物（AGEs)、抗老年癡呆、抗HIV、抗菌、保肝作 用；此外，其對(duì)心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等也具多方面的藥理作用。最近的研究表明姜黃素是 一種很好的聲敏劑，具有抗腫瘤的作用。
[0004] 但是，由于姜黃素的溶解性能極差，只能溶于有限的幾種有機(jī)溶劑中而不溶于水， 其應(yīng)用形態(tài)僅局限于膠囊、粉劑；另外，由于姜黃素分子中含有多個(gè)雙鍵，因此很多外源因 素都會(huì)影響姜黃素的穩(wěn)定性而使其發(fā)生降解或結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而使其功能減弱或喪失； 而且姜黃素由于水溶性低以致生物利用率也較低。這些都極大地限制了姜黃素的廣泛應(yīng) 用，因此如何提高其水溶性對(duì)拓寬其應(yīng)用至關(guān)重要。
[0005] 目前將納米藥物載體運(yùn)用于姜黃素的藥物輸送方面，其做法是將姜黃素包埋在脂 質(zhì)體或者其它微粒里面，已經(jīng)報(bào)道的有牛血清白蛋白和殼聚糖，或者與磷脂和環(huán)糊精形成 的復(fù)合物等。雖然這些膠體納米載體很有應(yīng)用前景并且被認(rèn)為具有生物相容性，但是在安 全性和組織毒性方面的問題仍然不能忽視，這些物質(zhì)可能會(huì)穿透細(xì)胞沉積在肺部，進(jìn)入血 液，或者對(duì)其他組織的細(xì)胞產(chǎn)生作用，最終發(fā)揮生理效應(yīng)。我們自身的細(xì)胞可能不會(huì)檢測到 這些納米粒子，因此這些物質(zhì)可能會(huì)留在體內(nèi)發(fā)揮作用最終導(dǎo)致疾病。其他常見的用于制 備納米顆粒的技術(shù)有乳化-溶劑揮發(fā)法，乳化-溶劑擴(kuò)散法，凝聚法等等，但是以上方法經(jīng) 常會(huì)用到一定量的表面活性劑而導(dǎo)致溶劑殘留污染以及納米粒徑不均一等問題。另外還有 通過增加姜黃素的表面積來增加其溶解速率，這些方法主要是減小顆粒的尺寸如研磨法， 超聲法等等，而這些方法需要一些相關(guān)設(shè)備的輔助，且過程較復(fù)雜。
[0006] 鐵蛋白是一種天然的納米材料，其球形中空結(jié)構(gòu)是一個(gè)良好的納米反應(yīng)器。而且 鐵蛋白作為一種蛋白質(zhì)，不僅無毒無害，而且還是一種很好的營養(yǎng)物質(zhì)，生物相容性好。鐵 蛋白分布廣泛，來源豐富，含量高，并且分離純化方法成熟，利用鐵蛋白可逆自組裝特性包 埋姜黃素，制備的聲敏劑，具有天然、安全、生物可降解的特點(diǎn)，因此，可以將其開發(fā)成藥物 或者天然功能性保健品，具有廣闊的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種靶向納米聲敏劑及其制備方法，將姜黃素包埋在鐵蛋白 內(nèi)部空腔后能提高其水溶性和穩(wěn)定性，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍，具有良好的應(yīng)用前景。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0009] -種靶向納米聲敏劑的制備方法，所述方法包括以下步驟：
[0010] a)鐵蛋白分離純化：將目的工程菌接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)鐵蛋白 表達(dá)，接著利用鹽析透析方法得到粗鐵蛋白，再通過陰離子交換層析、分子篩層析分離純化 得到純鐵蛋白；
[0011] b)鐵蛋白變性解離：取鐵蛋白溶液，不斷緩慢攪拌，加入酸調(diào)節(jié)pH至1?3 ;
[0012] c)加入姜黃素混合：在鐵蛋白變性液中加入姜黃素，其添加比例（按鐵蛋白與姜 黃素的體積比）為1 :20?200,攪拌混合反應(yīng)；
[0013] d)復(fù)性：將混合液pH調(diào)到7?8,不斷緩慢攪拌；
[0014] e)靜置；
[0015] f)透析：將制備好的包埋物透析，除去未包埋的姜黃素；
[0016] g)濃縮：通過濃縮得到濃縮溶液，即為制備好的鐵蛋白姜黃素靶向納米聲敏劑。
[0017] 步驟a)中，目的工程菌接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為6?10小時(shí)。
[0018] 步驟b)中，攪拌轉(zhuǎn)速60?100轉(zhuǎn)/分鐘。
[0019] 步驟c)中，攪拌混合反應(yīng)時(shí)間為20?40分鐘。
[0020] 步驟d)中，攪拌時(shí)間為30?60分鐘，轉(zhuǎn)速60?100轉(zhuǎn)/分鐘。
[0021] 步驟e)中，靜置時(shí)間為1?2小時(shí)。
[0022] -種利用上述方法制備的靶向納米聲敏劑。
[0023] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0024] 本發(fā)明所采用的主要原料鐵蛋白，來源廣泛，分離純化技術(shù)成熟；同樣姜黃素更是 方便易得，價(jià)格又是天然食品原料。而且鐵蛋白是一種天然蛋白質(zhì)，無毒無害又有營養(yǎng)價(jià) 值；而姜黃素是具有多種生物活性的功能因子，是具有抗腫瘤活性的聲敏劑，由于水溶性差 及不穩(wěn)定等因素限制其應(yīng)用，本發(fā)明將其包埋在鐵蛋白內(nèi)部空腔后能提高其水溶性和穩(wěn)定 性，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍，具有良好的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明的技術(shù)路線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0027] 本發(fā)明所述的靶向納米聲敏劑包括姜黃素和鐵蛋白，姜黃素與鐵蛋白的含量比為 1 :20?200(按體積比）；其中，姜黃素作為聲敏劑，鐵蛋白作為分子納米包埋劑，該聲敏劑 通過如下方法制備：鐵蛋白分離純化一蛋白變性解離一加入姜黃素混合一復(fù)性一靜置一透 析一濃縮。
[0028] 本發(fā)明所述的靶向納米聲敏劑的制備方法，具體步驟如下：
[0029] a)鐵蛋白分離純化：將目的工程菌接種于培養(yǎng)基中，于37°C，150轉(zhuǎn)/分鐘恒溫?fù)u 床中培養(yǎng)6?10小時(shí)后，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)鐵蛋白表達(dá)，接著利用鹽析透析方法得到粗鐵蛋 白，再通過陰離子交換層析、分子篩層析分離純化得到純鐵蛋白溶液；
[0030] b)鐵蛋白變性解離：取純鐵蛋白溶液，不斷緩慢攪拌，轉(zhuǎn)速60?100轉(zhuǎn)/分鐘，加 入酸調(diào)節(jié)pH至1?3,鐵蛋白變性解離成單個(gè)亞基，得到鐵蛋白變性液；
[0031] c)加入姜黃素混合：在鐵蛋白變性液中加入姜黃素，其添加比例（按鐵蛋白與姜 黃素的體積比）為1 :20?200,攪拌混合反應(yīng)20?40分鐘，使之充分接觸；
[0032] d)復(fù)性：將混合液pH調(diào)到7?8,攪拌30?60分鐘，轉(zhuǎn)速60?100轉(zhuǎn)/分鐘，使 鐵蛋白復(fù)性重新組裝成球形結(jié)構(gòu)，這一復(fù)性過程中將姜黃素包埋在鐵蛋白內(nèi)部空腔中，得 到包埋物；
[0033] e)靜置：靜置時(shí)間1?2小時(shí)；
[0034] f)透析：將制備好的包埋物透析，除去未包埋的姜黃素；
[0035] g)濃縮：通過濃縮得到濃縮溶液，即為制備好的鐵蛋白姜黃素靶向納米聲敏劑。
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 將目的工程菌接種于培養(yǎng)基中，在37°C，150轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)后加入 誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)動(dòng)物鐵蛋白表達(dá)，接著利用鹽析透析方法得到動(dòng)物粗鐵蛋白，再通過陰離子交 換層析、分子篩層析分離純化得到動(dòng)物純鐵蛋白溶液；
[0038] 取5-10mL動(dòng)物純鐵蛋白質(zhì)溶液，加入酸溶液攪拌，攪拌速度為60轉(zhuǎn)/分鐘，調(diào)節(jié) pH至1?3使蛋白變性解離；
[0039] 接著按鐵蛋白與姜黃素的體積比1 :20緩慢加入姜黃素混合，攪拌混合反應(yīng)20分 鐘；
[0040] 隨后用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值到7?8,攪拌60分鐘，轉(zhuǎn)速60轉(zhuǎn)/分鐘；
[0041] 靜置2小時(shí)；
[0042] 將復(fù)性后的溶液置于孔徑為12, 000-14, OOODa透析袋中透析除去游離的姜黃素；
[0043] 透析完濃縮該溶液，濃縮，即為制備好的鐵蛋白姜黃素靶向納米聲敏劑。
[0044] 實(shí)施例2
[0045] 將目的工程菌接種于培養(yǎng)基中，在37°C，150轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10小時(shí)后加 入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)植物鐵蛋白表達(dá)，接著利用鹽析透析方法得到植物粗鐵蛋白，再通過陰離子 交換層析、分子篩層析分離純化得到植物純鐵蛋白溶液；
[0046] 取5-10mL植物鐵蛋白質(zhì)溶液，加入酸溶液攪拌，轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘調(diào)節(jié)pH至 1?3使蛋白變性解離；
[0047] 接著按鐵蛋白與姜黃素的體積比1 :200緩慢加入姜黃素混合，攪拌混合反應(yīng)30分 鐘；
[0048] 隨后用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值到7?8,攪拌40分鐘，轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘；
[0049] 靜置1小時(shí)；
[0050] 將復(fù)性后的溶液置于孔徑為12, 000-14, OOODa透析袋中透析除去游離的姜黃素；
[0051] 透析完濃縮該溶液，濃縮，即為制備好的鐵蛋白姜黃素靶向納米聲敏劑。
【權(quán)利要求】
1. 一種靶向納米聲敏劑的制備方法，其特征在于： 所述方法包括以下步驟： a) 鐵蛋白分離純化：將目的工程菌接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)鐵蛋白表 達(dá)，接著利用鹽析透析方法得到粗鐵蛋白，再通過陰離子交換層析、分子篩層析分離純化得 到純鐵蛋白； b) 鐵蛋白變性解離：取鐵蛋白溶液，不斷緩慢攪拌，加入酸調(diào)節(jié)pH至1?3 ; c) 加入姜黃素混合：在鐵蛋白變性液中加入姜黃素，其添加比例（按鐵蛋白與姜黃素 的體積比）為1 :20?200,攪拌混合反應(yīng)； d) 復(fù)性：將混合液pH調(diào)到7?8,不斷緩慢攪拌； e) 靜置； f) 透析：將制備好的包埋物透析，除去未包埋的姜黃素； g) 濃縮：通過濃縮得到濃縮溶液，即為制備好的鐵蛋白姜黃素靶向納米聲敏劑。
2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于： 步驟a)中，目的工程菌接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為6?10小時(shí)。
3. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于： 步驟b)中，攪拌轉(zhuǎn)速60?100轉(zhuǎn)/分鐘。
4. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于： 步驟c)中，攪拌混合反應(yīng)時(shí)間為20?40分鐘。
5. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于： 步驟d)中，攪拌時(shí)間為30?60分鐘，轉(zhuǎn)速60?100轉(zhuǎn)/分鐘。
6. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于： 步驟e)中，靜置時(shí)間為1?2小時(shí)。
7. -種利用上述權(quán)利要求之一所述的方法制備的靶向納米聲敏劑。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104096231SQ201410334178
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】趙廣華, 陳凌利, 許川山, 梁榮能 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)