人參皂苷Rd在制備促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷組織修復(fù)藥物的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及人參皂苷Rd在制備促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷組織修復(fù)藥物的應(yīng)用。提高皮膚表皮祖細(xì)胞活性和成纖維細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖，促進(jìn)膠原纖維蛋白分泌，減少基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，對于皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷組織修復(fù)具有十分重要的作用。尋找一種能提高皮膚表皮祖細(xì)胞和成纖維細(xì)胞活性，促進(jìn)膠原纖維蛋白分泌，減少基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的物質(zhì)，能有效加快皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷組織修復(fù)。首先培養(yǎng)皮膚角質(zhì)祖細(xì)胞(KPCs)和人皮膚成纖維細(xì)胞(HDFs)，然后試用不同劑量人參皂苷Rd，利用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR和Western?blot等實(shí)驗(yàn)方法，證實(shí)人參皂苷Rd處理后KPCs和HDFs細(xì)胞活性增強(qiáng)，I-型膠原纖維蛋白分泌增加，MMP1表達(dá)減少；有促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷組織修復(fù)的功能。利用人參皂苷Rd開發(fā)為一種促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)的新藥。
【專利說明】人參皂苷Rd在制備促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷組織修復(fù)藥 物的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及人參皂苷Rd在制備促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合 和損傷組織修復(fù)藥物的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 加快皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷組織修復(fù)是一個(gè)古老的醫(yī)學(xué)課題，其中，加快皮膚創(chuàng)傷 愈合是外科學(xué)研究中的熱點(diǎn)。創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)是各種修復(fù)細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡 的過程，也是多種細(xì)胞因子相互作用的過程。研制促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷組織修復(fù)的藥 物，對提高組織自我修復(fù)能力，縮短創(chuàng)傷愈合時(shí)間，增強(qiáng)機(jī)體活力有重要意義。
[0003] 在創(chuàng)傷愈合組織修復(fù)過程中，（1)免疫細(xì)胞炎癥反應(yīng)是創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)的基 礎(chǔ)。雖然炎癥反應(yīng)不直接參與創(chuàng)傷愈合和組織修補(bǔ)，但是，它能通過調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子分 泌，增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性和功能，產(chǎn)生氧自由基和釋放溶酶體，清除壞死組織和異物，防止感 染發(fā)生，為創(chuàng)傷愈合修復(fù)細(xì)胞的活動(dòng)創(chuàng)造條件。（2)成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)對創(chuàng)傷愈合和 組織修復(fù)起主要作用。成纖維細(xì)胞是構(gòu)成肉芽組織的主要細(xì)胞成分之一，能合成和分泌膠 原、纖維連接蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖和透明質(zhì)酸等多種細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞外基質(zhì)對細(xì)胞 的形態(tài)、細(xì)胞的生長和分化有重要調(diào)節(jié)功能。（3)內(nèi)皮細(xì)胞和新血管為創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù) 提供保障。內(nèi)皮細(xì)胞是形成毛細(xì)血管的主要細(xì)胞，為創(chuàng)傷組織提供足夠的氧和營養(yǎng)物質(zhì)，保 證創(chuàng)傷愈合。內(nèi)皮細(xì)胞還能分泌多種細(xì)胞因子，參與創(chuàng)傷組織的修復(fù)與調(diào)控。（4)角質(zhì)細(xì)胞 活化和上皮再生對創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)有重要作用。創(chuàng)傷愈合是由上皮組織中角質(zhì)形成細(xì) 胞的遷移來完成，使暴露的創(chuàng)傷重新被上皮覆蓋，角質(zhì)形成細(xì)胞能通過分泌細(xì)胞因子，直接 或間接參與創(chuàng)傷修復(fù)與調(diào)控。
[0004] 總之，（1) (3)為創(chuàng)傷愈合和損傷組織修復(fù)提供基礎(chǔ)條件，⑵⑷是創(chuàng)傷愈合和損 傷組織修復(fù)主體成分，增強(qiáng)皮膚成纖維細(xì)胞和皮膚角質(zhì)祖細(xì)胞活性是加速皮膚創(chuàng)傷愈合和 損傷組織修復(fù)的關(guān)鍵。篩選能促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞和皮膚角質(zhì)祖細(xì)胞增殖，加快膠原蛋白 分泌的活性成分，對研制促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷組織修復(fù)藥物十分重要。
[0005] 文獻(xiàn)報(bào)道，人參提取物能提高人皮膚成纖維細(xì)胞（HDF)活性，并具有明顯的抗氧 化作用。人參皂苷Rgl衍生物人參皂苷F1能抵抗紫外線誘導(dǎo)的人皮膚角質(zhì)細(xì)胞凋亡。人 參皂苷Rbl能促進(jìn)皮膚燒傷創(chuàng)面愈合過程中的血管生成。大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，人參中具有 預(yù)防皮膚損傷，促進(jìn)皮膚再生的活性成分。
[0006] 我們在人參中尋找到一種增強(qiáng)皮膚成纖維細(xì)胞活性，促進(jìn)膠原蛋白產(chǎn)生，減少膠 原蛋白降解，加快皮膚角質(zhì)祖細(xì)胞分裂，從而促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷組織修復(fù)的活性成 分。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種人參皂苷Rd，在制備促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷組織修 復(fù)藥物中應(yīng)用。
[0008] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，增強(qiáng)皮膚成纖維細(xì)胞活性，促進(jìn)膠原蛋白分泌和加快皮膚角質(zhì)祖 細(xì)胞分裂對促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷組織修復(fù)具有十分重要的作用。人參皂苷Rd能顯著 促進(jìn)HDFs細(xì)胞增殖、遷移、I -型膠原蛋白表達(dá)和分泌；促進(jìn)KPCs活性增強(qiáng)、細(xì)胞分裂加 快。
[0009] 首先在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)HDFs和KPCs，試用三種不同濃度的人參皂苷Rd細(xì)胞培養(yǎng)液處 理HDFs和KPCs，應(yīng)用MTT和ELISA等實(shí)驗(yàn)方法，觀察到細(xì)胞活性均能顯著增強(qiáng)，增殖加快。 應(yīng)用RT-PCR和Western blot等實(shí)驗(yàn)方法，觀察到I -型膠原蛋白表達(dá)分泌增加，MMP1表達(dá) 分泌減少。
[0010] 有益效果：提高機(jī)體自我修復(fù)能力，加快皮膚創(chuàng)傷愈合，縮短創(chuàng)傷愈合時(shí)間，恢復(fù) 機(jī)體功能。在戰(zhàn)地急救、意外傷害救護(hù)和外科手術(shù)中有重要意義。人參皂苷Rd能提高HDFs 和KPCs活性。增加 I -型膠原蛋白分泌，抑制MMP1表達(dá)。具有提高皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷 組織修復(fù)的能力，能在制備促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷組織修復(fù)的藥物中應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1為經(jīng)Rd處理后，MTT檢測KPCs細(xì)胞活性。
[0012] 圖2為經(jīng)Rd處理后，MTT檢測HDFs細(xì)胞活性。
[0013] 圖3為經(jīng)Rd處理后，RT-PCR檢測HDFs細(xì)胞I -型膠原mRNA表達(dá)水平。
[0014] 圖4為經(jīng)Rd處理后，Western blot檢測HDFs細(xì)胞I -型膠原蛋白水平。
[0015] 圖5為經(jīng)Rd處理后，RT-PCR檢測HDFs細(xì)胞MMPlmRNA表達(dá)水平。
[0016] 圖6為經(jīng)Rd處理后，Western blot檢測HDFs細(xì)胞MMP1蛋白水平。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 1. KPCs 和 HDFs 細(xì)胞培養(yǎng)
[0018] 分別用6孔培養(yǎng)板在角質(zhì)細(xì)胞生長培養(yǎng)基（KGM2)和10 %胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中 接種KPCs (4X104)和HDFs (3X104)兩種細(xì)胞。之后更換無血清培養(yǎng)基，過夜。再用不同濃 度人參皂苷Rd分組處理。在KGM2或DMEM完全培養(yǎng)基中37°C、5% C02恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 小時(shí)。
[0019] 2·ΜΤΤ 實(shí)驗(yàn)
[0020] 經(jīng)不同濃度人參皂苷Rd分組處理后的KPCs和HDFs，每孔加入ΜΤΤ溶液（5mg/ml)， 所加入MTT溶液約為培養(yǎng)基體積的5%。37°C、5% C02恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)。離心后棄 上清液，加入二甲基亞砜（DMS0)，搖床低速振蕩，酶聯(lián)免疫檢測儀595nm測量各組吸光值。
[0021] 3. RT-PCR 檢測
[0022] 經(jīng)不同濃度人參皂苷Rd分組處理HDFs24小時(shí)后，使用Trizol提取細(xì)胞中總RNA， 通過測量260nm和280nm處0D值，檢測所提取RNA量以及純度。根據(jù)Takara公司提供的 RT-PCR試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，引物序列如下：1_型膠原上游引物為5' -TAG GGTCTAGACATGTTCAGCTTTGT-3'，下游引物為 5，-GTGAGGGGTGGGATGTCTTCGT-3，；MMP1 上 游引物為 5' -AGATGTGGAGTGCCTGATGT-3'，下游引物為 5' -CTAGGGTACATCAAAGCC-3'; GAPDH 上游引物為 5 ' -CGATATCCCTCCAAAATCAA-3 '，下游引物為 5' -TGTGGTCATGAGTCCTCCCA-3'。選用退火溫度分別為 95°C、54°C和 72°C。使用 1.5%瓊 脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物量。檢測I型膠原和MMP-1各組灰度值。
[0023] 4. Western blotting 檢測
[0024] HDFs細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度2 X105,過夜。無血清培養(yǎng)24小時(shí)。用不 同濃度的人參皂甙Rd處理24小時(shí)，檢測I型膠原和MMP-1。用細(xì)胞被裂解緩沖液I處理 后4°C離心13000rpml5min。收集上清。巴德福特法酶標(biāo)儀測定樣品中的總蛋白。SDS聚 丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，MMP1 (1:1000)，抗膠原（1:1000)處 理。膜漂洗后二抗孵育，用TBST緩沖液水平搖床漂洗，暗室PVDF膜X光曝光及顯影。
[0025] 5.結(jié)果分析
[0026] (1)人參皂苷Rd促進(jìn)KPCs和HDFs細(xì)胞增殖
[0027] 用三組不同濃度人參皂苷Rd培養(yǎng)皮膚角質(zhì)祖細(xì)胞（KPCs)和人皮膚成纖維細(xì)胞 (HDFs) 24小時(shí)，均能不同程度提高兩種細(xì)胞活性，并有濃度依賴性，人參皂苷Rd高濃度組 促進(jìn)KPCs和HDFs活性增強(qiáng)程度更加明顯（圖1、圖2)。人參皂苷Rd促進(jìn)KPCs和HDFs細(xì) 胞增殖對損傷組織修復(fù)和皮膚創(chuàng)傷愈合有重要作用。
[0028] (2)人參皂苷Rd促進(jìn)HDFs細(xì)胞I -型膠原mRNA表達(dá)和蛋白產(chǎn)生
[0029] 人生皂苷Rd除促進(jìn)HDFS增殖和遷移增外，還提高I -型膠原mRNA的表達(dá)水平和 蛋白水平（圖3、圖4)。膠原蛋白是主要細(xì)胞間質(zhì)，在皮膚創(chuàng)傷愈合與損傷組織修復(fù)過程中， 發(fā)揮重要功能。由于纖維細(xì)胞會(huì)隨著結(jié)締組織間質(zhì)移動(dòng)，由膠原蛋白纖維形成的立體結(jié)構(gòu) 可以協(xié)助纖維細(xì)胞聚集，能加快損傷組織的修復(fù)。
[0030] (3)人參皂苷Rd抑制HDFs細(xì)胞MMPlmRNA表達(dá)和蛋白產(chǎn)生
[0031] 人參阜苷Rd能降低MMPlmRNA表達(dá)水平。Western blot分析顯示，也顯著降低了 MMP1蛋白水平（圖5、圖6)。在傷口愈合初期，MMP1對清除壞死組織，預(yù)防組織感染有重要 作用。在組織修復(fù)期間，抑制MMP1表達(dá)，能防止結(jié)締組織過度分解，對加快皮膚創(chuàng)傷愈合和 損傷組織修復(fù)。
[0032] 綜上可以看出，人參皂苷Rd通過增加皮膚角質(zhì)細(xì)胞和人皮膚成纖維細(xì)胞活性，促 進(jìn)其增殖；提高對HDFs細(xì)胞I -型膠原mRNA的表達(dá)水平和蛋白水平；抑制MMP1表達(dá)，能加 快皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷組織的修復(fù)。
【權(quán)利要求】
1.人參皂苷Rd在制備促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷組織修復(fù)藥物中的應(yīng)用，其特征是人 參皂苷Rd可提高皮膚角質(zhì)祖細(xì)胞和人皮膚成纖維細(xì)胞活性，促進(jìn)增殖，增加 I-型膠原纖維 蛋白分泌，抑制MMP1表達(dá)，從而促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合和損傷組織修復(fù)。
【文檔編號】A61K31/704GK104055785SQ201410312581
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】霍洪亮, 李鳳玉, 彭雪薇 申請人:東北師范大學(xué)