西黃緩釋片活性組分及其緩釋片和制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域，特別是涉及一種西黃緩釋片活性組分，它由下述重量份數(shù)的原料經(jīng)過下述步驟制得：牛黃15份、麝香15份、乳香（醋制）550份、沒藥（醋制）550份；步驟一，將乳香和沒藥分別低溫粉碎，過24目篩混合，將所得混合物裝入超臨界萃取罐中，在壓力35MPa，溫度45℃的條件下，萃取3h，得乳香沒藥超臨界萃取物55～88份，備用；步驟二，將牛黃粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得牛黃粉末15份，備用；步驟三，將麝香粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得麝香粉末15份，備用。本發(fā)明還涉及包含上述活性組分的西黃緩釋片劑及其制備方法。本發(fā)明的西黃緩釋片能有效控制處方中活性成分的釋放速率，改善活性成分釋放的規(guī)律性，穩(wěn)定血藥濃度，延長和提高療效。
【專利說明】西黃緩釋片活性組分及其緩釋片和制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域，特別是涉及一種中藥緩釋制劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]西黃丸，出自清代著名醫(yī)家王洪緒所著《外科證治全生集.卷四》。作為一種純中藥制劑，西黃丸經(jīng)大量的臨床驗(yàn)證，療效確切，尤其在乳腺癌、肝癌、白血病、胰腺癌等多種癌癥的治療中效果顯著，被公認(rèn)為抗腫瘤的經(jīng)典名方。
[0003]西黃丸方現(xiàn)已被收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第九冊第71頁，其有效成分原料藥的重量配比為:牛黃15份、磨香15份、乳香(醋制)550份和沒藥(醋制)550份，上市劑型主要為丸劑。西黃丸的生產(chǎn)工藝是將全部藥材制粉加入黃米等輔料用水泛丸制成。成品為褐色水丸。但在實(shí)際應(yīng)用過程中人們發(fā)現(xiàn):上述制備方法存在著處方服用量過大、無法保證處方中有效成分釋放的規(guī)律性和揮發(fā)性成分的穩(wěn)定性等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的旨在提供一種的西黃緩釋片活性組分、西黃緩釋片劑及其制備工藝。
[0005]具體地說，本發(fā)明的第一方面是提供了一種西黃緩釋片活性組分，它由下述重量份數(shù)的原料經(jīng)過下 述步驟制得:
[0006]牛黃15份、麝香15份、乳香(醋制)550份、沒藥(醋制)550份；
[0007]步驟一，將乳香和沒藥分別低溫粉碎，過24目篩混合，將所得混合物裝入超臨界萃取罐中，在壓力35MPa，溫度45°C的條件下，萃取3h，，得乳香沒藥超臨界萃取物55~88份，備用；
[0008]步驟二，將牛黃粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得牛黃粉末15份，備用；
[0009]步驟三，將麝香粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得麝香粉末15份，備用。
[0010]本發(fā)明的第二方面是提供了一種西黃單層緩釋片，它由下述重量比的成分制成:
[0011]上述西黃緩釋片活性組分中的乳香沒藥超臨界萃取物55~88份；
[0012]上述西黃緩釋片活性組分中的牛黃粉末15份；
[0013]上述西黃緩釋片活性組分中的麝香粉末15份；
[0014]表面活性劑30~80份，所述表面活性劑選自Kolliphor HS、Kolliphor EL、Kolliphor TPGS、吐溫-80或二甲亞砜中的一種和多種；
[0015]吸附固化劑30~100份，所述吸附固化劑選自AEROPERLil 300pharm、Aerosil?200pharma、二氧化娃或Kollidon CL-SF中的一種和多種；
[0016]骨架材料35~80份，所述骨架材料選自羥丙甲基纖維素、羥丙甲基纖維素與乙基纖維素1:1或2:1混合物或羥丙甲基纖維素與Kollidon SR3:1混合物中的一種和多種；
[0017]填充劑150~300份，所述填充劑選自微晶纖維素、乳糖、可壓性淀粉或速流甘露醇中的一種和多種。[0018]在一優(yōu)選例中,所述表面活性劑的用量為50~60份。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述吸附固化劑的用量為50~80份。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述骨架材料的用量為50~70份。
[0021]在另一優(yōu)選例中，所述填充劑的用量為200~250份。
[0022]本發(fā)明的第三方面是提供了一種西黃單層緩釋片的制備方法，包括按配方量將表面活性劑與乳香沒藥超臨界萃取物混合均勻，加入到攪拌狀態(tài)中的吸附固化劑中，攪拌至乳香沒藥超臨界萃取物全部被吸收，再依次加入骨架材料、填充劑、麝香粉末、牛黃粉末，等量遞增混勻，壓片即得。
[0023]本發(fā)明的第四方面是提供了一種西黃雙層緩釋片，它包括緩釋層A和緩釋層B，所述緩釋層A由下述重量比的成分制成:
[0024]上述西黃緩釋片活性組分中的乳香沒藥超臨界萃取物55~88份；
[0025]上述西黃緩釋片活性組分中的麝香粉末15份；
[0026]表面活性劑30~60份，所述表面活性劑選自Kolliphor HS、Kolliphor EL、Kolliphor TPGS、吐溫-80或二甲亞砜中的一種和多種；
[0027]吸附固化劑30~100份，所述吸附固化劑選自AEROPERLfc 300pharm、Aerosil?200pharma、二氧化娃或Kollidon CL-SF中的一種和多種；
[0028]骨架材料10~30份，所述骨架材料選自羥丙甲基纖維素、羥丙甲基纖維素與乙基纖維素1:1或2:1混合物或羥丙甲基纖維素與Kollidon SR3:1混合物中的一種和多種；
[0029]填充劑120~250份，所述填充劑選自微晶纖維素、乳糖、可壓性淀粉或速流甘露醇中的一種和多種；
[0030]所述緩釋層B由下述重量比的成分制成:
[0031]上述西黃緩釋片活性組分中的牛黃粉末15份；
[0032]骨架材料10~27份，所述骨架材料選自羥丙甲基纖維素、羥丙甲基纖維素與乙基纖維素1:1或2:1混合物或羥丙甲基纖維素與Kollidon SR3:1混合物中的一種和多種；
[0033]填充劑100~200份，所述填充劑選自微晶纖維素、乳糖、可壓性淀粉或速流甘露醇中的一種和多種。
[0034]在一優(yōu)選例中，所述緩釋層A中的表面活性劑的用量為40~50份。
[0035]在另一優(yōu)選例中，所述緩釋層A中的吸附固化劑的用量為58~80份。
[0036]在另一優(yōu)選例中，所述緩釋層A中的骨架材料的用量為14~22份。
[0037]在另一優(yōu)選例中，所述緩釋層A中的填充劑的用量為160~200份。
[0038]在另一優(yōu)選例中，所述緩釋層B中的骨架材料的用量為15~23份。
[0039]在另一優(yōu)選例中，所述緩釋層B中的填充劑的用量為140~160份。
[0040]本發(fā)明的第五方面是提供了一種西黃雙層緩釋片的制備方法，包括如下步驟:
[0041]步驟一，按配方量將表面活性劑與乳香沒藥的超臨界提取物混合均勻，加入到攪拌狀態(tài)中的吸附固化劑中，攪拌至乳香沒藥超臨界提取物全部被吸收，再依次加入骨架材料、填充劑、麝香粉末，等量遞增混勻；
[0042]步驟二，按配方量將牛黃粉末與骨架材料、填充劑等量遞增混勻；
[0043]步驟三，分別取兩層粉末，壓片，即得。
[0044] 本發(fā)明各個(gè)方面的細(xì)節(jié)將在隨后的章節(jié)中得以詳盡描述。通過下文以及權(quán)利要求的描述，本發(fā)明的特點(diǎn)、目的和優(yōu)勢將更為明顯。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1體現(xiàn)了本發(fā)明的西黃緩釋片活性組分對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞生長抑制作用。
[0046]圖2體現(xiàn)了各實(shí)驗(yàn)組外周血細(xì)胞數(shù)(Srfcs，n = 10),與CTX組相比*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01 ;與西黃丸組相比--〈().05 ；。
[0047]圖3為西黃單層緩釋片各活性成分體外累積釋放度曲線；體現(xiàn)了本發(fā)明的西黃單層緩釋片中的麝香酮、醋酸辛酯及膽酸的體外釋放情況；
[0048]圖4為西黃雙層緩釋片各活性成分體外累積釋放度曲線；體現(xiàn)了本發(fā)明的西黃雙層緩釋片中的麝香酮、醋酸辛酯及膽酸的體外釋放情況。
圖5為液固壓縮技術(shù)路線示意圖；體現(xiàn)了本發(fā)明中液態(tài)活性成分粉末化的技術(shù)方案。
【具體實(shí)施方式】
[0049]本發(fā)明人經(jīng)過多年研究，開發(fā)出了一種中藥復(fù)方制劑西黃丸活性組分的提取工藝，在經(jīng)該工藝提取獲得西黃緩釋片活性組分中加入特定比例的藥用輔料即可制得本發(fā)明的西黃單層或雙層緩釋片劑。
[0050]如本發(fā)明所 用，西黃丸是一種治療癰疽疔毒、瘰疬、流注、癌腫的中藥復(fù)方制劑，由下述重量配比的原料制成:
[0051]牛黃15份磨香15份
[0052]乳香(醋制)550份沒藥(醋制)550份
[0053]以上組成中，藥物的重量是以生藥計(jì)算的，每一份可以是Ig或1kg，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，以上組成是按重量作為配比的，在實(shí)際生產(chǎn)時(shí)可按照相應(yīng)比例增大或減少，但各組成間的生藥材重量配比的比例不變。
[0054]具體而言，本發(fā)明的新工藝包括以下步驟:
[0055]步驟一，將上述配方量的乳香和沒藥分別低溫粉碎，過24目篩混合，將混合物裝入超臨界萃取罐中，在壓力35MPa，溫度45°C，萃取3h，提取收率在5%~8%之間，可制得乳香沒藥超臨界萃取物55~88份，備用；
[0056]步驟二，將牛黃粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得牛黃粉末15份，備用；
[0057]步驟三，將麝香粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得麝香粉末15份，備用。
[0058]上述活性組分進(jìn)而可用于制備本發(fā)明的西黃單層和雙層緩釋片。
[0059]在用本發(fā)明新工藝提取的西黃活性組分中，乳香沒藥超臨界萃取物為油狀液體，且用量大，若要制備成片劑，就必須先將其固態(tài)化，方能保證西黃活性成分的完全釋放。故而本發(fā)明人采用了液固壓縮技術(shù)，將乳香沒藥超臨界萃取物溶解在表面活性劑中，通過藥物與表面活性劑的接觸，改善其潤濕性，增加藥物溶出的有效表面，提高藥物的溶出速率。同時(shí)選用吸附性極強(qiáng)的載體材料將其吸附固化，使液態(tài)的活性成分轉(zhuǎn)變成易于處理的粉末(見圖5)。
[0060]
[0061]進(jìn)而，本發(fā)明提供了一種西黃單層緩釋片，它由下述重量比的成分制成:[0062]上述西黃緩釋片活性組分中的乳香沒藥超臨界萃取物55~88份；
[0063]上述西黃緩釋片活性組分中的牛黃粉末15份；
[0064]上述西黃緩釋片活性組分中的麝香粉末15份；
[0065]表面活性劑30~80份，所述表面活性劑選自Kolliphor HS、Kolliphor EL、Kolliphor TPGS、吐溫-80或二甲亞砜中的一種和多種；所述表面活性劑的優(yōu)選用量為50~60份，優(yōu)選使用Kolliphor HS ；
[0066]吸附固化劑30~100份，所述吸附固化劑選自AEROPERL* 300pharm、Aerosil妒200pharma、二氧化硅或Kollidon CL-SF中的一種和多種；所述吸附固化劑的優(yōu)選用量為50 ~80 份，優(yōu)選使用 AEROPERL+# 300pharm ；
[0067]骨架材料35~80份，所述骨架材料選自羥丙甲基纖維素、羥丙甲基纖維素與乙基纖維素1:1或2:1混合物或羥丙甲基纖維素與Kollidon SR3:1混合物中的一種和多種；所述骨架材料的優(yōu)選用量為50~70份，優(yōu)選使用羥丙甲基纖維素K4M ；
[0068]填充劑150~300份，所述填充劑選自微晶纖維素、乳糖、可壓性淀粉或速流甘露醇中的一種和多種，所述填充劑的優(yōu)選用量為200~250份，優(yōu)選使用微晶纖維素和乳糖。
[0069]本發(fā)明的 西黃單層緩釋片可用本領(lǐng)域的常規(guī)方法制得，即按上述配方量將表面活性劑與乳香沒藥超臨界萃取物混合均勻，加入到攪拌狀態(tài)中的吸附固化劑中，攪拌至乳香沒藥超臨界萃取物全部被吸收，再依次加入骨架材料、填充劑、麝香粉末、牛黃粉末，等量遞增混勻，壓片即得。
[0070]本發(fā)明還提供了一種西黃雙層緩釋片，它包括緩釋層A和緩釋層B，所述緩釋層A由下述重量比的成分制成:
[0071]上述西黃緩釋片活性組分中的乳香沒藥超臨界萃取物55~88份；
[0072]上述西黃緩釋片活性組分中的麝香粉末15份；
[0073]表面活性劑30~60份，所述表面活性劑選自Kolliphor HS、Kolliphor EL、Kolliphor TPGS、吐溫-80或二甲亞砜中的一種和多種；所述表面活性劑的優(yōu)選用量為40~50份，優(yōu)選使用Kolliphor HS ；
[0074]吸附固化劑30~100份，所述吸附固化劑選自AEROPERL? 300pharm、Aerosil?200pharma、二氧化硅或Kollidon CL-SF中的一種和多種；所述吸附固化劑的優(yōu)選用量為58 ~80 份，優(yōu)選使用 AEROPERL" 300pharm ；
[0075]骨架材料10~30份，所述骨架材料選自羥丙甲基纖維素、羥丙甲基纖維素與乙基纖維素1:1或2:1混合物或羥丙甲基纖維素與Kollidon SR3:1混合物中的一種和多種；所述骨架材料的優(yōu)選用量為14~22份，優(yōu)選使用羥丙甲基纖維素K4M ；
[0076]填充劑120~250份，所述填充劑選自微晶纖維素、乳糖、可壓性淀粉或速流甘露醇中的一種和多種；所述填充劑的優(yōu)選用量為160~200份，優(yōu)選使用微晶纖維素和乳糖；
[0077]所述緩釋層B由下述重量比的成分制成:
[0078]上述西黃緩釋片活性組分中的牛黃粉末15份；
[0079]骨架材料10~27份，所述骨架材料選自羥丙甲基纖維素、羥丙甲基纖維素與乙基纖維素1:1或2:1混合物或羥丙甲基纖維素與Kollidon SR3:1混合物中的一種和多種；所述骨架材料的優(yōu)選用量為15~23份，優(yōu)選使用羥丙甲基纖維素K4M與K15M4:1混合物；[0080]填充劑100~200份，所述填充劑選自微晶纖維素、乳糖、可壓性淀粉或速流甘露醇中的一種和多種；所述填充劑的優(yōu)選用量為140~160份，優(yōu)選使用微晶纖維素和乳糖。
[0081]本發(fā)明的西黃雙層緩釋片亦可用本領(lǐng)域的常規(guī)方法制備，其包括如下步驟:
[0082]步驟一，按配方量將表面活性劑與乳香沒藥的超臨界提取物混合均勻，加入到攪拌狀態(tài)中的吸附固化劑中，攪拌至乳香沒藥超臨界提取物全部被吸收，再依次加入骨架材料、填充劑、麝香粉末，等量遞增混勻；
[0083]步驟二，按配方量將牛黃粉末與骨架材料、填充劑等量遞增混勻；
[0084]步驟三，分別取兩層粉末，壓片，即得。
[0085]經(jīng)本發(fā)明人研究證實(shí):在本發(fā)明的單層緩釋片中，西黃丸處方中三種活性成分，即麝香中的麝香酮、牛黃中的膽酸以及乳香沒藥超臨界提取物中的醋酸辛酯等均得以緩慢釋放；而在本發(fā)明的雙層緩釋片的原料藥中，上述三種活性成分中的麝香酮、醋酸辛酯幾乎不溶，相對而言，牛黃中的膽酸溶解度稍大，根據(jù)活性成分溶解度的差異，選擇本發(fā)明的雙層緩釋片，亦可產(chǎn)生令上述三種活性成分在體外同步緩釋的效果。
[0086]由此可見，本發(fā)明的西黃緩釋片劑較之普通西黃丸劑，能有效控制處方中有效成分的釋放速率，提高了藥物釋放的規(guī)律性，從而達(dá)到穩(wěn)定的血藥濃度，有利于藥物療效的充分發(fā)揮，從而延長和提高了療效。
[0087]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分?jǐn)?shù)、比率、比例、或份數(shù)按重量計(jì)。
[0088]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0089]本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本專利說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
[0090]實(shí)施例1西黃緩釋片活性組分A的制備
[0091]處方:牛黃15g麝香15g乳香(醋制)550g沒藥(醋制)550g
[0092]制備方法:將乳香和沒藥分別-20°C條件下低溫粉碎，過24目篩，按1:1混合均勻，放入超臨界萃取罐內(nèi)，以壓力為35MPa，溫度為45 °C的條件下，萃取3h，提取物收率為5%，得乳香沒藥超臨界萃取物55份，備用；
[0093]將牛黃粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得牛黃粉末15份，備用；
[0094]將麝香粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得麝香粉末15份，備用。
[0095]實(shí)施例2西黃緩釋片活性組分B的制備
[0096]處方:牛黃15g麝香15g乳香(醋制)550g沒藥(醋制)550g [0097]制備方法:將乳香和沒藥分別-20°C條件下低溫粉碎，過24目篩，按1:1混合均勻，放入超臨界萃取罐內(nèi)，以壓力為35MPa，溫度為45 °C的條件下，萃取3h，提取物收率為
5.8%，得乳香沒藥超臨界萃取物64份，備用；
[0098]將牛黃粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得牛黃粉末15份，備用；[0099]將麝香粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得麝香粉末15份，備用。
[0100]實(shí)施例3西黃緩釋片活性組分C的制備
[0101]處方:牛黃15g麝香15g乳香(醋制)550g沒藥(醋制)550g
[0102]制備方法:將乳香和沒藥分別-20°C條件下低溫粉碎，按1:1混合均勻，放入超臨界萃取罐內(nèi)，以壓力為35MPa，溫度為45°C的條件下，萃取3h，提取物收率為6.4%，得乳香沒藥超臨界萃取物70份，備用；
[0103]將牛黃粉碎成細(xì)粉，過60目 篩，得牛黃粉末15份，備用；
[0104]將麝香粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得麝香粉末15份，備用。
[0105]實(shí)施例4西黃緩釋片活性組分D的制備
[0106]處方:牛黃15g麝香15g乳香(醋制)550g沒藥(醋制)550g
[0107]制備方法:將乳香和沒藥分別-20°C條件下低溫粉碎，按1:1混合均勻，放入超臨界萃取罐內(nèi)，以壓力為35MPa，溫度為45°C的條件下，萃取3h，提取物收率為7.3%，得乳香沒藥超臨界萃取物80份，備用；
[0108]將牛黃粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得牛黃粉末15份，備用；
[0109]將麝香粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得麝香粉末15份，備用。
[0110]實(shí)施例5西黃緩釋片活性組分E的制備
[0111]處方:牛黃15g麝香15g乳香(醋制)550g沒藥(醋制)550g
[0112]制備方法:將乳香和沒藥分別-20°C條件下低溫粉碎，過24目篩，按1:1混合均勻，放入超臨界萃取罐內(nèi)，以壓力為35MPa，溫度為45 °C的條件下，萃取3h，提取物收率為8%，得乳香沒藥超臨界萃取物88份，備用；
[0113]將牛黃粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得牛黃粉末15份，備用；
[0114]將麝香粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得麝香粉末15份，備用。
[0115]實(shí)施例6在細(xì)胞水平上檢測本發(fā)明的西黃緩釋片活性組分A~E (按實(shí)施例1~5制備)對人原發(fā)性肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和H22荷瘤小鼠腫瘤的生長抑制作用。
[0116]6.1在細(xì)胞水平上檢測西黃緩釋片活性組分對人原發(fā)性肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的生長抑制作用
[0117]實(shí)驗(yàn)材料:
[0118]人原發(fā)性肝癌細(xì)胞株SMMC-7721由上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。細(xì)胞于含10%胎牛血清(Gibco)的RPM1-1640 (Gibco)培養(yǎng)基中，在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)。
[0119]Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供；其他試劑:MTT及DMSO等均為Sigma公司產(chǎn)品。
[0120]實(shí)驗(yàn)方法:
[0121]西黃緩釋片活性組分對人原發(fā)性肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的細(xì)胞毒性通過MTT法測得。具體步驟如下:
[0122]1.樣品制備:取西黃緩釋片活性組分(按提取得率計(jì)算，相當(dāng)于76mg生藥材)加200 μ L DMSO超聲20min，加預(yù)冷4°C的RPM1-1640培養(yǎng)液至4mL，浸泡24h后超聲20min，得到西黃緩釋片活性組分浸提液。實(shí)驗(yàn)時(shí)用RPM1-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度使用。同法設(shè)置西黃丸對照組。
[0123]2.取對數(shù)生長期的人原發(fā)性肝癌細(xì)胞株SMMC_7721，0.25%胰蛋白酶消化，用1640培養(yǎng)基稀釋成9 X 104/mL濃度的單細(xì)胞懸液，每孔100 μ L，接種到96孔板上，置37°C、5%C02飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12h。
[0124]3.待細(xì)胞貼壁后，空白對照組用等體積1640培養(yǎng)液代替受試藥物，藥物處理組分別加入不同濃度的西黃緩釋片活性組分浸提液、西黃丸浸提液，每個(gè)濃度設(shè)5復(fù)孔，每孔100 μ L。
[0125]4.將加藥細(xì)胞在37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中保溫48h。
[0126]5.每孔中加入10 μ L5mg/ml MTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫3~4h。
[0127]6.將細(xì)胞板于1000rpm離心15min，真空吸去培養(yǎng)液，加入150 μ L PBS洗滌后離心并小心地吸去溶液。
[0128]7.每孔加入150 μ I DMS0，置于搖床上以150rpm搖動(dòng)15分鐘，使生成的甲簪晶體充分溶解。以570nm為測定波長，630nm為參比波長，測定吸光度值。
[0129]8.根據(jù)吸光度值計(jì)算西黃方活性組分浸提液、西黃丸對肝癌細(xì)胞株SMMC7721的生長抑制率。
[0130]腫瘤細(xì)胞生長抑制率(％)=[(對照組平均OD值-給藥組測定的平均OD值)/對照組平均OD值]X 100%。
[0131]9.以藥物濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，細(xì)胞生長抑制率為縱坐標(biāo)，繪制西黃方活性組分、西黃丸對細(xì)胞 增殖的抑制作用圖，用Graphpad prism5.0軟件計(jì)算IC5tl值。
[0132]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0133]西黃緩釋片活性組分對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞生長抑制作用，見圖1。
[0134]由圖1可見，西黃丸、西黃緩釋片活性組分對人惡性腫瘤細(xì)胞株(SMMC-7721)增殖均有抑制作用，隨著藥物濃度的增加抑制率呈遞增趨勢。相對于西黃丸組來說，經(jīng)提取精制后的西黃緩釋片活性組分對SMMC7721細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用，在濃度為1.90mg.ml-1時(shí)抑制率有顯著差異(P < 0.05)，西黃緩釋片活性組分的IC5tl值為
1.890mg.ml-1,西黃丸的 IC50 值為 2.450mg.ml-1,小于西黃丸組(P < 0.05)。
[0135]6.2西黃緩釋片活性組分對Η22荷瘤小鼠腫瘤抑制作用
[0136]實(shí)驗(yàn)材料:
[0137]腫瘤株:肝癌Η22細(xì)胞株由上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。
[0138]動(dòng)物:昆明種小鼠，清潔級，體重18~22g，雌雄兼用，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證(SYXK [滬]2003-0029)。
[0139]實(shí)驗(yàn)方法:
[0140]1.取生長良好的腹水，臺盼蘭染色后計(jì)活細(xì)胞數(shù)，加入滅菌生理鹽水(約1:7稀釋)制備腫瘤細(xì)胞懸液(瘤細(xì)胞濃度約I X IO7個(gè)/ml)，0.15ml/只皮下注射接種于小鼠左前肢腋下制備實(shí)體瘤模型，0.2ml/只無菌條件下腹腔注射，制備腹水型模型。
[0141]2.接種24h后按體重后隨機(jī)分組，灌胃給藥，每天一次，觀察并記錄各組小鼠的體重變化情況和生存狀況。實(shí)體瘤模型小鼠連續(xù)用藥17d，第18d小鼠摘眼球取血放入肝素抗凝的試管中，血球分析儀測定血常規(guī),計(jì)算血液中白細(xì)胞總數(shù)、紅細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)。脫頸椎處死小鼠，取瘤塊、脾臟及胸腺，稱重，按下式分別計(jì)算腫瘤抑制率、臟器指數(shù)。
[0142]抑瘤率(％)=(模型對照組瘤重-給藥組瘤重)/模型對照組瘤重X 100%[0143]胸腺(脾)指數(shù)(mg/10g) =胸腺(脾)重量/小鼠重量XlO
[0144]3.腹水瘤模型測定生存時(shí)間:觀察各組小鼠的生存時(shí)間，以60d為限，生存時(shí)間超過60d按60d計(jì)，計(jì)算小鼠生命延長率。
[0145]生命延長率生存期=(給藥組生存時(shí)間一荷瘤對照組生存時(shí)間)/荷瘤對照組生存時(shí)間X 100%O
[0146]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0147]1.各組荷瘤小鼠體重及抑瘤率(結(jié)果見表1)
[0148]表1.各組荷瘤小鼠體重及抑瘤率的比較(i±s,n=W)
[0149]
【權(quán)利要求】
1.一種西黃緩釋片活性組分，其特征在于，它由下述重量份數(shù)的原料經(jīng)過下述步驟制得: 牛黃15份、磨香15份、乳香(醋制)550份、沒藥(醋制)550份； 步驟一，將乳香和沒藥分別低溫粉碎，過24目篩混合，將所得混合物裝入超臨界萃取罐中，在壓力35MPa，溫度45°C的條件下，萃取3h，，得乳香沒藥超臨界萃取物55~88份，備用； 步驟二，將牛黃粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得牛黃粉末15份，備用； 步驟三，將麝香粉碎成細(xì)粉，過60目篩，得麝香粉末15份，備用。
2.一種西黃單層緩釋片，其特征在于，它由下述重量比的成分制成: 如權(quán)利要求1所述的西黃緩釋片活性組分中的乳香沒藥超臨界萃取物55~88份； 如權(quán)利要求1所述的西黃緩釋片活性組分中的牛黃粉末15份； 如權(quán)利要求1所述的西黃緩釋片活性組分中的麝香粉末15份； 表面活性劑30~80份,所述表面活性劑選自Kolliphor HS>KoIliphor EL、KolIiphorTPGS、吐溫-80或二甲亞砜中的一種和多種； 吸附固化劑30~100份，所述吸附固化劑選自AEROPERL? 300pharm、Aerosil?200pharma、二氧化娃或 Kollidon CL-SF中的一種和多種； 骨架材料35~80份，所述骨架材料選自羥丙甲基纖維素、羥丙甲基纖維素與乙基纖維素1:1或2:1混合物或羥丙甲基纖維素與Kollidon SR3:1混合物中的一種和多種； 填充劑150~300份，所述填充劑選自微晶纖維素、乳糖、可壓性淀粉或速流甘露醇中的一種和多種。
3.如權(quán)利要求2所述的西黃單層緩釋片，其特征在于，所述表面活性劑的用量為50~60份。
4.如權(quán)利要求2所述的西黃單層緩釋片，其特征在于，所述吸附固化劑的用量為50~80份。
5.如權(quán)利要求2所述的西黃單層緩釋片，其特征在于，所述骨架材料的用量為50~70份。
6.如權(quán)利要求2所述的西黃單層緩釋片，其特征在于，所述填充劑的用量為200~250份。
7.如權(quán)利要求2所述的西黃單層緩釋片的制備方法，包括按配方量將表面活性劑與乳香沒藥超臨界萃取物混合均勻，加入到攪拌狀態(tài)中的吸附固化劑中，攪拌至乳香沒藥超臨界萃取物全部被吸收，再依次加入骨架材料、填充劑、麝香粉末、牛黃粉末，等量遞增混勻，壓片即得。
8.一種西黃雙層緩釋片，其特征在于，它包括緩釋層A和緩釋層B，所述緩釋層A由下述重量比的成分制成: 如權(quán)利要求1所述的西黃緩釋片活性組分中的乳香沒藥超臨界萃取物55~88份； 如權(quán)利要求1所述的西黃緩釋片活性組分中的麝香粉末15份； 表面活性劑30~60份,所述表面活性劑選自Kolliphor HS>KoIliphor EL、KolIiphorTPGS、吐溫-80或二甲亞砜中的一種和多種；吸附固化劑30~100份，所述吸附固化劑選自AEROPERL* 300pharm、Aerosil?200pharma、二氧化娃或Kollidon CL-SF中的一種和多種； 骨架材料10~30份，所述骨架材料選自羥丙甲基纖維素、羥丙甲基纖維素與乙基纖維素1:1或2:1混合物或羥丙甲基纖維素與Kollidon SR3:1混合物中的一種和多種； 填充劑120~250份，所述填充劑選自微晶纖維素、乳糖、可壓性淀粉或速流甘露醇中的一種和多種； 所述緩釋層B由下述重量比的成分制成: 如權(quán)利要求1所述的西黃緩釋片活性組分中的牛黃粉末15份； 骨架材料10~27份，所述骨架材料選自羥丙甲基纖維素、羥丙甲基纖維素與乙基纖維素1:1或2:1混合物或羥丙甲基纖維素與Kollidon SR3:1混合物中的一種和多種； 填充劑100~200份，所述填充劑選自微晶纖維素、乳糖、可壓性淀粉或速流甘露醇中的一種和多種。
9.如權(quán)利要 求8所述的西黃雙層緩釋片，其特征在于，所述緩釋層A中的表面活性劑的用量為40~50份。
10.如權(quán)利要求8所述的西黃雙層緩釋片，其特征在于，所述緩釋層A中的吸附固化劑的用量為58~80份。
11.如權(quán)利要求8所述的西黃雙層緩釋片，其特征在于，所述緩釋層A中的骨架材料的用量為14~22份。
12.如權(quán)利要求8所述的西黃雙層緩釋片，其特征在于，所述緩釋層A中的填充劑的用量為160~200份。
13.如權(quán)利要求8所述的西黃雙層緩釋片，其特征在于，所述緩釋層B中的骨架材料的用量為15~23份。
14.如權(quán)利要求8所述的西黃雙層緩釋片，其特征在于，所述緩釋層B中的填充劑的用量為140~160份。
15.如權(quán)利要求8所述的西黃雙層緩釋片的制備方法，包括如下步驟: 步驟一，按配方量將表面活性劑與乳香沒藥的超臨界提取物混合均勻，加入到攪拌狀態(tài)中的吸附固化劑中，攪拌至乳香沒藥超臨界提取物全部被吸收，再依次加入骨架材料、填充劑、麝香粉末，等量遞增混勻； 步驟二，按配方量將牛黃粉末與骨架材料、填充劑等量遞增混勻； 步驟三，分別取兩層粉末，壓片，即得。
【文檔編號】A61P35/00GK103977054SQ201410121163
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】馮年平, 王志, 葉貝妮, 趙繼會, 張永太, 劉穎, 朱春赟 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)