一種氧化釓靶向磁共振造影劑的制作方法
【專利摘要】一種氧化釓靶向磁共振造影劑，為葉酸修飾的聚乙二醇化的Gd2O3，表達(dá)為FA-PEG-Gd2O3，透射電鏡下顯示為近球形的粒狀；制備方法為：高溫還原法制備油酸包裹的三氧化二釓納米粒，乙酰丙酮釓在有機(jī)相中處理保證其均一性和高結(jié)晶度，通過和硅烷羧酸進(jìn)行配體交換，獲得高度水溶性三氧化二釓納米粒。然后硅烷的大量羧基進(jìn)一步和NH2-PEG-COOH與NH2-PEG-FA偶聯(lián)，得到用于腦膠質(zhì)瘤早期診斷的氧化釓靶向磁共振造影劑。
【專利說明】一種氧化釓靶向磁共振造影劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種氧化釓靶向磁共振造影劑。
[0002]本發(fā)明還涉及上述氧化釓靶向磁共振造影劑的制備方法。
[0003]本發(fā)明還涉及上述氧化釓靶向磁共振造影劑在腦膠質(zhì)瘤早期診斷中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0004]神經(jīng)膠質(zhì)瘤是人腦重大疾病，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，治療方式以聯(lián)合治療為主，但預(yù)后極差，生存率低。這是因?yàn)槠湮⑿〔≡畹脑缙谠\斷和邊界界定一直是世界性難題，膠質(zhì)瘤具有侵潤性生長，瘤體與周圍正常組織界限不清楚，造影劑不易穿過腦內(nèi)的血腦屏障(BBB)等的特點(diǎn)。 [0005]磁共振成像(MRI)是一種非侵害性的診斷方法，用于臨床醫(yī)學(xué)上評估人體解剖結(jié)構(gòu)、組織或器官的功能。MRI技術(shù)有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如高分辨率、無放射性輻射、長效成像等。但是用來監(jiān)測微小組織的病灶時，靈敏度并不高。通過采用順磁性小分子造影劑Gd-DTPA或者Gd-DOTA等可以幫助提高成像的靈敏度和對比度。這是因?yàn)樾》肿釉煊皠┛梢钥s短水質(zhì)子的縱向弛豫時間(T1)，使T1加權(quán)成像的圖像亮度提高。Gd-DTPA和Gd-DOTA等幾種小分子MRI造影劑已經(jīng)得到了美國食品和藥品管理局的批準(zhǔn)，并且被廣泛應(yīng)用在臨床腫瘤的診斷中。然而，這些小分子造影劑存在嚴(yán)重的問題，例如血液半衰期短、弛豫率低、對器官或組織缺少靶向特異性等。因此無法對微小病灶的早期腫瘤進(jìn)行診斷，這就限制了它們的應(yīng)用。為了克服上述缺點(diǎn)，MRI造影劑對膠質(zhì)瘤能夠進(jìn)行早期診斷，研究人員一直努力開發(fā)了含Gd的納米粒作為新型化合物造影劑。納米粒造影劑通過EPR效應(yīng)更易進(jìn)入腫瘤，并且能提供進(jìn)一步修飾的官能團(tuán)；同時，含釓納米粒比釓螯合物具有更低的毒性，因而具有廣闊的發(fā)展前景。NaGdF4、Gd203和GdC03等含釓納米粒已經(jīng)被報(bào)道對腫瘤造影有更好的效果。在這些納米粒中，以Gd203為核心的納米粒因其她豫率最聞而受到廣泛關(guān)注。禮基納米粒MRI造影劑顯示出前所未有的優(yōu)點(diǎn)，如對比度的增強(qiáng)、敏感度的提高、診斷成像時間的延長等。盡管釓基納米粒造影劑通過EPR效應(yīng)增加了腫瘤區(qū)域的攝入，但這種被動靶向?qū)е录{米粒的攝入是有限的。增強(qiáng)攝入的另一個方法是通過將靶向基團(tuán)如葉酸、抗體或小分子肽鏈接到造影劑上，這種靶向的造影劑能特異性地識別腫瘤組織表面的受體，從而增加納米粒在腫瘤區(qū)域的攝入，且增加在腫瘤的停留時間，特別適用于微小病灶和腫瘤邊界的診斷。但迄今為止，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道用靶體修飾的6(^03納米粒用于腦膠質(zhì)瘤的造影研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種氧化釓靶向磁共振造影劑。
[0007]本發(fā)明的又一目的在于提供一種制備上述氧化釓靶向磁共振造影劑的方法。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的氧化釓靶向磁共振造影劑，為葉酸修飾的聚乙二醇化的Gd203,表達(dá)為FA-PEG-Gd203，透射電鏡下顯示為近球形的粒狀；
[0009]通過下述方法得到:[0010]1)制備油酸包裹的Gd203:
[0011]將油酸和油胺按質(zhì)量比1: 1地溶于乙酰丙酮釓后加入芐醚內(nèi)，于80-100°C真空狀態(tài)下攪拌去除水分和空氣，然后充入氮?dú)?，溶液加熱?60-290°C ;反應(yīng)結(jié)束冷卻到室溫后，用乙醇沉淀，離心后收集沉淀得到油酸包裹的Gd203，分散到正己烷待用；
[0012]2)制備水溶性硅烷羧酸_Gd203納米粒:
[0013]油酸包裹的Gd203和乙酸加入到甲苯中混合后超聲，加入N-(三甲氧基硅丙基)乙二胺三乙酸鈉鹽水溶液于50-70°C下攪拌，收集并洗滌沉淀，將沉淀分散在水中，用纖維透析袋透析，冷凍干燥得到水溶性硅烷羧酸_Gd203納米粒，表達(dá)為TETT-Gd203粉末；
[0014]3)制備 FA-PEG-Gd203:
[0015]將TETT-Gd203分散到水中，加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基_3_ (3_ 二甲基氨丙基)_碳化二亞胺活化，加入NH2-PEG-FA，調(diào)節(jié)溶液的pH值7-8，室溫?cái)嚢韬蠹尤雗h2-peg-cooh以飽和剩余的羧基，室溫?cái)嚢?，反?yīng)液用纖維透析袋除去多余的反應(yīng)物，冷凍干燥后得到淡綠色FA-PEG-Gd203粉末。
[0016]所述的氧化釓靶向磁共振造影劑，其中，F(xiàn)A-PEG-Gd203透射電鏡下顯示為近球形6nm的納米粒，水合粒徑130 nm。
[0017]本發(fā)明的制備上述氧化釓靶向磁共振造影劑的方法:
[0018]1)制備油酸包裹的Gd203: [0019]將油酸和油胺按 質(zhì)量比1: 1地溶于乙酰丙酮釓后加入芐醚內(nèi)，于80-100°C真空狀態(tài)下攪拌去除水分和空氣，然后充入氮?dú)?，溶液加熱?60-290°C ;反應(yīng)結(jié)束冷卻到室溫后，用乙醇沉淀，離心后收集沉淀得到油酸包裹的Gd203，分散到正己烷待用；
[0020]2)制備水溶性硅烷羧酸_Gd203納米粒:
[0021]油酸包裹的Gd203和乙酸加入到甲苯中混合后超聲，加入N-(三甲氧基硅丙基)乙二胺三乙酸鈉鹽水溶液于50-70°C下攪拌，收集并洗滌沉淀，將沉淀分散在水中，用纖維透析袋透析，冷凍干燥得到水溶性硅烷羧酸_Gd203納米粒，表達(dá)為TETT-Gd203粉末；
[0022]3)制備 FA-PEG-Gd203:
[0023]將TETT-Gd203分散到水中，加入N-羥基琥珀酰亞胺和1_乙基_3_ (3_ 二甲基氨丙基)_碳化二亞胺活化，加入NH2-PEG-FA，調(diào)節(jié)溶液的pH值7-8，室溫?cái)嚢韬蠹尤雗h2-peg-cooh以飽和剩余的羧基，室溫?cái)嚢?，反?yīng)液用纖維透析袋除去多余的反應(yīng)物，冷凍干燥后得到FA-PEG-Gd203粉末。
[0024]所述的方法，其中，步驟1中各試劑的加入比例為:油酸和油胺的質(zhì)量比1: 1，乙酰丙酮釓為2mmol，芐醚為20mL。
[0025]所述的方法，其中，步驟2中各試劑的加入比例為:油酸包裹的Gd203為lOOmg，乙酸為60 μ L，甲苯為60mL，N-(三甲氧基硅丙基)乙二胺三乙酸鈉鹽水溶液為1.2mL，透析采用截留量為1000的纖維透析袋。
[0026]所述的方法，其中，步驟3中各試劑的加入比例為:TETT-Gd203為lOOmg分散到10mL水中，N-羥基琥珀酰亞胺為29mg，l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺為2311^，NH2-PEG-FA為150mg，NH2-PEG-C00H為60mg，透析采用截留量為3500的纖維透析袋。
[0027]本發(fā)明的氧化釓靶向磁共振造影劑，用于微小膠質(zhì)瘤的對比增強(qiáng)及邊界確定。PEG用來增加納米粒在血液中的循環(huán)時間和水分散性。獲得的目標(biāo)造影劑FA-PEG-Gd203納米粒，通過投射電鏡(TEM)、傅里葉紅外變換光譜(FTIR)，X射線衍射光譜(XRD)以及電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)進(jìn)行表征。結(jié)果表明，Gd203核的粒徑約在2至4nm之間，且具有高度結(jié)晶性。目標(biāo)造影劑FA-PEG-Gd203具有高度水分散性和穩(wěn)定性。制備的FA-PEG-Gd203弛豫性能為4.48，高于臨床上使用的Gd離子螯合物。造影劑在體內(nèi)外的毒性評估表明FA-PEG-Gd203納米粒具有良好的生物相容。表明FA-PEG-Gd203可用于腦膠質(zhì)瘤MRI的祀向造影劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1 是本發(fā)明中⑷ 0A-Gd203，⑶ TETT_Gd203，(C) PEG_Gd203 和(D) FA-PEG_Gd203 納米粒的TEM圖像。插圖是0A-Gd203納米粒的HRTEM。
[0029]圖2是本發(fā)明中合成后和加熱到600°C處理后的納米粒干粉0A-Gd203的XRD (X光衍射圖譜)
[0030]圖3是本發(fā)明中氧化釓靶向磁共振造影劑傅里葉紅外(FTIR)譜圖。
[0031]圖4是本發(fā)明中氧化釓靶向磁共振造影劑弛豫率rl和Gd-DTPA，PEG_Gd203以及FA-PEG-Gd203 的 T1 加權(quán)像。
[0032]圖5是本發(fā)明中氧化釓靶向磁共振造影劑尾靜脈注射15分鐘，120分鐘和24小時后，各時段C6膠質(zhì)瘤模型鼠的核磁圖像。 [0033]圖6是本發(fā)明中氧化釓靶向磁共振造影劑與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培育24小時后，CCK-8法確定C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率。
[0034]圖7是本發(fā)明中氧化釓靶向磁共振造影劑尾靜脈注射納米粒30天后，分別取心、肝、脾、肺、腎和腦。行HE染色組織切片。分為PEG-Gd203和FA-PEG-Gd203納米粒組。
【具體實(shí)施方式】
[0035]以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。以下說明中所出現(xiàn)的縮略語分別為:
[0036]EDC(l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺；
[0037]NHS (N-hydroxysuccinimide) N-羥基玻拍酸亞胺；
[0038]FA (Folic acid)葉酸；
[0039]HE (Haematoxy 1 in Eosin)蘇木素-伊紅；
[0040]DMEM/F12 (Dulbeco，s modified agle’s medium/F12)改良的 Eagle/F12 培養(yǎng)基；
[0041]CCK-8kit(Cell counting kit-8) CCK-8 細(xì)胞增殖 / 毒性檢測試劑盒；
[0042]XRD (X-ray diffraction) X 線衍射分析；
[0043]Tlffl (T1 weight image) ΤΙ 加權(quán)成像;
[0044]PEG (Polyethylene glycol)聚乙二醇；
[0045]ICP-AES(Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy)電感率禹合等離子體原子發(fā)射光譜法；
[0046]0A (Oleic acid)油酸；
[0047]TETT(N-(trimethoxysilypropyl)ethylene diamine triacetic acid,trisodiumsalt (45% in water) )N_(三甲氧基娃丙基)乙二胺三乙酸鈉鹽水溶液；
[0048]EPR (Enhanced permeability and retention effect)增強(qiáng)透過性與保留效應(yīng)；
[0049]HRTEM (High Resolution Transmission Electron Microscopy)高分辨率透射電子顯微鏡；
[0050]MRI (Magnetic Resonance Imaging)磁共振成像。
[0051]本發(fā)明首先采用葉酸共價偶聯(lián)到氧化釓磁共振造影劑上，首先，油酸包裹的三氧化二釓納米粒由高溫還原法制備，乙酰丙酮釓在有機(jī)相中處理保證其均一性和高結(jié)晶度，通過和硅烷羧酸進(jìn)行配體交換，獲得高度水溶性三氧化二釓納米粒。然后硅烷的大量羧基進(jìn)一步和 NH2-PEG-C00H(PolyethyleneGlycol)和 NH2_PEG_FA (葉酸偶聯(lián)的 PEG)偶聯(lián)，獲得葉酸偶聯(lián)PEG化的MRI靶向造影劑。
[0052]具體地，本發(fā)明的氧化釓靶向磁共振造影劑，可以通過下述方法得到:
[0053]1)制備油酸包裹的Gd203:
[0054]1.6g的油酸，1.6g的油胺和2mmol乙酰丙酮禮加入20mL節(jié)醚內(nèi)，然后抽取空氣，并在100°C真空狀態(tài)下攪拌lh，以去除水分和空氣。然后，充入氮?dú)?，溶液加熱?90°C并維持2.5h。反應(yīng)結(jié)束冷卻到室溫后，油酸包裹的Gd203用20mL乙醇沉淀，離心后收集沉淀，沉淀用乙醇洗滌三遍，分散到10mL正己烷待用。
[0055]2)制備水溶性TETT-Gd203納米粒:
[0056]lOOmg油酸包裹的Gd203和60 μ L乙酸加入到60mL甲苯，混合后超聲30分鐘，然后加入1.2mL的TETT，在70`°C下混合物攪拌48h。在此期間，混合物中出現(xiàn)了沉淀。沉淀為TETT-Gd203，收集后用甲苯和甲醇洗滌三遍來純化。純化后的沉淀分散在水中，使用截留量為1000的纖維透析袋，去離子水透析24h。冷凍干燥得到白色TETT-Gd203粉末。
[0057]3)制備 FA-PEG-Gd203 粉末:
[0058]將lOOmg的TETT_Gd203分散到10mL去離子水中，加入29mg的NHS和23mg的EDC活化半小時，再加入60mg的NH2-PEG-FA，調(diào)節(jié)溶液的pH值到8.0，室溫?cái)嚢?5分鐘后，然后加入150mg的NH2-PEG-C00H以飽和剩余的羧基，室溫?cái)嚢?4h。反應(yīng)液使用截留量為3500的纖維透析袋，去離子水透析24h除去多余的反應(yīng)物。冷凍干燥后得到淡綠色FA-PEG-Gd203粉末。
[0059]通過上述制備的氧化釓靶向磁共振造影劑中，F(xiàn)A-PEG_Gd203透射電鏡下顯示為近球形6nm左右的納米粒，水合粒徑130nm。
[0060]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明。
[0061]實(shí)施例1
[0062]1)油酸包裹的Gd203的合成
[0063]油酸包裹的Gd203的合成按公知的高溫還原法制備，其方法做了少許改動。1.6g的油酸，1.6g的油胺和2mmol乙酰丙酮釓加入20mL芐醚內(nèi)，然后抽取空氣，并在100°C真空狀態(tài)下攪拌lh，以去除水分和空氣。然后，充入氮?dú)?，溶液加熱?90°C并維持2.5h。反應(yīng)結(jié)束冷卻到室溫后，油酸包裹的Gd203用20mL乙醇沉淀，離心后收集沉淀，沉淀用乙醇洗滌三遍，分散到10mL正己烷待用。
[0064]2)水溶性TETT-Gd203納米粒的制備
[0065]水溶性TETT-Gd203納米粒通過配體交換法制備。lOOmg油酸包裹的Gd203和60 μ L乙酸加入到60mL甲苯，混合后超聲30分鐘，然后加入1.2mL的TETT，在70°C混合物攪拌48h。在此期間，混合物中出現(xiàn)了沉淀。沉淀為TETT-Gd203，收集后用甲苯和甲醇洗滌三遍來純化。純化后的沉淀分散在水中，使用截留量為1000的纖維透析袋，去離子水透析24h。冷凍干燥得到白色TETT-Gd203粉末。
[0066]3) PEG 化 Gd203 的合成
[0067]將lOOmg的TETT_Gd203分散到10mL去離子水中，加入29mg的NHS和23mg的EDC活化半小時，加入210mg的NH2-PEG-C00H，調(diào)節(jié)溶液的pH值到8.0，室溫?cái)嚢?4h。反應(yīng)液使用截留量為3500的纖維透析袋，去離子水透析24h除去多余的反應(yīng)物。冷凍干燥得到白色PEG-Gd203粉末作為實(shí)驗(yàn)對照樣品。
[0068]3) FA 修飾的 PEG-Gd203 的合成
[0069]另將lOOmg的TETT_Gd203分散到10mL去離子水中，加入29mg的NHS和23mg的EDC活化半小時，再加入60mg的NH2-PEG-FA，調(diào)節(jié)溶液的pH值到8.0，室溫?cái)嚢?5分鐘后，然后加入150mg的NH2-PEG-C00H以飽和剩余的羧基，室溫?cái)嚢?4h。反應(yīng)液使用截留量為3500的纖維透析袋，去離子水透析24h除去多余的反應(yīng)物。冷凍干燥得到淡綠色FA-PEG-Gd203粉末。
[0070]本發(fā)明制備的用于腦膠質(zhì)瘤早期診斷的氧化釓靶向磁共振造影劑透射電鏡，X射線衍射，傅里葉紅外的表征見圖1、2、3。
[0071]從圖1中可以看出，通 過乙酰丙酮釓在芐醚內(nèi)290°C高溫分解，獲得油酸包裹的Gd203(0A-Gd203)，其納米粒理化性質(zhì)包括大小、形狀和表面性質(zhì)可控制和可以重復(fù)生成獲得。高分辨率透射電子顯微鏡(HRTEM)圖像顯示出剛剛合成0A-Gd203納米粒的形態(tài)是近球形，其大小直徑估計(jì)平均2到3nm,大小分布均勻。明確的晶格條紋進(jìn)一步證實(shí)了 0A_Gd203納米粒的高結(jié)晶度。此外，晶格條紋邊緣之間的距離測量是0.33nm，對應(yīng)于(222)晶格面Gd203的立方相。高度分散水溶性Gd203納米粒通過配體交換法替換油酸和羧基化硅烷獲得。然后，NH2-PEG2000-FA 和 NH2-PEG2000-C00H 先后連接到 TETT-Gd203 上，通過 EDC/NHS 偶聯(lián)技術(shù)分別產(chǎn)生出PEG-Gd203和FA-PEG-Gd203納米粒。PEG進(jìn)一步幫助增加納米粒水分散性，同時作為膠質(zhì)瘤靶向配體葉酸的隔離區(qū)。盡管TETT-Gd203，PEG_Gd203和FA-PEG_Gd203納米粒比0A-Gd203顯示出更大顆粒度，但這些納米粒是高度分散，即使在高濃度QOmg.mL—1)溶液中，在水溶液中保持穩(wěn)定至少2個月。
[0072]從圖4中可以看出，0A-Gd203納米粒在600°C加熱3個小時后，XRD檢測其晶型。所有的衍射峰根據(jù)聯(lián)合委員會對粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)(JCPDS)卡第11-0604和立方Gd203結(jié)晶相匹配。
[0073]從圖3中可以看出，F(xiàn)A與Gd203成功偶聯(lián)。
[0074]實(shí)施例2
[0075]納米粒的弛豫率測試結(jié)果
[0076]將實(shí)施例1 中制備所得 PEG-Gd203、FA-PEG_Gd203 在 7TMRI 上對 FA-PEG_Gd203 納米粒作為一個潛在的磁共振造影增強(qiáng)劑的性能進(jìn)行了評價。使用市售的造影劑馬根維顯(Gd-DTPA)作為對照。弛豫率(rl)取自1/T1弛豫時間(s—1)與Gd離子濃度(mM)曲線的斜率。如圖4所示，和Gd-DTPA納米粒rl的值分別被估計(jì)為8.33mM_1s^\4.48mM_1s_1和
4.ΟΙι?Μ?。顯然，PEG-Gd203、FA-PEG_Gd203 比 Gd-DTPA 顯示出較高弛豫率 rl。[0077] 實(shí)施例3
[0078]納米粒的體內(nèi)成像測試
[0079]將實(shí)施例1中制備所得PEG-Gd203、FA-PEG-Gd203納米粒用作陽性造影劑對腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤做MRI研究。如圖5顯示靜脈注射PEG-Gd203和FA-PEG_Gd203納米粒在7T核磁記錄鼠膠質(zhì)瘤T1加權(quán)像，分別為磁共振影像記錄之前和15分鐘，120分鐘和24小時后。各尾靜脈注射的化合物內(nèi)含有為等劑量的Gd離子(0.lmEKg—1)。這個PEG-Gd203納米粒相比造影劑注射前，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤區(qū)域表現(xiàn)出輕微的對比度增強(qiáng)，這表明PEG化幫助Gd203納米粒積聚在膠質(zhì)瘤區(qū)域，原因可能由于長時間循環(huán)時間和EPR效應(yīng)。對于FA-PEG-Gd203，甚至注射24h后在神經(jīng)膠質(zhì)瘤區(qū)域觀察到明顯的對比度增強(qiáng)。此外，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的邊緣更為清楚，大幅度有利于準(zhǔn)確的術(shù)前診斷、術(shù)中神經(jīng)膠質(zhì)瘤的圈定。這有可能由于FA通過特定和選擇性與膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面的受體結(jié)合而粘附到其表面，偶聯(lián)到PEG-Gd203的FA可以促進(jìn)更多納米粒積累和保留在腫瘤部位，它增強(qiáng)的對比效果持續(xù)了很長時間，至少24小時。
[0080]實(shí)施例4
[0081]納米粒體外毒性評估:
[0082]1)細(xì)胞培養(yǎng):C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素)，在37°C含5% C02的保濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
[0083]2)細(xì)胞毒性:將C6細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種1 X 104個細(xì)胞/孔于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，37°C，5% C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。加入含10%血清培養(yǎng)基配制的實(shí)施例1中制備的PEG-Gd203、FA-PEG-Gd203納米粒懸浮液，終濃度分別Gd3+濃度為5 μ g.mL'2.5 μ g.mL'USyg.mL—1，每組6復(fù)孔。同等條件下將細(xì)胞分別培養(yǎng)24h。棄上清，每孔加含CCK-8 (100 μ L.ml/1)無血清培養(yǎng)基溶液100 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)lh。震蕩搖勻lmin，在450nm下測定吸光度值，進(jìn)行計(jì)算所得細(xì)胞生存率見圖6。
[0084]從圖6所示為不同濃度造影劑(PEG-Gd203以及FA-PEG_Gd203)對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞相對存活率的影響。顯而易見，細(xì)胞毒性隨著Gd濃度升聞而升聞。但是即使在最聞的Gd濃度下，兩種造影劑作用下細(xì)胞存活率仍然大于80%。但隨著濃度升高，造影劑FA-PEG-Gd203的毒性比PEG-Gd203的毒性略高。綜上所述，PEG-Gd203以及FA-PEG_Gd203)并沒有對C6細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒性。
[0085]實(shí)施例5
[0086]納米粒體內(nèi)毒性評價
[0087]健康清潔級ICR小白鼠12只，體重20.08±2g，6至8周齡，購自首都醫(yī)科大學(xué)動物室，性別雄性，室溫維持在22~25 °C、濕度保持40%~50%，標(biāo)準(zhǔn)飼料和水均經(jīng)高壓滅菌。12只小白鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對照組。每組各6小鼠。實(shí)驗(yàn)組:尾靜脈注射PEG-Gd203納米粒子，給予Gd3+濃度為0.2mmol.kg—1的劑量；對照組:尾靜脈注射生理鹽水。為進(jìn)行組織學(xué)分析，兩組小鼠飼養(yǎng)30天后被解剖，器官(腦、心臟、脾、肝、肺及腎)按照對照組和實(shí)驗(yàn)組分組，并且浸泡在4%中性福爾馬林中24小時以上，然后將收集起來的器官封藏在石蠟中，切片4μπι厚，同樣使用Η&Ε染料染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片。
[0088]從圖7所示沒有觀察到與Gd203納米粒子的處理有關(guān)的組織損傷以及任何其他不利影響。實(shí)驗(yàn)組小鼠的器官結(jié)構(gòu)如對照組中小鼠器官結(jié)構(gòu)一樣正常?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，可以說明納米粒子具備較高的生物相容性并且有望在生物醫(yī)學(xué)方面得到更多的應(yīng)用。
【權(quán)利要求】
1.一種氧化釓靶向磁共振造影劑，為葉酸修飾的聚乙二醇化的Gd203，表達(dá)為FA-PEG-Gd203,透射電鏡下顯示為近球形的粒狀；通過下述方法得到:1)制備油酸包裹的Gd203: 將油酸和油胺按質(zhì)量比1: 1地溶于乙酰丙酮釓后加入芐醚內(nèi)，于80-100°C真空狀態(tài)下攪拌去除水分和空氣，然后充入氮?dú)?，溶液加熱?60-290°C ;反應(yīng)結(jié)束冷卻到室溫后，用乙醇沉淀，離心后收集沉淀得到油酸包裹的Gd203，分散到正己烷待用；2)制備水溶性硅烷羧酸_Gd203納米粒:油酸包裹的Gd203和乙酸加入到甲苯中混合后超聲，加入N-(三甲氧基硅丙基)乙二胺三乙酸鈉鹽水溶液于50-70°C下攪拌，收集并洗滌沉淀，將沉淀分散在水中，用纖維透析袋透析，冷凍干燥得到水溶性硅烷羧酸_Gd203納米粒，表達(dá)為TETT-Gd203粉末；3)制備FA-PEG-Gd203:將TETT-Gd203分散到水中，加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺活化，加入NH2-PEG-FA，調(diào)節(jié)溶液的pH值7-8，室溫?cái)嚢韬蠹尤隢H2-PEG-COOH以飽和剩余的羧基，室溫?cái)嚢?，反?yīng)液用纖維透析袋除去多余的反應(yīng)物，冷凍干燥后得到FA-PEG-Gd203粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化釓靶向磁共振造影劑，其中，F(xiàn)A-PEG-Gd203透射電鏡下顯示為近球形6nm的納米粒，水合粒徑130nm。
3.制備權(quán)利要求1所述氧化釓靶向磁共振造影劑的方法:1)制備油酸包裹的Gd203:將油酸和油胺按質(zhì)量比1: 1地溶于乙酰丙酮釓后加入芐醚內(nèi)，于80-100°C真空狀態(tài)下攪拌去除水分和空氣，然后充入氮?dú)?，溶液加熱?60-290°C ;反應(yīng)結(jié)束冷卻到室溫后，用乙醇沉淀，離心后收集沉淀得到油酸包裹的Gd203，分散到正己烷待用；2)制備水溶性硅烷羧酸_Gd203納米粒:油酸包裹的Gd203和乙酸加入到甲苯中混合后超聲，加入N-(三甲氧基硅丙基)乙二胺三乙酸鈉鹽水溶液于50-70°C下攪拌，收集并洗滌沉淀，將沉淀分散在水中，用纖維透析袋透析，冷凍干燥得到水溶性硅烷羧酸_Gd203納米粒，表達(dá)為TETT-Gd203粉末；3)制備FA-PEG-Gd203:將TETT-Gd203分散到水中，加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺活化，加入NH2-PEG-FA，調(diào)節(jié)溶液的pH值7-8，室溫?cái)嚢韬蠹尤隢H2-PEG-COOH以飽和剩余的羧基，室溫?cái)嚢?，反?yīng)液用纖維透析袋除去多余的反應(yīng)物，冷凍干燥后得到FA-PEG-Gd203粉末。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，步驟1中各試劑的加入比例為:油酸和油胺的質(zhì)量比1: 1，乙酰丙酮釓為2mmol，芐醚為20mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，步驟2中各試劑的加入比例為:油酸包裹的Gd203為lOOmg,乙酸為60 μ L,甲苯為60mL, N_(三甲氧基娃丙基)乙二胺三乙酸鈉鹽水溶液為1.2mL，透析采用截留量為1000的纖維透析袋。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，步驟3中各試劑的加入比例為:TETT-Gd203為lOOmg分散到10mL水中，N-羥基琥珀酰亞胺為29mg，1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺為23mg，NH2-PEG-FA為150mg，NH2-PEG-COOH為60mg，透析采用截留量為3500的纖維透析袋。
7.權(quán) 利要求1所述的氧化釓靶向磁共振造影劑用于腦膠質(zhì)瘤早期診斷。
【文檔編號】A61K49/18GK103638532SQ201310625257
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】徐群淵, 葉玲, 王昊, 李帥, 肖寧 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)