一種絡(luò)新婦屬蜘蛛有效部位的制備及抗革蘭氏菌醫(yī)藥用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種絡(luò)新婦屬蜘蛛有效部位的制備及抗革蘭氏菌醫(yī)藥用途。具體而言，該有效部位由粉碎或未粉碎的蜘蛛目絡(luò)新婦亞科絡(luò)新婦屬（genus?Nephila）蟲體用溶劑提取、濃縮提取回收溶劑、大孔吸附樹脂柱層析、水洗、醇水溶液梯度洗脫方法純化，再經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥而得到的有效部位。該絡(luò)新婦屬蜘蛛有效部位具有明顯的抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌活性，可制備成水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑形式，用于制備防治人及禽畜患革蘭氏菌感染疾病的藥物、日化用品以及醫(yī)療器械、藥用輔料、外傷敷料或飼料添加劑。
【專利說明】一種絡(luò)新婦屬蜘蛛有效部位的制備及抗革蘭氏菌醫(yī)藥用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，本發(fā)明涉及一種具有防治細(xì)菌感染性疾病功能的絡(luò)新婦屬蜘蛛有效部位及其制備方法和醫(yī)藥用途。該有效部位主要含多肽類活性物質(zhì)，可制備成水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑等形式，用于制備治療人及禽畜防治革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌感染相關(guān)疾病的藥物、日化用品以及醫(yī)療器械、藥用輔料、外傷敷料或飼料添加劑。
【背景技術(shù)】
[0002]自然界存在大量細(xì)菌。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,簡稱“金葡菌”)是格蘭氏陽性球菌，是一種最常見且是對人體健康影響極大的致病菌種，引起人的主要感染有癤子、膿皰、毒性表皮腐解、肺炎、骨髓炎、急性心肌炎、乳腺炎、膀胱炎、前列腺炎、菌血癥、中毒性休克綜合癥、淋巴結(jié)炎、咽炎、子宮頸炎、盆腔炎，以及肌肉、皮膚、尿殖道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膿腫?？辜谆髁值慕瘘S色葡萄球菌(MRSA)是20世紀(jì)80年代開始出現(xiàn)的耐藥菌株，它是醫(yī)院內(nèi)和臨床上微生物流行病的主要病源。鏈球菌(Streptococcus species)是成鏈狀排列、兼性厭氧的格蘭氏陽性桿菌。醫(yī)學(xué)上常見的致病性鏈球菌大部分屬于β溶血型，它們存在于人的皮膚、呼吸道、消化道以及尿殖道的黏膜上，能夠引起皮膚、呼吸道以及軟組織感染如肺炎、菌血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、泌尿道炎癥以及關(guān)節(jié)炎等疾病。
[0003]大腸桿菌(或稱大腸 埃希氏桿菌)是中等大小桿菌，革蘭氏染色陰性，其大小為(1-3)微米X (0.5-0.7)微米，有鞭毛、無芽胞，有的菌株可形成莢膜，需氧或兼性厭氧，生化反應(yīng)活潑、易于在普通培養(yǎng)上增殖，適應(yīng)性強(qiáng)。該菌對一般消毒劑敏感，但對抗生素及磺胺類藥等極易產(chǎn)生耐藥性。大腸桿菌病是由大腸桿菌埃氏菌的某些致病性血清型菌株引起的疾病總稱，其是由一定血清型的致病性大腸桿菌及其毒素引起的一種腸道傳染病。一年四季均可發(fā)生，臨床癥狀及解剖特點(diǎn)以下痢為主要特征，排出黃棕色水樣稀糞。急性致死性感染病例一般1-2天死亡，亞急性1周左右死亡。治療上常采用螺旋霉素、多粘菌素Ε、慶大霉素、硫酸卡那霉素、恩諾沙星等肌肉注射，每天2-3次連續(xù)3-5天(以上三者交替應(yīng)用或合用效果更好)。
[0004]大多數(shù)革蘭氏陽性菌的致病物質(zhì)為外毒素，而大多數(shù)革蘭氏陰性菌的致病物質(zhì)為其內(nèi)毒素。在抗感染藥物中，抗生素占90%。其它抗真菌藥物、抗病毒藥物和抗寄生蟲病藥物僅占10%。然而，在抗生素的應(yīng)用中，大多數(shù)格蘭仕陽性菌對青霉素敏感，而革蘭氏陰性菌則大多對鏈霉素和氯霉素等敏感。因此，發(fā)現(xiàn)既能抑制革蘭氏陽性菌同時又能抑制革蘭氏陰性菌生長的抗菌物質(zhì)，將是廣譜抗菌藥物開發(fā)的重要目標(biāo)之一。
[0005]本世紀(jì)以來，隨著現(xiàn)代社會的日益發(fā)達(dá)，細(xì)菌感染的機(jī)會越來越大，受感人群活動越來越頻繁，造成大規(guī)模感染的幾率越來越大。因此也造成了抗生素的大量使用，甚至濫用。隨著多種抗生素耐藥性的出現(xiàn)、以及超級細(xì)菌的初現(xiàn)端倪，使得現(xiàn)有一線使用的抗生素面臨不能滿足臨床需要而全面崩潰的局面。這使得歐美發(fā)達(dá)國家投入巨資研發(fā)新的抗生素藥物。除了醫(yī)師自覺抵制濫用抗生素之外，確實(shí)還需要儲存一大批針對變異的耐藥株的抗菌藥物，以便在真正發(fā)生大規(guī)模耐藥菌株流行傳播時人們不至于束手無策、坐以待斃。然而，隨著醫(yī)院臨床耐藥菌的增多，以及研發(fā)出的抗生素毒性和副作用越來越大，使得人們不得不將眼光轉(zhuǎn)向廣譜、低毒、使用安全的“綠色抗生素”。不斷研發(fā)出新的植物和動物天然綠色抗生素，是十幾億人口的人口大國必須執(zhí)行的一個既定政策。
[0006]本研究團(tuán)隊(duì)以前從植物中發(fā)現(xiàn)許多對革蘭氏陽性菌和/或陰性菌有效的植物提取部位和有效成分，更加增添了我們研發(fā)新的“綠色抗生素”、發(fā)現(xiàn)新的抗菌天然藥物的信心。(趙昱等，具抗病毒、抗炎、和/或抗菌作用的六棱菊屬提取物及其用途，ZL200510077457.3 ；趙昱等，生姜中單萜苷類化合物及其抗菌用途和藥物組合物，CN101012255 ;蒲公英中的兩個黃酮苷及其抗格蘭氏陽性菌的醫(yī)藥用途，ZL200710067180.5 ;蒲公英中的木質(zhì)素及其抗菌活性和醫(yī)藥用途，ZL200710067458.9 ;黑紫橐吾中的含氯原子艾里莫芬烷及其抗菌和細(xì)胞毒活性，ZL200710067460.6 ;蒲公英中的倍半萜內(nèi)酯及其抗格蘭氏陽性菌的用途，ZL200710067776.5 ;黑紫橐吾素A及其抑制格蘭氏陽性菌的醫(yī)藥用途，ZL200710068539.0 ；蒲公英木質(zhì)素抑制格蘭氏陽性菌的制藥用途，ZL200810165728.4)
[0007]絡(luò)新婦蛛，Nephila, silk spider,屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)蛛型綱(Arachnida)絡(luò)新婦亞科絡(luò)新婦屬昆蟲，云貴高原廣泛分布。結(jié)大型金黃色網(wǎng)，網(wǎng)的直徑可達(dá)一公尺以上，以拉絲懸于樹間，生活在溫暖地區(qū)。約60種，云南省分布有3種。該屬蛛體色艷麗，雌成蛛個體較大、雄蛛小數(shù)倍。
[0008]蜘蛛入藥在我國早已有之。《唐本草》云:“主蛇毒，溫瘧，霍亂，止嘔逆”；《日華子本草》云:“冷，無毒；斑蜘蛛治瘧疾 ，疔腫”；《長沙藥解》云:“炒枯存性研細(xì)用；破瘀消腫”；《本草綱目》云:“主口，脫肛，疔腫，胡臭”;《吉林中草藥》云:“治瘰疬，疔瘡，蜂、蝎蜇傷”;《中藥大辭典》云:“祛風(fēng)，消腫，解毒。治狐疝偏墜，中風(fēng)口，小兒慢驚、口噤。疳積；疔腫，瘰疬，瘡瘍，蜈蚣、蜂、蝎蜇傷”。以上歷史記錄表明其體內(nèi)必應(yīng)具有某些特殊的物質(zhì)和其特有的作用機(jī)制。在對云貴高原的藥用昆蟲抗菌活性系列研究過程中，我們對蛛型綱絡(luò)新婦屬進(jìn)行了綜合采集、種屬鑒定和抑制革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌生長活性的藥效學(xué)研究。
[0009]根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，在針對藥物應(yīng)用方面，“蜘蛛”多為復(fù)方中的一味，公開資料中沒有蜘蛛作為單方應(yīng)用于防治細(xì)菌感染相關(guān)疾病的報(bào)導(dǎo)。1995年王仁學(xué)公開的“一種速效口瘡散”(申請?zhí)?4103402.X)，是由蜘蛛等5種藥材構(gòu)成，主治口腔性潰瘍，兼治一般疥瘡癬、丹毒等。2005年王化金的專利“一種治療皮膚潰爛和口腔潰瘍的藥液及加工工藝”(ZL02138994.2)，公開了由蜈蚣、蜘蛛、蜂王漿和酒精4種材料組成抗口腔潰瘍的藥液。2007年姚茂龍公開的“喉凈散配方及制作方法”(CN1895290A)，是由鍋底灰、蜘蛛等3種材料組成，主治白喉和扁桃體炎。2010年黃國登公開了“一種治療疔瘡的藥劑及其制備方法”(CN101953873A)，是由草蜘蛛、明礬、等5種材料組成的糊劑。2012年聞恪玉公開的“一種治療膿毒的藥物”(CN101632690A)，由蟾蜍、麝香、蝸牛、蜘蛛等7種藥材組成，主治扁桃體炎、慢性咽炎、過敏性鼻炎、口腔炎。顯然，蜘蛛作為單味藥單獨(dú)使用于抑制細(xì)菌生長的醫(yī)藥用途在開發(fā)新的抗菌藥物物質(zhì)基礎(chǔ)方面仍是空白，故而本發(fā)明專門針對蛛型綱絡(luò)新婦屬進(jìn)行抗菌活性研發(fā)尚屬首次且十分必要。
[0010]根據(jù)《中藥大辭典》，其基元是指園網(wǎng)蛛科大腹園網(wǎng)蛛等全蟲。動物分類學(xué)中，將此屬歸為圓蛛總科絡(luò)新婦亞科絡(luò)新婦屬，是云南省優(yōu)勢資源。為明確云貴高原藥源廣泛分布的絡(luò)新婦屬蜘蛛是否具有抗革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌活性，及其抗菌有效部位，指導(dǎo)進(jìn)一步弄清其中起主要藥理作用的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，從分子藥理學(xué)基礎(chǔ)上闡明絡(luò)新婦屬蜘蛛多種生物活性的作用機(jī)制，發(fā)明人對民間習(xí)用的絡(luò)新婦屬進(jìn)行了綜合采集和藥效學(xué)活性研究。本發(fā)明使用不同溶劑系統(tǒng)，測試了該生藥材的大孔樹脂提取物抑制革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌的藥理活性。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位既能抑制革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌)、又能抑制革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)生長。且具有較強(qiáng)的抑制活性，可以作為抗革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌天然藥物進(jìn)一步深入開發(fā)，從而構(gòu)成本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是提供了一種絡(luò)新婦屬蜘蛛具有抗菌活性的有效部位，其特征是:該有效部位是用溶劑提取經(jīng)粉碎或未粉碎的絡(luò)新婦屬蜘蛛蟲體、濃縮提取回收溶劑、大孔吸附樹脂柱層析、水洗、醇水溶液梯度洗脫方法純化；得到的抑制革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌活性有效部位經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥，粉碎而得產(chǎn)品。 [0012]本發(fā)明的又一目的是提供了一種制備絡(luò)新婦屬蜘蛛具有抗菌活性的有效部位的方法；具體而言，該有效部位通過以下方法獲得:
[0013]a)用溶劑提取經(jīng)粉碎或未粉碎的絡(luò)新婦屬蜘蛛蟲體，濃縮提取回收溶劑；其溶劑是指極性溶劑，即醇類、醇水混合溶液、丙酮、丙酮水混合溶液中的一種或多種；其中醇類是指甲醇、乙醇、乙二醇中的一種或多種；
[0014]b)將步驟a得到的濃縮液經(jīng)大孔吸附樹脂材料柱層析，水洗，然后用醇水溶液梯度洗脫；
[0015]c)將步驟b得到的洗脫液減壓濃縮至無醇味，減壓濃縮或冷凍干燥，粉碎得產(chǎn)品。其中:提取時間優(yōu)選1小時至72小時，提取次數(shù)優(yōu)選1-5次，每次用1-8倍量體積的溶劑；粉碎蟲體時溫度不超過25°C ;蜘蛛蟲體極性溶劑減壓濃縮時的溫度不超過100°C。
[0016]本發(fā)明的另一目的是提供了將絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位在制備抑制革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌感染的藥物中的用途。
[0017]本發(fā)明的再一目的是提供了一種以絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位在制備治療金黃色葡萄球菌感染所致的病癥如癤子、膿皰、毒性表皮腐解、肺炎、骨髓炎、急性心肌炎、乳腺炎、膀胱炎、前列腺炎、菌血癥、中毒性休克綜合癥、淋巴結(jié)炎、咽炎、子宮頸炎、盆腔炎，以及肌肉、皮膚、尿殖道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膿腫中的一種或多種以及對大腸桿菌感染所致的腸道炎癥或下痢藥物中的用途。
[0018]本發(fā)明的又一目的是提供了一種防治由革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌感染的藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位和可藥用輔料。其制劑形式包括水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、散劑、口服液、噴霧劑、沖劑、貼膜、注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、透皮吸收制劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑，及其控釋或緩釋劑型或納米制劑。
[0019]本發(fā)明的另一目的是提供了將絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位用于制備既能抗革蘭氏陽性菌又能抗革蘭氏陰性菌感染的廣譜抗菌藥物、日化用品、醫(yī)療器械、藥用輔料、外傷敷料或飼料添加劑的用途。
[0020]本發(fā)明中提供絡(luò)新婦屬蜘蛛抗菌活性有效部位的動物藥材可以選用絡(luò)新婦屬蜘蛛蟲體的任一部位，或它們的混合物?？梢允歉稍锶x，也可以是未經(jīng)干燥的全蟲或活體全蟲。
[0021]本發(fā)明中所述及的經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析精致純化得到的絡(luò)新婦屬蜘蛛抗菌活性有效部位可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，制備得到具有廣譜抗菌功效的水凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑、泡沫凝膠，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。
[0022]本發(fā)明的經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析精致純化得到的絡(luò)新婦屬蜘蛛抗菌活性有效部位及其制劑或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌抑制劑和/或其他治療類似革蘭氏陽性菌感染相關(guān)病癥的治療藥物及其原料藥如頭孢類、大環(huán)內(nèi)酯類、以及磺胺類如沙星等藥物品種聯(lián)合使用或交叉使用，制備得到具有抗病菌感染的組合物或復(fù)方制劑，可預(yù)期成為治療革蘭氏陽性菌感染疾病藥品、保健品、日化用品和醫(yī)療器械。上述各類藥物組合物或者藥品、保健品、日化用品和醫(yī)療器械可以采用片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、水凝膠、泡沫凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物，包括采用現(xiàn)已公認(rèn)的藥劑學(xué)常識常規(guī)制備而得的各種緩釋、控釋劑型或納米制劑。
[0023]本發(fā)明的經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析精致純化得到的絡(luò)新婦屬蜘蛛抗菌活性有效部位及其制劑或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的大腸桿菌抑制劑和/或其他治療類似革蘭氏陰性菌感染相關(guān)病癥的治療藥物及其原料藥如螺旋霉素、多粘菌素E、慶大霉素、硫酸卡那霉素、恩諾沙星等藥物品種聯(lián)合使用或交叉使用，制備得到具有抗病菌感染的組合物或復(fù)方制劑，可預(yù)期成為治療革蘭氏陰性菌感染疾病藥品、保健品、日化用品和醫(yī)療器械。上述各類藥物組合物或者藥品、保健品、日化用品和醫(yī)療器械可以采用片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、水凝膠、泡沫凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物，包括采用現(xiàn)已公 認(rèn)的藥劑學(xué)常識常規(guī)制備而得的各種緩釋、控釋劑型或納米制劑。
[0024]至今為止，以往文獻(xiàn)中并未發(fā)現(xiàn)有以此工藝對絡(luò)新婦屬蜘蛛進(jìn)行提取的文獻(xiàn)報(bào)道，本大孔樹脂提取法具有意想不到的新的效果。并且，迄今為止，中外文獻(xiàn)并無針對云南采集到的絡(luò)新婦屬蜘蛛進(jìn)行針對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌生長抑制活性研究的報(bào)道，本針對性的研究尚屬首次，絡(luò)新婦屬蜘蛛大孔樹脂提取物具有顯著的抑制革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌生長的活性也屬于意想不到的結(jié)果，因而可以預(yù)期進(jìn)一步開發(fā)成為治療革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌感染類疾病的藥物或藥物組合物。由此完成了本發(fā)明。
[0025]本發(fā)明的有益之處在于:首次用大孔樹脂分離材料制備出絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位，并首次發(fā)現(xiàn)了其在開發(fā)防治革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌感染藥物領(lǐng)域中的潛力，對于開發(fā)治療人及禽畜受金黃色葡萄球菌感染所致的病癥如癤子、膿皰、毒性表皮腐解、肺炎、骨髓炎、急性心肌炎、乳腺炎、膀胱炎、前列腺炎、菌血癥、中毒性休克綜合癥、淋巴結(jié)炎、咽炎、子宮頸炎、盆腔炎，以及肌肉、皮膚、尿殖道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膿腫中的一種或多種以及對人及禽畜受大腸桿菌感染所致病癥即腸道炎癥或下痢的藥物提供了新的蛛形類動物藥物之物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明再一特點(diǎn)是:該屬蜘蛛生長繁殖能力旺盛，在云貴高原廣泛分布，便于養(yǎng)殖，每頭雌蛛每年可以孵育600-800只子代，有利于成為穩(wěn)定的生物藥物資源，同時也有利于貧困山區(qū)農(nóng)民養(yǎng)殖此類藥源性動物達(dá)到脫貧目的。具有潛在的巨大社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。該藥物原料來源于天然養(yǎng)殖的蛛形綱動物，制備步驟簡便，綠色天然，成本低，污染小，利于大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施方案
[0026]為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面分別用該類絡(luò)新婦屬蜘蛛經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析精致純化過程，以及得到的絡(luò)新婦屬蜘蛛抗菌活性有效部位對金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸桿菌抑制作用的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明其在抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌研究領(lǐng)域中的新用途。本發(fā)明還用該活性提取物進(jìn)行了 ICR小鼠的口服灌胃急性毒性試驗(yàn)，說明該有效部位對動物的毒性，由此來反映在人體使用時的安全性。若無特別說明，本發(fā)明的百分比指的是重量百分比。必須說明，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0027]實(shí)施例1:用D-101大孔吸附樹脂富集斑絡(luò)新婦有效部位
[0028]1.1斑絡(luò)新婦醇提物的制備
[0029]新鮮捕捉到的斑絡(luò)新婦蜘蛛120頭(采自思茅地區(qū)，活體標(biāo)本由大理學(xué)院云南省藥用昆蟲及蛛形類資源利用開發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室楊自忠教授鑒定為斑絡(luò)新婦Nephila pilipesFabricius)，先浸入溫度為5°C的90%甲醇水溶液中半小時，取出在組織勻漿機(jī)下勻漿，蟲體勻漿以75%甲醇水溶液130毫升，于10°C下浸泡提取3次，每次4小時。過濾出提取液，合并提取液，在10°C下減壓濃縮至干，真空冷凍干燥，即得斑絡(luò)新婦甲醇水溶液提取物。
[0030]1.2D-101大孔吸附樹脂柱層析制備斑絡(luò)新婦提取物有效部位
[0031]斑絡(luò)新婦甲醇水`溶液提取物0.5克，用0.7克D-101大孔吸附樹脂吸附拌樣，上12克D-101大孔吸附樹脂柱(柱內(nèi)直徑10毫米，高度25毫米)，先用雙蒸水30毫升洗脫，續(xù)用30%乙醇-水溶液50毫升洗脫，續(xù)用80%乙醇-水溶液100毫升洗脫，取80%乙醇-水溶液洗脫液80毫升減壓濃縮至干，冷凍真空干燥，即得斑絡(luò)新婦提取物有效部位(NPE)26.8暈克。
[0032]實(shí)施例2:用AB-8大孔吸附樹脂富集棒絡(luò)新婦有效部位
[0033]2.1棒絡(luò)新婦乙醇水溶液提取物的制備
[0034]將捕捉到的棒絡(luò)新婦蜘蛛132頭(采自大理地區(qū)，活體標(biāo)本由大理學(xué)院云南省藥用昆蟲及蛛形類資源利用開發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室楊自忠教授鑒定為棒絡(luò)新婦Nephila clavataL.K°C h)，用沸水燙死，之后曬干，研缽磨粉，蟲體粉以70%乙醇水溶液50毫升，于75°C下加熱提取3次，每次1小時。過濾出提取液，合并提取液，在10°C下減壓濃縮至干，真空冷凍干燥，即得棒絡(luò)新婦乙醇水提取物。
[0035]2.2AB-8大孔吸附樹脂柱層析制備棒絡(luò)新婦提取物有效部位
[0036]棒絡(luò)新婦甲醇水溶液提取物0.5克，用1克AB-8大孔吸附樹脂吸附拌樣，上15克AB-8大孔吸附樹脂柱(柱內(nèi)直徑10毫米，高度25毫米)，先用雙蒸水50毫升洗脫，續(xù)用25%乙醇-水溶液50毫升洗脫，續(xù)用80%乙醇-水溶液100毫升洗脫，取80%乙醇-水溶液洗脫液70毫升減壓濃縮至干，冷凍真空干燥，即得棒絡(luò)新婦提取物有效部位(NCE)32.3暈克。
[0037]實(shí)施例3:斑絡(luò)新婦提取物有效部位樣品抑制格蘭氏陽性菌能力檢測[0038]3.1 原理:
[0039]采用“管碟法”研究試驗(yàn)藥物的體外抗菌活性，利用加在牛津杯中的試驗(yàn)藥物擴(kuò)散到接種有試驗(yàn)菌的培養(yǎng)基中，從而抑制細(xì)菌的生長。通過檢測在牛津杯周圍形成的抑菌圈的直徑大小來確定試驗(yàn)藥物的抗菌活性。
[0040]3.2 檢測菌:
[0041]金黃色葡萄球菌26003-23，購自中國藥品生物制品檢定所。
[0042]乙型溶血性鏈球菌32210，購自中國藥品生物制品檢定所。
[0043]3.3試驗(yàn)藥物及儀器:
[0044]3.3.1試驗(yàn)藥物
[0045]DMSO:DMS0 溶劑對照；
[0046]陽性對照藥物諾氟沙星:2.5毫克/毫升；
[0047]測試樣品來自實(shí)施例1中制得的80%乙醇-水溶液洗脫液凍干粉樣品(即斑絡(luò)新婦提取物有效部位(NPE));樣品用DMSO溶解并配置成2.5毫克/毫升。
[0048]3.3.2 儀器
[0049]CO2培養(yǎng)箱:美國Shellab公司產(chǎn)品；
[0050]XD-2倒置顯微鏡:重慶光電儀器有限公司產(chǎn)品；
[0051 ] 生物安全柜:美國LABC0NC0公司產(chǎn)品；
[0052]LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。
[0053]3.4方法與步驟:
[0054]3.4.1制備M-H瓊脂、M-H肉湯及試驗(yàn)菌液。
[0055]3.4.2雙碟的制備:
[0056](I)M-H瓊脂底層:取滅菌M-H瓊脂液體自然冷卻凝固。
[0057](2) M-H瓊脂菌層:取菌液150微升(ill)與30毫升(mL)的M-H瓊脂混勻。取約5mL含菌液瓊脂，均勻攤布在具有M-H瓊脂底層的平皿內(nèi)。
[0058]3.4.3待培養(yǎng)基凝固后，在每個平皿中均勻放立加滿試驗(yàn)藥液牛津杯。
[0059]3.4.4 置 37°C培養(yǎng) 24 小時。
[0060]3.4.5用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。
[0061]3.5 結(jié)果:
[0062]測試樣品及陽性對照藥物諾氟沙星抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表1。
[0063]表1.有效部位樣品及諾氟沙星對標(biāo)準(zhǔn)致病菌的抑菌圈直徑(毫米)
[0064]
【權(quán)利要求】
1.一種從絡(luò)新婦屬蜘蛛中提取的抗菌活性有效部位用于制備防治細(xì)菌感染性疾病的藥物用途，其特征是:所述活性有效部位是經(jīng)由大孔樹脂提取和醇水溶劑洗脫下來的部位；細(xì)菌是指革蘭氏陽性菌和/或革蘭氏陰性菌；所述藥物用途通過藥物制劑、醫(yī)療器械、日化用品形式體現(xiàn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物用途，其中細(xì)菌性感染性疾病是指革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球菌或乙型溶血性鏈球菌感染所致的病癥，或革蘭氏陰性菌中的大腸桿菌感染所致病癥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物用途，金黃色葡萄球菌感染所致的病癥是指癤子、膿皰、毒性表皮腐解、肺炎、骨髓炎、急性心肌炎、乳腺炎、膀胱炎、前列腺炎、菌血癥、中毒性休克綜合癥、淋巴結(jié)炎、咽炎、子宮頸炎、盆腔炎，以及肌肉、皮膚、尿殖道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膿腫中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物用途，乙型溶血性鏈球菌感染所致的病癥是指皮膚、呼吸道或軟組織感染引起的肺炎、菌血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、泌尿道炎癥或關(guān)節(jié)炎。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物用途，大腸桿菌感染所致病癥是指致病性大腸桿菌或其毒素引起的腸道炎癥或下痢。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物用途，其特征是:該用途是通過藥物制劑、醫(yī)療器械、日化用品形式得以體現(xiàn)；所述藥物制劑、醫(yī)療器械、日化產(chǎn)品的形式是水凝膠、泡沫凝膠、巴布劑、凍干粉、水劑、氣霧劑 、栓劑、膜劑、外用搽劑、軟膏劑。
7.一種制備權(quán)利要求1中所述抗菌活性有效部位的方法，其特征是所述有效部位由以下步驟制備得到:a)用極性溶劑提取經(jīng)粉碎或未粉碎的絡(luò)新婦屬蜘蛛蟲體，濃縮提取回收溶劑；其中極性溶劑是指醇類、醇水混合溶液、丙酮、丙酮水混合溶液中的一種或多種；其中醇類是指甲醇、乙醇、乙二醇中的一種或多種；b)將步驟a得到的濃縮液經(jīng)大孔吸附樹脂材料柱層析，水洗，然后用醇水溶液梯度洗脫；c)將步驟b得到的洗脫液減壓濃縮至無醇味，減壓濃縮或冷凍干燥，粉碎得產(chǎn)品。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征為:用極性溶劑提取經(jīng)粉碎的絡(luò)新婦屬蜘蛛蟲體，提取時間為1小時至72小時，提取次數(shù)為1-5次，每次用1-8倍量體積的溶劑；粉碎蟲體時溫度不超過25°C;減壓濃縮時的溫度不超過100°C;大孔吸附樹脂材料柱是指D-101大孔吸附樹脂或AB-8大孔吸附樹脂。
9.一種具有抗革蘭氏陽性菌感染和/或抗革蘭氏陰性菌感染的藥物組合物，其特征是:該藥物組合物含有治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的從絡(luò)新婦屬蜘蛛中提取的抗菌活性有效部位、藥用輔料、可藥用載體或外傷敷料。
10.一種具有抗革蘭氏陽性菌感染和/或抗革蘭氏陰性菌感染的飼料添加劑組合物，其特征是:該飼料添加劑組合物含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的從絡(luò)新婦屬蜘蛛中提取的抗菌活性有效部位。
【文檔編號】A61K35/64GK103638058SQ201310625286
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月1日
【發(fā)明者】陳俊雅, 李啟艷, 方春生, 巫秀美, 曹學(xué)信, 趙昱 申請人:大理學(xué)院