專利名稱：多傘阿魏氯仿提取物的制備方法及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多傘阿魏氯仿提取物的制備方法及其應用，屬于醫(yī)藥技術(shù)、應用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤。在我國，胃癌的發(fā)病率和病死率高居各種惡性腫瘤之首。據(jù)2000年資料統(tǒng)計，全球每年新發(fā)胃癌876000例，每年約有647000人因胃癌死亡。本病預后差，早期胃癌一般多無病狀，一旦出現(xiàn)已為中晚期，其術(shù)后5年生存率僅為20-30%，進展期胃癌的自然病程一般不到I年。因此，胃癌正在嚴重威脅到世界人民和中國人民的健康。中醫(yī)藥治療腫瘤，是中國在腫瘤治療領(lǐng)域的一大特色，研發(fā)中醫(yī)藥治療胃癌的藥物應該引起足夠重視，中醫(yī)藥在治療胃癌方面的巨大潛力有待挖掘。多傘阿魏(Ferula ferulaeoides (Steud.) Korov.)是新疆維吾爾族人民常用的重要藥材，為傘形科阿魏屬植物，僅分布于新疆古爾班通古特沙漠南緣地區(qū)的沙丘、沙地和礫石質(zhì)的蒿屬荒漠中，資源豐富，藥用部位為根和油膠樹脂。在新疆民間廣泛用作中藥阿魏的代用品，其揮發(fā)性成分是其主要活性成分，在治療蟲積、肉積、痞塊、心腹冷痛、瘧疾、痢疾等方面具有顯著的藥理活性，在臨床上用于治療心腹冷痛、慢性腸胃炎、胃潰瘍、風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。目前對多傘阿魏揮發(fā)性成分的研究報道主要涉及揮發(fā)油提取、化學成分分析、藥理作用(具體可參見文獻1:能元君，劉發(fā)，葉爾波等著《新疆三種阿魏對胃腸道作用的比較》，見新疆醫(yī)學院學報，1993年第16(4)期；及文獻2:葉爾波，劉發(fā)，能元君等著《新疆三種阿魏的抗炎與免疫抑制作用》 ，見西北藥學雜志，1993年第8(2)期，第72-76頁)及生藥方面研究。迄今未見多傘阿魏氯仿提取物的制備方法及多傘阿魏氯仿提取物在抗胃癌活性方面的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題就在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種多傘阿魏氯仿提取物的制備方法及其應用，本發(fā)明提供的多傘阿魏氯仿提取物質(zhì)量可控、穩(wěn)定，制備方法簡單，便于大生產(chǎn)和臨床使用。多傘阿魏氯仿提取物的應用，為臨床治療腫瘤提供了一種新的選擇，為今后繼續(xù)深入開展這一傳統(tǒng)維吾爾藥材多傘阿魏的研究和開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。為解決上述問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:本發(fā)明提供了一種多傘阿魏氯仿提取物的制備方法，包括下列步驟:取多傘阿魏藥材粉末過60目篩，加入4 8倍體積分數(shù)的氯仿，水浴鍋中回流提取3-4次，提取溫度為45 60°C,每次提取時間為30 45min,過濾,合并氯仿提取液,旋轉(zhuǎn)回收至少量，轉(zhuǎn)溶至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于真空干燥箱內(nèi)以45°C干燥72h，得多傘阿魏氯仿提取物。本發(fā)明同時提供了一種多傘阿魏氯仿提取物的應用，將多傘阿魏氯仿提取物用于抗胃癌。本發(fā)明提供的多傘阿魏氯仿提取物質(zhì)量可控、穩(wěn)定，制備方法簡單，便于大生產(chǎn)和臨床使用。為臨床治療腫瘤提供了一種新的選擇，為今后繼續(xù)深入開展這一傳統(tǒng)維吾爾藥材多傘阿魏的研究和開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。
具體實施例方式實施例1 多傘阿魏氯仿提取的制備以多傘阿魏 氯仿提取率和體外抑制胃癌細胞SGC-7901的抑制率為考察指標，對影響多傘阿魏氯仿提取效率的提取次數(shù)、提取時間、提取溫度、氯仿體積分數(shù)等四因素三水平1^9 (34)進行正交試驗，篩選多傘阿魏氯仿提取物的最佳提取工藝條件為:取多傘阿魏藥材 粉末過60目篩，加入4 8倍體積分數(shù)的氯仿，水浴鍋中回流提取3-4次，提取溫度為45 60°C，每次提取時間為30 45min，過濾，合并氯仿提取液，旋轉(zhuǎn)回收至少量，轉(zhuǎn)溶至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于真空干燥箱內(nèi)以45°C干燥72h，得多傘阿魏氯仿提取物。本發(fā)明制備的多傘阿魏氯仿提取物質(zhì)量可控、穩(wěn)定，制備方法簡單，便于大生產(chǎn)和臨床使用。實施例2 MTT法檢測多傘阿魏提取物對SGC-7901細胞增殖的抑制作用用0.25%胰蛋白酶消化SGC-7901細胞，用完全培養(yǎng)基配單細胞懸液，以每孔
0.4X104個接種于96孔板中，每孔100 μ L。培養(yǎng)24h，待細胞貼壁并進入對數(shù)生長期后饑餓細胞4h，并進行實驗干預。實驗分3組:陰性對照組(100 μ L RPMI1640+0.1%DMS0);陽性對照組；供試樣品處理組。其中，每組設(shè)5個復孔，于37°C、5%C02的飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h后中止實驗，取出96孔板，每孔加入IOyL MTT染色液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄上清，每孔加入IOOyL Formanzan,置搖床上低速振蕩10_30min,使結(jié)晶充分溶解。以上實驗重復3次。在酶聯(lián)免疫檢測儀570nm處測定吸光度(A)值，按下式求出生長抑制率(IR)，并求出半數(shù)抑制濃度(IC5tl)15細胞生長抑制率％ (IR) =(1-用藥組平均A值/陰性對照組平均A值)X 100%。MTT數(shù)據(jù)均采用x±s表示，采用SPSS10.0軟件包進行方差分析，以P彡0.05為有統(tǒng)計學差異。結(jié)果:多傘阿魏氯仿提取物在一定的的濃度范圍內(nèi)，對胃癌細胞SGC-7901細胞的生長具有明顯的抑制作用，與對照組比較差異顯著，且隨著藥物質(zhì)量濃度增加，細胞抑制率越高，呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性。多傘阿魏氯仿提取物作用24h的IC5tl是12.16 μ g/mL。實施例3 倒置顯微鏡觀察給藥后細胞形態(tài)變化選用對數(shù)生長期的胃癌細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化數(shù)分鐘后，加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，離心去除培養(yǎng)基，每種細胞株加入對應的培養(yǎng)基配制成IX IO5個/ml的細胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100μ 1，96孔培養(yǎng)板四周的孔加PBS，不接細胞，置于37°C、5%C02、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，使其貼壁。24小時后分別對每個細胞加入不同濃度多傘阿魏氯仿提取物，使終濃度為IC5tl，分別于24h，48h，72h，使用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化并拍照片。結(jié)果:胃癌細胞株陰性對照組細胞生長狀況良好，在鏡下觀察可見，透明度大、折光性強、細胞輪廓不清、形態(tài)較規(guī)則、貼壁性好。相反，給藥組胃癌細胞生長狀態(tài)不良，細胞折光性變?nèi)酢⑤喞鰪?、胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂質(zhì)和顆粒樣物、細胞之間空隙加大、細胞變得不規(guī)則、貼壁性不好，部分細胞成凋亡狀態(tài)，細胞變圓，細胞貼壁性變差，細胞膜發(fā)生皺縮、凹陷，并可見細胞凋亡小體。實施例4 流式細胞儀(FCM)分析癌細胞周期和凋亡分別接種胃癌細胞于6孔板和給藥于6孔板，收集上述處理后的包括貼壁和懸浮的細胞，用4°C預冷PBS洗滌細胞一次，用低溫離心機于4°C以轉(zhuǎn)速IOOOrPm離心IOminj^慢加入I ml-20°C預冷70%乙醇于4°C固定過夜，再用4°C預冷的PBS漂洗細胞兩次，用上述離心條件離心，加100 μ g/ml的PI染色劑150 μ I 0.4%tritonl50 μ 1，4°C避光染色30min,于30min內(nèi)用FCM進行細胞周期DNA含量分析，確定細胞周期分布。細胞周期和凋亡采用CellQuest及Motifit分析軟件分析。結(jié)果:多傘阿魏氯仿提取物樣品可顯著使胃癌細胞SGC-7901凋亡。流式細胞儀分析可知，多傘阿魏氯仿提取物作用后，GcZG1細胞數(shù)增加，S和G2/M期細胞數(shù)減少，細胞增殖指數(shù)降低，顯示多傘阿魏氯仿提取物作用后細胞分裂增殖被抑制在GcZG1-S期。通過流式細胞儀(FCM)分析胃癌細胞周期和凋亡，初步探索了此類化合物抑制胃腫瘤細胞增殖的初步機制。最后應說明的是:顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或 變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。
權(quán)利要求
1.一種多傘阿魏氯仿提取物的制備方法，其特征在于，包括下列步驟:取多傘阿魏藥材粉末過60目篩，加入4 8倍體積分數(shù)的氯仿，水浴鍋中回流提取3-4次，提取溫度為45 60°C,每次提取時間為30 45min,過濾,合并氯仿提取液,旋轉(zhuǎn)回收至少量，轉(zhuǎn)溶至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于真空干燥箱內(nèi)以45°C干燥72h，得多傘阿魏氯仿提取物。
2.—種多 傘阿魏氯仿提取物的應用，其特征在于:將多傘阿魏氯仿提取物用于抗胃癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多傘阿魏氯仿提取物的制備方法及其應用，包括下列步驟取多傘阿魏藥材粉末過60目篩，加入4～8倍體積分數(shù)的氯仿，水浴鍋中回流提取3-4次，提取溫度為45～60℃，每次提取時間為30～45min，過濾，合并氯仿提取液，旋轉(zhuǎn)回收至少量，轉(zhuǎn)溶至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于真空干燥箱內(nèi)以45℃干燥72h，得多傘阿魏氯仿提取物。其應用為將多傘阿魏氯仿提取物用于抗胃癌。本發(fā)明提供的多傘阿魏氯仿提取物質(zhì)量可控、穩(wěn)定，制備方法簡單，便于大生產(chǎn)和臨床使用。多傘阿魏氯仿提取物的應用，為臨床治療腫瘤提供了一種新的選擇，為今后繼續(xù)深入開展這一傳統(tǒng)維吾爾藥材多傘阿魏的研究和開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。
文檔編號A61K36/23GK103230424SQ20131017913
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月15日
發(fā)明者盛萍, 姚藍, 王颯, 詹羽姣 申請人:新疆醫(yī)科大學