牛膝活性提取物及其制備方法與用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛膝活性提取物，采用如下方法制備得到，步驟包括：（1）牛膝活性粗提物的制備將單味藥材懷牛膝飲片粉碎，水煮浸提，將浸提液用硫酸銨分級(jí)沉淀，將沉淀透析除鹽得到牛膝活性肽粗提物；（2）牛膝活性提取物的HPLC分離：使用C18制備柱進(jìn)行梯度洗脫。本發(fā)明牛膝活性提取物藥材來源單一，制備方法先進(jìn)，工藝合理，制劑成分明確，安全性高，藥理作用顯著，可用于研發(fā)治療周圍神經(jīng)損傷、腦血管意外（出血性中風(fēng)）、缺血性腦損傷（缺血性中風(fēng)）、腦創(chuàng)傷、視神經(jīng)損傷、脊髓損傷等中樞神經(jīng)損傷疾病、抗衰老、防治神經(jīng)退行性變疾病的藥物和保健品。
【專利說明】牛膝活性提取物及其制備方法與用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于天然藥物領(lǐng)域，具體涉及一種牛膝活性提取物及其用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展，人口老齡化、交通意外傷害、自然災(zāi)害、戰(zhàn)爭(zhēng)等因素，使得神 經(jīng)損傷及神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾病的發(fā)生率呈顯著上升趨勢(shì)，尋找促進(jìn)損傷神經(jīng)修復(fù)和再 生、預(yù)防和治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性變的有效藥物，是當(dāng)今醫(yī)藥研究中引人關(guān)注的課題。
[0003] 傳統(tǒng)藥物中的植物藥具有療效確切、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界的研 究興趣，具有開發(fā)利用的廣闊前景。一些植物藥在治療神經(jīng)損傷、神經(jīng)退行性疾病已有較 多的臨床報(bào)道，近年來也相繼從天然藥物中提取出具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)或神經(jīng)保護(hù)作用的有效成 分。目前，分離鑒定的肽類化合物大多為動(dòng)物來源，如胰島素、腦活素、生長(zhǎng)激素釋放抑制 素、多肽疫苗等，與生命活動(dòng)許多環(huán)節(jié)密切相關(guān)。從植物中分離鑒定出的生物活性多肽相對(duì) 較少，主要為植物寡肽、小肽、環(huán)肽、環(huán)肽生物堿、糖肽等，目前對(duì)一些重要寡肽的藥理學(xué)作 用研究方向主要包括抗腫瘤、抗AIDS病毒、抗菌、心血管活性和神經(jīng)活性等方面。隨著多肽 蛋白質(zhì)研究的不斷深入，多肽的生物活性日益受到重視，而隨著現(xiàn)代分離技術(shù)的不斷發(fā)展， 越來越多的植物多肽被分離鑒定，但迄今為止對(duì)于植物活性肽成分促神經(jīng)生長(zhǎng)、再生或發(fā) 揮神經(jīng)保護(hù)作用的研究還為數(shù)較少，在臨床上可有效促進(jìn)神經(jīng)再生修復(fù)、防治神經(jīng)退行性 變的植物來源的肽類新藥也不多見，尚不能滿足臨床患者的需要。
[0004] 牛膝紅rafliAes B1.)為覽科牛膝屬植物，常用其根入藥，味苦、甘、 酸，性平，歸肝、腎經(jīng)，能活血通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利水通淋、引火下行，可用于腰膝酸痛、 筋骨無力、肝陽眩暈等證。牛膝含多糖、皂苷、留酮、留醇、香豆素和生物堿等成分，另外還含 有少量揮發(fā)油、無機(jī)鹽和氨基酸(多肽或蛋白質(zhì))。目前對(duì)牛膝提取物在防治神經(jīng)損傷的研 究均為牛膝粗提物。申請(qǐng)?zhí)枮镃N200710019780. 4,發(fā)明名稱為"中藥牛膝提取物及制備方 法和用途"的中國(guó)專利公開了一種中藥牛膝提取物及制備方法和用途，包括將單味藥材懷 牛膝飲片，用〇?95 %乙醇水溶液提取1?3次，合并提取液，經(jīng)凝膠柱層析分離純化，洗脫 液經(jīng)冷凍干燥，得產(chǎn)品，可用于制備抗衰老、防治神經(jīng)退行性變疾病及治療腦中風(fēng)、視神經(jīng) 損傷、脊髓損傷、周圍神經(jīng)損傷等神經(jīng)損傷性疾病的藥物和保健品。文獻(xiàn)The protective effects of Achyranthes bidentata polypeptides in an experimental model of mouse sciatic nerve crush injury. (Yuan Y，Shen Η M，Yao J，[J]· Brain Research Bulletin， 2010,81 :25-32)公開將牛膝水提物經(jīng)硫酸銨沉淀，得到一種牛膝粗提物，發(fā)現(xiàn)對(duì)N-甲 基-D-天冬氨酸（NMDA)誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡以及受損的小鼠坐骨神經(jīng)具有保護(hù)作 用。然而上述研究采用的牛膝提取物僅使用了簡(jiǎn)單的提取步驟，成分復(fù)雜，雜質(zhì)多，具體是 哪類物質(zhì)發(fā)揮藥理活性不清楚，成為藥物的可能很小。
[0005]


【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明的目的在于提供一種雜質(zhì)少，藥理活性明確的可用于促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)，防治神經(jīng) 損傷以及防止神經(jīng)退行性變的牛膝活性提取物及其制備方法與用途。
[0006] 本發(fā)明具體技術(shù)方案如下： 一種牛膝活性提取物，其特征在于采用如下方法制備得到，步驟包括： (1) 牛膝活性粗提物的制備：具體的將單味藥材懷牛膝飲片粉碎，于80°c水煮浸提，浸 提液于4°C條件下加入硫酸銨鹽粉末至形成50%飽和度的硫酸銨鹽溶液，充分沉淀12 h后 于4°C、15000 rpm離心30 min,去除沉淀，收集上清液。上清液中再次加入硫酸銨粉末至形 成80%飽和度的硫酸銨鹽溶液，充分沉淀2 h后于4°C、15000 rpm離心30 min，去除上清， 收集沉淀。將沉淀用滅菌雙蒸水充分溶解，移至截留分子量為1000的透析袋中，4°C純水充 分透析，至透析袋內(nèi)、外液離子濃度達(dá)到平衡，收集透析袋內(nèi)的保留液進(jìn)行冷凍干燥，得到 牛膝活性粗提物凍干粉； (2) 牛膝活性提取物的HPLC分離：使用C18制備柱，流動(dòng)相A為含有0. 1% TFA的H20， 流動(dòng)相B為含有0. 1% TFA的CH3CN，梯度洗脫條件為：0 min :80%流動(dòng)相A，20%流動(dòng)相B ;30 min :47%流動(dòng)相A，53%流動(dòng)相B ;31 min :100%流動(dòng)相B，收集保留時(shí)間29. 0 min的組分。
[0007] 本發(fā)明還提供了上述牛膝活性提取物在制備治療周圍神經(jīng)損傷和腦血管意外、缺 血性腦損傷、腦創(chuàng)傷、視神經(jīng)損傷、脊髓損傷、中樞神經(jīng)損傷及抗衰老、防治神經(jīng)退行性變疾 病的藥物和保健品中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)： 本發(fā)明采用高效液相的方法對(duì)牛膝粗提物進(jìn)行分離，去除了大量的雜質(zhì)，提取物主要 成分為蛋白質(zhì)和肽類，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所述牛膝活性提取物具有促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)、防止神 經(jīng)元凋亡、促進(jìn)損傷的周圍神經(jīng)再生，防治中樞神經(jīng)損傷的作用，其藥材來源單一，制備方 法先進(jìn)，工藝合理，制劑成分明確，安全性高，藥理作用顯著，可用于研發(fā)治療周圍神經(jīng)損 傷、腦血管意外（出血性中風(fēng))、缺血性腦損傷(缺血性中風(fēng))、腦創(chuàng)傷、視神經(jīng)損傷、脊髓損傷 等中樞神經(jīng)損傷疾病、抗衰老、防治神經(jīng)退行性變疾病的藥物和保健品。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1為牛膝活性提取物HPLC液相色譜圖。
[0010] 圖2為牛膝活性提取物促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)突起生長(zhǎng)示意圖（A.陰性對(duì)照組，B.牛 膝活性提取物2 ng/ml組，C.牛膝活性提取物10 ng/ml組，D.牛膝活性提取物50 ng/ml 組，Ε· NGF 10 ng/ml 組）。
[0011] 圖3為牛膝活性提取物對(duì)背根神經(jīng)節(jié)突起生長(zhǎng)的作用。
[0012] 圖4為牛膝活性提取物對(duì)DRG神經(jīng)元GAP43和PSD95蛋白表達(dá)的影響。
[0013] 圖5為牛膝活性提取物對(duì)小鼠坐骨神經(jīng)夾傷后感覺功能恢復(fù)的作用。
[0014] 圖6為牛膝活性提取物對(duì)小鼠坐骨神經(jīng)夾傷后SFI恢復(fù)的作用。
[0015] 圖7為牛膝活性提取物對(duì)小鼠坐骨神經(jīng)夾傷后夾傷部位近、遠(yuǎn)端CMAP的影響。
[0016] 圖8為牛膝活性提取物對(duì)小鼠坐骨神經(jīng)夾傷后神經(jīng)再生的影響（A.正常側(cè)神 經(jīng)；B-F，術(shù)側(cè)神經(jīng)：B.生理鹽水組；C.牛膝活性提取物低劑量組；D.牛膝活性提取物中 劑量組；E.牛膝活性提取物高劑量組；F.彌可保組，bar=5 μ m。與生理鹽水組相比，* /?〈0· 05)。
[0017] 圖9為牛膝活性提取物對(duì)小鼠坐骨神經(jīng)夾傷后靶肌肉萎縮的影響（A.正常側(cè)肌 肉；B-F，術(shù)側(cè)肌肉：B.生理鹽水組；C.牛膝活性提取物低劑量組；D.牛膝活性提取物中 劑量組；E.牛膝活性提取物高劑量組；F.彌可保組，bar=20 μ m。與生理鹽水組相比，* P<Q. 05) 〇
[0018] 圖10為牛膝活性提取物對(duì)0GD損傷皮層神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響。
[0019] 圖11為牛膝活性提取物對(duì)0GD損傷皮層神經(jīng)元活力的影響。
[0020] 圖12為牛膝活性提取物對(duì)0⑶損傷皮層神經(jīng)元凋亡的影響。
[0021] 圖13為牛膝活性提取物對(duì)0GD損傷皮層神經(jīng)元cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的 影響。
[0022] 圖14為牛膝活性提取物對(duì)MCA0大鼠的腦保護(hù)作用。
[0023] 圖15為牛膝活性提取物對(duì)MCA0大鼠腦組織cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影 響。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不是用于限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明做各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書 所限定的范圍。
[0025] 實(shí)施例1牛膝活性提取物的制備 (1) 牛膝活性粗提物的制備：將單味藥材懷牛膝飲片粉碎，于80°c水煮浸提，浸提液于 4°C條件下加入硫酸銨鹽粉末至形成50%飽和度的硫酸銨鹽溶液，充分沉淀12 h后于4°C、 15000 rpm離心30 min,去除沉淀，收集上清液。上清液中再次加入硫酸銨粉末至形成80% 飽和度的硫酸銨鹽溶液，充分沉淀2 h后于4°C、15000 rpm離心30 min，去除上清，收集沉 淀。將沉淀用滅菌雙蒸水充分溶解，移至截留分子量為1000的透析袋中，4°C純水充分透 析，至透析袋內(nèi)、外液離子濃度達(dá)到平衡，收集透析袋內(nèi)的保留液進(jìn)行冷凍干燥，得到牛膝 活性粗提物凍干粉； (2) 牛膝活性提取物的HPLC分離：使用C18制備柱（XBridge Pr印C18 5 μπι， 10 X 150 mm)，流動(dòng)相Α為含有0. 1% TFA的Η20,流動(dòng)相Β為含有0. 1% TFA的CH3CN，梯度洗 脫條件為：〇 min :80%流動(dòng)相A, 20%流動(dòng)相B ;30 min :47%流動(dòng)相A, 53%流動(dòng)相B ;31 min : 100%流動(dòng)相B，收集保留時(shí)間29. 0 min的組分。
[0026] 實(shí)施例2牛膝活性提取物對(duì)新生1天的大鼠背根神經(jīng)節(jié)突起生長(zhǎng)的促進(jìn)作用 無菌條件下取新生1天的大鼠雙側(cè)背根神經(jīng)節(jié)，置于DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，解剖顯微鏡 下仔細(xì)剝?nèi)ド窠?jīng)根及神經(jīng)外膜，接種于預(yù)先用多聚賴氨酸包被的96孔培養(yǎng)板中，每孔1個(gè)， 加入100 μ 1含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后背根神經(jīng)節(jié) 貼壁，將培養(yǎng)基換成含有不同濃度牛膝活性提取物的neurobasal培養(yǎng)基(牛膝活性提取物 濃度分別為 2 ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml)，加入含有 10 ng/ml NGF 的 neurobasal 者為 陽性對(duì)照組，neurobasal為陰性對(duì)照組。
[0027] 培養(yǎng)24h，48h及72h后，分別采用生長(zhǎng)相關(guān)蛋白（growth associated protein 43，GAP43)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，熒光顯微鏡下觀察背根神經(jīng)節(jié)，采用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量并 分析突起生長(zhǎng)的情況，如圖2所示（A.陰性對(duì)照組，B.牛膝活性提取物2 ng/ml組，C.牛 膝活性提取物10 ng/ml組，D.牛膝活性提取物50 ng/ml組，E. NGF 10 ng/ml組)，結(jié)果 顯示，培養(yǎng)不同時(shí)間后，牛膝活性提取物能顯著促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)突起的生長(zhǎng)。
[0028] 對(duì)培養(yǎng)72 h的背根神經(jīng)節(jié)突起生長(zhǎng)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖3所示(與陰性對(duì)照 組相比，切〈0. 05)，結(jié)果表明牛膝活性提取物能顯著促進(jìn)新生1天的大鼠背根神經(jīng)節(jié)突起 生長(zhǎng)。
[0029] 實(shí)施例3牛膝活性提取物對(duì)新生1天的大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元生長(zhǎng)的促進(jìn)作用 無菌條件下取新生1天大鼠雙側(cè)背根神經(jīng)節(jié)，置于DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入0. 1 %膠 原酶和0. 125 %胰蛋白酶37°C消化30 min，加入含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基終止消化， 所得細(xì)胞用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2遍，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X 106,移入預(yù)先用多聚賴氨酸包 被的6孔培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后背根神經(jīng)節(jié)貼壁，將培養(yǎng)基換成含有不同濃度牛膝活性提 取物的neurobasal培養(yǎng)基(牛膝活性提取物濃度分別為2 ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml)， 加入含有10 ng/ml NGF的neurobasal者為陽性對(duì)照組，neurobasal為陰性對(duì)照組。
[0030] 牛膝活性提取物處理分離培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元24 h后終止培養(yǎng)，提取總蛋白并用 Bradford法測(cè)定總蛋白濃度，將蛋白上清溶于1XSDS上樣緩沖液，煮沸5 min，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，再將蛋白濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后，依次加入一抗（mouse anti GAP43 monoclonal antibody, 1:200; mouse anti monoclonal PSD95, 1:1000)及 二抗（HRP goat-anti-mouse IgG, 1:200; HRP-goat-anti-rabbit IgG, 1:200)，以GAPDH (1:200)作為內(nèi)參，最后用ECL法顯色，壓片、曝光、顯影，GS800 Calibrated Densitometer 掃描儀（BIO-RAD)進(jìn)行灰度掃描，PDQuest 7. 2. 0軟件分析結(jié)果如圖4所示(與陰性對(duì)照組 相比，切〈〇. 05)，結(jié)果表明10 ng/ml和50 ng/ml的牛膝活性提取物能顯著增加 DRG神經(jīng)元 生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43 (GAP43)和突觸后致密蛋白95 (PSD95)的表達(dá)量。
[0031] 實(shí)施例4牛膝活性提取物對(duì)坐骨神經(jīng)夾傷的小鼠神經(jīng)再生的促進(jìn)作用 ICR小鼠50只，雌雄各半，行坐骨神經(jīng)夾傷術(shù)：動(dòng)物以復(fù)合麻醉劑(賽拉嗪10 mg/kg，氯 胺酮95 mg/kg，乙酰丙嗪0. 7 mg/kg)腹腔注射麻醉。無菌條件下，左臀部作一 1 cm切口， 在距梨狀肌下緣0.3 cm處以一特制止血鉗，鉗夾坐骨神經(jīng)30秒，擠壓損傷的寬度為2 mm。 損傷遠(yuǎn)端以9-0顯微縫線在神經(jīng)外膜上作一標(biāo)記，縫合切口。術(shù)后隨機(jī)分為五組：牛膝活性 提取物高、中、低劑量組(劑量分別為10 mg/kg、5 mg/kg、2. 5 mg/kg)，彌可保組（0. 13 mg/ kg，按體表面積折算相當(dāng)于臨床人推薦劑量)，陰性對(duì)照組(給予生理鹽水)。每日腹腔注射 給藥，連續(xù)20天。術(shù)后每日行撤足反射實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)小鼠術(shù)側(cè)肢體感覺功能的恢復(fù)；術(shù)后第5、 10、15、20天行足跡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)小鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（sciatic function index, SFI)的 恢復(fù)；術(shù)后第21天行電生理學(xué)檢測(cè)，評(píng)價(jià)小鼠術(shù)側(cè)神經(jīng)近遠(yuǎn)側(cè)端復(fù)合肌動(dòng)作電位幅度的恢 復(fù)；并行組織形態(tài)學(xué)方法及電鏡檢查，觀察牛膝活性提取物對(duì)損傷側(cè)坐骨神經(jīng)再生和靶肌 肉萎縮的影響。
[0032] 術(shù)后每日行撤足反射實(shí)驗(yàn)，以帶有0. 1 mA的弱電流的兩個(gè)電極（間隔3 mm)刺激 小鼠術(shù)側(cè)足底，以小鼠腳掌回縮為感覺恢復(fù)的標(biāo)志，記錄每日感覺恢復(fù)的小鼠數(shù)量。結(jié)果顯 示，牛膝活性提取物能促進(jìn)小鼠感覺功能的恢復(fù)，高劑量牛膝活性提取物組第7天開始出 現(xiàn)小鼠術(shù)側(cè)感覺功能的恢復(fù)，至第10天已有70%的小鼠術(shù)側(cè)感覺功能恢復(fù)，如圖5所示。
[0033] 術(shù)后第5、10、1、15、20天分別行足跡實(shí)驗(yàn)。小鼠雙側(cè)后足蘸紅色印泥行走后每 側(cè)足留下8-10個(gè)足印，測(cè)量雙側(cè)足印長(zhǎng)度（print length, PL)和足趾寬度（toe spread, TS)，將上述四個(gè)變量代入Bain公式計(jì)算出坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（sciatic function index, SFI):SFI=-5L2 (EPL-NPL)/NPL+118.9 (ETS-NTS)/NTS-7.5。公式中各變量前 E 代表術(shù) 偵牝N代表健側(cè)。SFI以0為正常值，-100為神經(jīng)完全斷離的指標(biāo)。足跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，牛 膝活性提取物能促進(jìn)小鼠坐骨神經(jīng)功能的恢復(fù)。結(jié)果顯示，牛膝活性提取物能顯著促進(jìn)小 鼠坐骨神經(jīng)功能的恢復(fù)，如圖6所示(與生理鹽水組相比，*/?〈0. 05)。
[0034] 術(shù)后第21天，室溫條件下以肌電圖儀行電生理學(xué)檢測(cè)。在麻醉?xiàng)l件下鈍性分離 出小鼠損傷側(cè)和正常側(cè)坐骨神經(jīng)。將記錄電極插入腓腸肌內(nèi)，刺激電極分別置于損傷神 經(jīng)的近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)端，用超強(qiáng)刺激強(qiáng)度刺激數(shù)次，分別記錄近端和遠(yuǎn)端動(dòng)作電位幅度（CMAP， mV)。結(jié)果顯示，牛膝活性提取物能夠促進(jìn)小鼠損傷神經(jīng)遠(yuǎn)端CMAP的恢復(fù)，如圖7所示(與 正常側(cè)相比，# /X0. 05 ;與生理鹽水組相比，* /X0. 05)。
[0035] 術(shù)后21天，每組隨機(jī)取兩只小鼠，切取其夾傷遠(yuǎn)端神經(jīng)約3 mm，戊二醛固定， Epon812環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片定位，半薄切片，鈾-鉛復(fù)染，透射電鏡觀察。結(jié)果顯示，牛 膝活性提取物能顯著促進(jìn)損傷神經(jīng)的再生，增加再生有髓神經(jīng)纖維的髓鞘厚度和髓鞘板層 數(shù)目，如圖8所示（A.正常側(cè)神經(jīng)；B-F，術(shù)側(cè)神經(jīng)：B.生理鹽水組；C.牛膝活性提取物低 劑量組；D.牛膝活性提取物中劑量組；E.牛膝活性提取物高劑量組；F.彌可保組，bar=5 ym。與生理鹽水組相比，* /X0. 05)。
[0036] 術(shù)后21天，小鼠用4%多聚甲醛灌注固定，取雙側(cè)腓腸肌，石蠟包埋，橫切作HE染 色，利用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行肌細(xì)胞截面積測(cè)定。結(jié)果顯示，牛膝活性提取物能 顯著增加腓腸肌肌細(xì)胞截面積，有效防止神經(jīng)損傷后靶肌肉的萎縮，如圖9所示（A.正常 側(cè)肌肉；B-F，術(shù)側(cè)肌肉：B.生理鹽水組；C.牛膝活性提取物低劑量組；D.牛膝活性提取 物中劑量組；E.牛膝活性提取物高劑量組；F.彌可保組,bar=20 μ m。與生理鹽水組相比， * K0. 05)。
[0037] 實(shí)施例5牛膝活性提取物對(duì)原代培養(yǎng)的胚胎17天大鼠皮層神經(jīng)元缺血缺氧損傷 的保護(hù)作用 皮層神經(jīng)元的正常培養(yǎng)：取孕16-18天SD系大鼠的胚胎皮層組織，經(jīng)0. 25%胰蛋白酶 消化、吹打，制備皮層神經(jīng)元單細(xì)胞懸液，用DMEM高糖完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清）接種 于以L-多聚賴氨酸包被處理過的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，置于5% C02、飽和濕度、37°C培養(yǎng)箱 內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)4h至細(xì)胞貼壁后，換神經(jīng)元培養(yǎng)液（Neurobasal+2% B27)培養(yǎng)3 d，觀察神經(jīng) 元生長(zhǎng)狀況。換用阿糖胞苷培養(yǎng)液（終濃度2. 5 μ g/ml，換半液）培養(yǎng)3 d以抑制神經(jīng)膠 質(zhì)細(xì)胞及雜細(xì)胞生長(zhǎng)，獲得單純培養(yǎng)的原代神經(jīng)細(xì)胞。每隔3 d換全培養(yǎng)液1次，每次換半 液。經(jīng)神經(jīng)元免疫化學(xué)鑒定，皮層神經(jīng)元的純度達(dá)到90%以上。
[0038] 皮層神經(jīng)元氧糖剝奪（OGD)損傷處理： ① 吸出原來的培養(yǎng)基，用無糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞兩次，每次5分鐘； ② 各OGD損傷組均加入DMEM無糖培養(yǎng)基，置于Billups-Rothenberg厭氧培養(yǎng)小室中， 充以95% N2/ 5% C02 20 min并密閉作用6 h。光學(xué)顯微鏡下觀察培養(yǎng)的神經(jīng)元，如圖10 所示（X20)，正常的皮層神經(jīng)元胞體表面光潔，突起交織成網(wǎng)絡(luò)狀，胞體透亮，折光性明顯。 當(dāng)細(xì)胞在0GD條件下培養(yǎng)6 h后，可見部分細(xì)胞胞體逐漸減小，細(xì)胞突起淡化、減少或消失， 折光性下降，已有部分細(xì)胞死亡；牛膝活性提取物處理組（1. 〇 μ g/ml)和尼莫地平組（80 μ g/ml)與0GD損傷組相比，也有部分細(xì)胞突起回縮，但細(xì)胞胞體皺縮較少，貼壁較多，細(xì)胞 死亡數(shù)明顯減少。
[0039] 皮層神經(jīng)元的活力分析：每孔加入0· 5 mg/ml MTT溶液100 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)4 h ; 加20% SDS溶液100 μ 1 (助溶劑50%二甲基甲酰胺)，在37°C下放置20 h ;酶標(biāo)儀上570 rim波長(zhǎng)下測(cè)定每孔樣品的光密度（0D)值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果顯 示：〇GD損傷后6 h，皮層神經(jīng)元活力明顯下降(/7〈0.01);預(yù)先加入牛膝活性提取物，可有效 拮抗0GD損傷所引起的皮層神經(jīng)元活力的下降，在所觀察測(cè)量范圍內(nèi)，隨著牛膝活性提取 物劑量的增加，其保護(hù)作用越明顯，結(jié)果見圖11 (與正常對(duì)照組相比，# /K0.01 ;與0GD損 傷組相比，*/?〈〇· 05, **/?〈0· 01)。
[0040] TUNEL 染色： 細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗細(xì)胞三遍，按照TUNEL檢測(cè)試劑盒的說明染 色。于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照(激發(fā)波長(zhǎng)520±20 nm，發(fā)射波長(zhǎng)>620 nm)。每組設(shè) 3個(gè)復(fù)孔，每孔隨機(jī)選10個(gè)視野，每個(gè)視野細(xì)胞計(jì)數(shù)不少于100個(gè)，計(jì)算凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞 的百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果顯示：正常對(duì)照組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量很少，0⑶損傷6 h 后，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野細(xì)胞計(jì)數(shù)不少于100個(gè)，對(duì) 凋亡細(xì)胞的比率進(jìn)行計(jì)算。牛膝活性提取物組（1. 〇 μ g/ml)的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量與0GD 損傷組相比明顯減少，表明牛膝活性提取物可有效地保護(hù)0GD損傷所引起的皮層神經(jīng)元凋 亡，如圖12所示(與正常對(duì)照組相比，#/?〈0. 01 ;與0⑶損傷組相比，*/?〈0. 05，# /?〈0. 01)。
[0041] Western blotting 分析： ① 總蛋白提取及蛋白濃度測(cè)定：各組經(jīng)相應(yīng)處理后移去培養(yǎng)基，以預(yù)冷的〇. 01M PBS 漂洗一遍，移去PBS，加入細(xì)胞蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑提取總蛋白。采用BCA法測(cè)定總 蛋白濃度； ② SDS-PAGE和Western blot分析：將蛋白上清溶于2XSDS上樣緩沖液，煮沸5 min， 各取上清10 μ?進(jìn)行15% SDS-PAGE。采用半干轉(zhuǎn)移至PVDF膜90 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，室溫 下用25ml TBS/T漂洗5 min后，將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的TBS/T中，4°C包被過夜。 TBS/T 漂洗 5minX 3 次，米用 anti-cleaved caspase3 antibody (1 :1000)，一抗 4°C過夜。 TBS/T 漂洗 5 minX3 次，相應(yīng)二抗 IRDye 800 Conjugated Affinity Purified Donkey Anti-Rabbit IgG (1 :10000),室溫 1.5 h。TBS/T 漂洗 5 minX3 次。顯色后，Odyssey Infrared Imaging System (Rockland，USA)進(jìn)行灰度掃描，PDQuest7. 2.0 軟件分析結(jié)果。 以β-actin作為內(nèi)參，相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。結(jié)果顯不：0GD損傷后6 h，cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組相比明顯增強(qiáng)，而牛膝活性提取物預(yù)處理能顯著拮抗〇⑶損傷引起 的皮層神經(jīng)元cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的增強(qiáng)，并呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性，如圖13所 示（與正常對(duì)照組相比，#/?〈〇. 01 ;與0⑶損傷組相比，*/?〈〇. 05, #/?〈0. 01)。
[0042] 實(shí)施例6牛膝活性提取物對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞后再灌注的大鼠的腦保護(hù)作用 大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（MCA0)模型的制備：SD雄性大鼠，200±20 g，隨機(jī)分為假手術(shù) 組、MCA0組、牛膝活性提取物組和尼莫地平組。分別給牛膝活性提取物組和尼莫地平組大 鼠再灌注前靜脈注射牛膝活性提取物（0.2 mg/kg)和尼莫地平（1 mg /kg)，其他兩組注射 等容量0.9%氯化鈉注射液。MCA0模型制備如下：術(shù)前12小時(shí)禁食，自由進(jìn)水。10%水合氯 醛麻醉（5 ml/kg)。將大鼠置于鼠板上固定。頸部備皮，頸部正中切口，分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi) 動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，分離翼腭動(dòng)脈及入顱支。動(dòng)脈夾夾住頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈。頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心 端結(jié)扎，切斷。在頸外動(dòng)脈近心端，插入尼龍線(線上包被〇. 1%多聚賴氨酸，尼龍線插入長(zhǎng) 度20-22 mm，線直徑0.3 mm，酒精清潔后置生理鹽水備用)，尼龍線經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入入顱支， 感到有阻力時(shí)停止。將尼龍線固定好，打開動(dòng)脈夾。缺血2 h后拔出尼龍線，血液從頸總動(dòng) 脈通過頸內(nèi)動(dòng)脈入顱。再灌注24 h后，麻醉處死。
[0043] 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：術(shù)后24 h，進(jìn)行Longa評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分=無神經(jīng)損傷，1 分=左前肢伸展障礙，2分=向左打圈，3分=行走時(shí)向左側(cè)傾倒，4分=意識(shí)昏迷，5分=死 亡。
[0044] 腦梗死面積測(cè)定：斷頭取大腦，_20°C冷凍20 min后，行厚1. 5 mm的冠狀切片。 將腦片立即置于0.5%的TTC磷酸鹽緩沖液中，避光，37°C孵育20 min，正常腦組織染為 深紅色，腦梗死區(qū)不染色(灰白色)。腦梗死面積計(jì)算，[(Vc-Vl)/Vc] X100,其中Vc代表正 常側(cè)大腦半球體積，VI代表手術(shù)側(cè)大腦半球體積。結(jié)果顯示：SD大鼠 MCAO 2h，再灌注24 h后，對(duì)腦片進(jìn)行TTC染色發(fā)現(xiàn)手術(shù)側(cè)大腦半球出現(xiàn)明顯梗死灶，而牛膝活性提取物能夠明 顯減輕梗死灶體積，同時(shí)牛膝活性提取物組的大鼠死亡率與MCA0組相比明顯減少，術(shù)后行 為學(xué)評(píng)分與MCA0組相比也明顯下降，其保護(hù)作用接近于尼莫地平組，提示牛膝活性提取物 對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞后再灌注的大鼠具有一定的腦保護(hù)作用，如圖14所示（與MCA0組相比， */?〈0· 01)。
[0045] Western blotting 分析： ① 總蛋白提取及蛋白濃度測(cè)定：各組經(jīng)相應(yīng)處理后取腦組織，加入組織蛋白裂解液及 蛋白酶抑制劑提取總蛋白。采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度； ② SDS-PAGE和Western blot分析：將蛋白上清溶于2XSDS上樣緩沖液，煮沸5 min， 各取上清10 μ?進(jìn)行15% SDS-PAGE。采用半干轉(zhuǎn)移至PVDF膜90 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，室溫 下用25 ml TBS/T漂洗5 min后，將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的TBS/T中，4°C包被 過夜。TBS/T 漂洗 5 minX 3 次，米用 anti-cleaved caspase3 antibody (1 :1000)，一抗 4°C過夜。TBS/T 漂洗 5 minX3 次，相應(yīng)二抗 IRDye 800 Conjugated Affinity Purified Donkey Anti-Rabbit IgG(l :10000),室溫 1.5 tuTBS/T 漂洗 5minX3 次。顯色后，Odyssey Infrared Imaging System (Rockland，USA)進(jìn)行灰度掃描，PDQuest7. 2.0 軟件分析結(jié)果。 以β-actin作為內(nèi)參，相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。結(jié)果顯示MCA0 2 h再灌注24 h后，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組相比明顯增強(qiáng)，而牛膝活性提取物預(yù)處理能顯著拮抗 MCA0損傷引起的腦組織cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的增強(qiáng)，如圖15所示(與正常對(duì)照組 相比，#/7〈0.01;與]\?^0組相比，*/7〈0.01)。
【權(quán)利要求】
1. 一種牛膝活性提取物，其特征在于采用如下方法制備得到，步驟包括： (1) 牛膝活性粗提物的制備：將單味藥材懷牛膝飲片粉碎，水煮浸提，將浸提液用硫酸 銨分級(jí)沉淀，將沉淀透析除鹽得到牛膝活性肽粗提物； (2) 牛膝活性提取物的HPLC分離：使用C18制備柱，流動(dòng)相A為含有0. 1%TFA的H20， 流動(dòng)相B為含有0. 1% TFA的CH3CN，梯度洗脫條件為：0 min :80%流動(dòng)相A，20%流動(dòng)相B ; 30 min :47%流動(dòng)相A，53%流動(dòng)相B ;31 min :100%流動(dòng)相B，收集保留時(shí)間23. 35 min的組 分。
2. 如權(quán)利要求1所述牛膝活性提取物，其特征在于步驟（1)使用飽和度為50%和80% 的硫酸銨鹽溶液進(jìn)行分級(jí)沉淀。
3. 如權(quán)利要求1或2所述牛膝活性提取物在制備治療周圍神經(jīng)損傷和腦血管意外、缺 血性腦損傷、腦創(chuàng)傷、視神經(jīng)損傷、脊髓損傷、中樞神經(jīng)損傷及抗衰老、防治神經(jīng)退行性變疾 病的藥物和保健品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P39/06GK104083420SQ201310108655
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2013年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月1日
【發(fā)明者】丁斐, 顧曉松, 楊宇民, 袁穎, 姚登兵, 程瓊, 于舒, 湯欣 申請(qǐng)人:南通大學(xué)